王省超， 孫 穎, 王瑞英*, 王邦善

(1.新疆大學(xué)理化測(cè)試中心，新疆烏魯木齊 830046；2.新疆產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆烏魯木齊 830004；3.新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊 830046)

雪菊，學(xué)名為蛇目菊、雙色金雞菊，屬菊科金雞菊，具有清熱解毒、活血化瘀、和胃健脾之功效，對(duì)于治療失眠、頭痛、高血壓、高血脂、心血管等疾病有很好的療效[1 - 3]。綠原酸是植物在有氧呼吸過程中產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物，具有多種生物活性，在清熱解毒、抗菌消炎、抑菌和抗氧化等方面有良好功效[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸是雪菊中有效成分之一，然而，新疆雪菊中綠原酸含量及其提取工藝的研究鮮有報(bào)道[6]。

本文以新疆昆侖雪菊為研究對(duì)象，采用超聲法提取雪菊中的綠原酸，考察了甲醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間和料液比等單因素對(duì)新疆昆侖雪菊中綠原酸提取效果的影響，并設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，優(yōu)化出提取新疆昆侖雪菊中綠原酸的最佳工藝條件；同時(shí)，建立了高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定綠原酸的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100型高效液相色譜系統(tǒng)，附四元梯度泵，真空脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測(cè)器及Agilent化學(xué)工作站。KQ-500超聲波清洗器(500 W,40 kHz)，RT-205型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，Millpore超純水器(美國(guó)，Millpore公司)。

綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；甲醇為色譜純，冰乙酸為分析純，水為超純水。

雪菊購(gòu)于新疆烏魯木齊市濟(jì)康大藥房。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品的配制對(duì)照品溶液的配制：精密稱量綠原酸對(duì)照品適量，用色譜純甲醇溶解、定容至50 mL容量瓶中，配制成含綠原酸0.4320 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。供試品溶液的制備：精密稱取新疆昆侖雪菊粉末(過70目篩)1.0000 g，置于50 mL圓底燒瓶中，加入15 mL 60%甲醇溶液，超聲提取60 min，定容至50 mL容量瓶中，取上清液離心10 min，再經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，用于HPLC分析。

1.2.2HPLC條件色譜柱為Agilent TC-C18柱(150×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.5%冰乙酸水溶液(40∶60，V/V)；流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)326 nm，柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。對(duì)照品和供試品在該色譜條件的色譜圖如圖1所示。由圖可知，綠原酸在該色譜條件下可實(shí)現(xiàn)良好分離。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素適宜范圍的確定

精確稱取1.0000 g新疆昆侖雪菊粉末，超聲處理，以甲醇溶液為提取溶劑，定容至50 mL容量瓶中，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，按“1.2.2”中色譜條件進(jìn)樣分析，考察各單因素的影響結(jié)果。綜合考慮，選擇正交實(shí)驗(yàn)各單因素水平如下：40%、60%和80%甲醇提取劑，40、60、80 min超聲時(shí)間，300、400、500 W超聲功率及1∶20、1∶25和1∶30料液比。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

按上述單因素試驗(yàn)得出的試驗(yàn)條件，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)。選取甲醇濃度(A)、超聲時(shí)間(B)、超聲功率(C)和料液比(D)4個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取新疆昆侖雪菊中綠原酸工藝。由正交試驗(yàn)分析可知，4個(gè)因素對(duì)綠原酸的提取影響不完全相同，其影響因素大小為：超聲時(shí)間>料液比>超聲功率>溶劑濃度。由試驗(yàn)結(jié)果方差分析可知，B因素差異對(duì)綠原酸具有顯著性意義(p<0.05)，A、C、D因素差異無顯著性意義(p>0.05)。綜合以上分析，超聲提取法提取新疆雪菊中綠原酸最佳提取條件為：80%甲醇溶液，超聲時(shí)間為60 min，超聲功率為300 W，料液比為1∶25。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，按比例準(zhǔn)確稱取5份新疆昆侖雪菊，在最佳工藝條件下提取綠原酸，以“1.2.2”色譜條件測(cè)定其含量，綠原酸提取含量為9.9810 mg/g(RSD=1.15%，n=5)，與正交試驗(yàn)中最優(yōu)水平比較相近，說明該工藝條件穩(wěn)定、合理可行、可操作性強(qiáng)，達(dá)到工藝優(yōu)化目的。

2.3 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度及重現(xiàn)性

按“1.2.2”色譜條件，分別將對(duì)照品溶液依次進(jìn)樣1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0 μL，得出峰面積(Y)與綠原酸含量(X)的線性回歸方程為：Y=451.021X-9.805，相關(guān)系數(shù)r=0.99998(n=7)。結(jié)果表明，綠原酸在0.01728～0.1210 μg間呈良好線性關(guān)系。

按照“1.2.1”方法制備對(duì)照品溶液，并連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定綠原酸峰面積并計(jì)算其RSD。對(duì)照品RSD為0.72%(n=5)，表明本方法精密度良好。精密稱取5份1.0000 g新疆雪菊粉末，按“1.2.1”方法制備供試品溶液，并測(cè)定綠原酸峰面積，其RSD為0.41%(n=5)，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.4 回收率及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密稱取5份新疆昆侖雪菊粉末，分別加入一定體積、濃度為0.0864 μg/μL綠原酸對(duì)照品溶液，按“1.2.1”方法制備供試品溶液，并進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果表明綠原酸平均加標(biāo)回收率為108.16%，RSD為1.10%(n=5)。

取同一供試品溶液，在24 h內(nèi)，每隔2 h 按上述色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定綠原酸峰面積，其RSD為1.13%，表明供試品溶液中綠原酸在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本文對(duì)新疆昆侖雪菊中綠原酸超聲法提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，建立了簡(jiǎn)便、快速的高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了新疆昆侖雪菊中綠原酸含量。結(jié)果表明，經(jīng)優(yōu)化后的工藝能顯著提高綠原酸提取量；綠原酸在0.01728～0.1210 μg(r=0.99998)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加標(biāo)回收率為108.16%，其RSD為1.10%(n=5)，適合新疆昆侖雪菊中綠原酸測(cè)定。