蘇 晨， 吉邢虎， 何治柯

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

1 引言

基因工程技術(shù)作為現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)的核心而受到極大關(guān)注，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)[1]、環(huán)境[2]、能源[3]、醫(yī)藥衛(wèi)生[4]以及農(nóng)牧業(yè)[5]等領(lǐng)域。基因工程的關(guān)鍵技術(shù)是脫氧核糖核酸(DNA)的連接和重組，在此過(guò)程中一些酶起著至關(guān)重要的作用，這些酶統(tǒng)稱(chēng)為基因工程工具酶。工具酶種類(lèi)繁多、功能各異，主要包括限制酶、聚合酶、連接酶、修飾酶和核酸酶等。這些酶具有特異性的序列識(shí)別能力以及高效的生物催化活性，在一定的條件下可以對(duì)核酸分子進(jìn)行切割、連接、擴(kuò)增以及修飾等，同時(shí)工具酶的反應(yīng)條件溫和且具有出色的生物相容性[6]?；谶@些優(yōu)勢(shì)，工具酶被廣泛地應(yīng)用于核酸[7,8]、蛋白質(zhì)[9,10]和小分子[11,12]等生物活性分子的分析檢測(cè)。

生物分子比較復(fù)雜，待測(cè)物的含量很低，常規(guī)的檢測(cè)手段往往受到限制，因此，提高檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度，構(gòu)建基于信號(hào)放大技術(shù)的超靈敏檢測(cè)方法成為目前生化分析領(lǐng)域中越來(lái)越重要的研究方向。本文主要介紹幾種工具酶參與的信號(hào)放大技術(shù)及其在核酸、蛋白和小分子等生物活性分子檢測(cè)中的應(yīng)用。

2 工具酶在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用

核酸也稱(chēng)多聚核苷酸，它是由許多個(gè)核苷酸聚合而成的能夠自我復(fù)制的生物大分子。核酸作為遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)，在各種重大的生命活動(dòng)，如生長(zhǎng)、發(fā)育、遺傳及變異中起到了至關(guān)重要的作用。近年來(lái)，為了提高核酸檢測(cè)的靈敏度，構(gòu)建出大量新型工具酶參與的信號(hào)放大技術(shù)。高靈敏、特異性的核酸檢測(cè)方法不斷涌現(xiàn)，在傳染病診斷[13]、microRNA分析[14]、遺傳學(xué)研究[15]、法醫(yī)鑒定[16]和生物醫(yī)學(xué)研究[17]等領(lǐng)域中得到了飛速發(fā)展。

2.1 基于聚合酶的核酸檢測(cè)

傳統(tǒng)的聚合酶參與的信號(hào)放大技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)[18,19]，操作過(guò)程復(fù)雜，需依賴(lài)耐高溫的聚合酶和特殊溫度循環(huán)反應(yīng)器才能實(shí)現(xiàn)。相比熱循環(huán)放大技術(shù)，DNA在恒定溫度下聚合的等溫聚合放大反應(yīng)操作簡(jiǎn)便，不需要任何復(fù)雜設(shè)備，受到越來(lái)越多核酸研究者的青睞。目前，常用的等溫聚合放大技術(shù)有：滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling-circle Amplification，RCA)[20]、聚合酶觸發(fā)的鏈置換擴(kuò)增(Strand-displacement Amplification，SDA)[21]、解旋酶依賴(lài)擴(kuò)增(Helicase-dependent Amplification，HDA)[22]和環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated Isothermalamplification,LAMP)[23]等技術(shù)。

2.1.1滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)RCA是一種基于特殊DNA聚合酶的等溫信號(hào)放大技術(shù)。這類(lèi)特殊的聚合酶包含有phi29聚合酶、BstDNA聚合酶和Vent exo-DNA聚合酶，它們具有多重置換和連續(xù)合成的特性[24]。在該類(lèi)酶的作用下底物核酸生長(zhǎng)鏈以一段閉合環(huán)狀的DNA鏈作為模板，不斷復(fù)制延伸，擴(kuò)增出很長(zhǎng)的單鏈核苷酸(ssDNA)。該產(chǎn)物核酸鏈中含有的數(shù)百個(gè)重復(fù)序列可以進(jìn)一步作為信號(hào)載體，結(jié)合不同的檢測(cè)手段而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的作用。滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物最常用的檢測(cè)手段就是熒光檢測(cè)。滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)通常來(lái)自于熒光染料標(biāo)記的dNTP(圖1A)和熒光團(tuán)標(biāo)記的互補(bǔ)鏈(圖1B)。為了降低體系的背景熒光，分子信標(biāo)(圖1C)和DNA嵌入試劑(圖1D)也被廣泛地應(yīng)用于滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光傳感中。

除了熒光信號(hào)，一些可用肉眼觀察的比色信號(hào)也被引入到滾環(huán)擴(kuò)增的信號(hào)放大方法中。Yao等[25]研究發(fā)現(xiàn)，磁性納米顆?？梢耘c較長(zhǎng)的線性DNA鏈(如滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物)物理結(jié)合，并形成相互纏繞的肉眼可見(jiàn)的聚合體。模板探針與靶核酸鏈的部分區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)后，在連接酶和phi29聚合酶的作用下連接成一個(gè)環(huán)形的模板鏈，并發(fā)生滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后加入的磁性微球在穩(wěn)定磁場(chǎng)的誘導(dǎo)下發(fā)生聚集。在沒(méi)有滾環(huán)產(chǎn)物存在時(shí)，形成的聚集體在輕輕吹打下容易分散成懸浮液，而滾環(huán)產(chǎn)物與磁性納米顆粒形成的復(fù)合物能維持聚集體的形態(tài)，可在濾紙上產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)靶核酸鏈的可視化檢測(cè)。Wang等[26]利用金屬依賴(lài)催化活性脫氧核酶(Deoxyribozyme，DNAzyme)的探針切割反應(yīng)作為滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)信號(hào)，結(jié)合樹(shù)枝狀疊加的滾環(huán)反應(yīng)，構(gòu)建了一個(gè)超靈敏的核酸檢測(cè)方法。

2.1.2鏈置換擴(kuò)增SDA是一類(lèi)擁有鏈置換活性，且沒(méi)有外切酶活性的核酸聚合酶，以母鏈為模板延伸引物鏈，同時(shí)將下游舊鏈剝離，聚合酶與引物的反復(fù)延伸和替換，反應(yīng)不斷循環(huán)進(jìn)行，產(chǎn)生大量的DNA重復(fù)單元。通過(guò)引入熒光染料、雙標(biāo)記探針、電化學(xué)材料等信號(hào)載體，可實(shí)現(xiàn)靶核酸的高靈敏檢測(cè)。Guo等[27]使用雙標(biāo)記的熒光分子信標(biāo)作為信號(hào)載體，構(gòu)建了一個(gè)過(guò)程簡(jiǎn)單、通用性強(qiáng)的Klenow fragment exo-聚合酶觸發(fā)的鏈置換反應(yīng)核酸檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了靶核酸鏈高靈敏的熒光檢測(cè)，檢測(cè)限低至6.4 fmol/L。Fu等[28]設(shè)計(jì)了一個(gè)分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的DNAzyme，與模板鏈結(jié)合以后分子信標(biāo)被打開(kāi)，發(fā)卡結(jié)構(gòu)被破壞，無(wú)法催化H2O2和ABTS發(fā)生顯色反應(yīng)。如圖2所示，靶核酸鏈加入后，與模板鏈互補(bǔ)雜交并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)作用使分子信標(biāo)分離，恢復(fù)原來(lái)的結(jié)構(gòu)，從而恢復(fù)DNAzyme的催化能力，產(chǎn)生比色信號(hào)。在序列特定的引物和聚合酶存在時(shí)，聚合擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生，置換出靶核酸鏈進(jìn)入下一輪循環(huán)，使更多DNAzyme信標(biāo)從模板鏈上分離，恢復(fù)活性，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大。同樣，可將辣根過(guò)氧化物酶作為化學(xué)發(fā)光信號(hào)載體引入鏈置換放大技術(shù)。He等[29]提出了一個(gè)基于聚合酶觸發(fā)的鏈置換放大技術(shù)和功能化磁珠的多目標(biāo)同時(shí)檢測(cè)核酸的傳感器，利用引物修飾的磁珠和生物素標(biāo)記的DNA發(fā)卡形探針，在不改變靈敏度的情況下進(jìn)一步增強(qiáng)了該方法的通用性，有利于實(shí)現(xiàn)兩種靶核酸鏈的同時(shí)檢測(cè)。

2.1.3環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增Notomi等[30]首次提出的LAMP是一種快速、高特異性、超靈敏的核酸指數(shù)放大技術(shù)，該技術(shù)利用四條特異的引物鏈與靶核酸鏈的六個(gè)區(qū)域互補(bǔ)雜交，在具有很強(qiáng)鏈置換活性的聚合酶的作用下，實(shí)現(xiàn)等溫條件下核酸鏈擴(kuò)增。DNA雙鏈在溫度65 ℃附近處于復(fù)性和延長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)平衡狀態(tài)。不同于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，該放大技術(shù)對(duì)引物鏈的特異性有很高的要求，需要兩對(duì)引物鏈，分別是兩條內(nèi)部引物鏈(FIP及BIP)和兩條外部引物鏈(F3及B3)(圖3)。在擴(kuò)增過(guò)程中，內(nèi)部引物擴(kuò)增形成反應(yīng)物模板，外部引物通過(guò)擴(kuò)增置換分離內(nèi)部引物擴(kuò)增鏈。LAMP分為底物起始模板合成階段，循環(huán)復(fù)制反應(yīng)階段，以及延長(zhǎng)重新循環(huán)階段。內(nèi)部引物(FIP)以靶核酸鏈為模板擴(kuò)增出與其部分互補(bǔ)片段，同時(shí)，外部引物(F3)與靶核酸鏈結(jié)合觸發(fā)置換聚合反應(yīng)，使內(nèi)部引物擴(kuò)增鏈從靶核酸鏈上脫離，由于FIP5′端保留有部分序列(F1c)與擴(kuò)增出的核酸片段中的部分序列(F1)反向互補(bǔ)，這條內(nèi)部引物擴(kuò)增鏈于5′端自我堿基配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。當(dāng)此擴(kuò)增鏈與另外兩條引物(BIP和B3)退火雜交后，觸發(fā)聚合置換反應(yīng)，在內(nèi)引物BIP擴(kuò)增片段的一端也形成了一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，構(gòu)成啞鈴狀的結(jié)構(gòu)，即環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)物起始模板。如此循環(huán)往復(fù)，周而復(fù)始，在1 h內(nèi)就能擴(kuò)增出109靶核酸復(fù)制片段，最后的產(chǎn)物是大量結(jié)構(gòu)類(lèi)似花菜的核酸鏈。這些核酸鏈由若干具有反向交替重復(fù)序列的莖環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)成。

除了使用熒光標(biāo)記探針、嵌入染料等熒光信號(hào)載體，Goto等[31]將指示劑羥基萘酚藍(lán)(Hydroxy Naphthol Blue,HNB)應(yīng)用于環(huán)介導(dǎo)放大產(chǎn)物的比色檢測(cè)[31]。當(dāng)靶核酸鏈存在時(shí)，啟動(dòng)環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增反應(yīng)，溶液的顏色由紫色逐漸變成天藍(lán)色，通過(guò)引入96孔板作為擴(kuò)增反應(yīng)的載體，使基于HNB顯色的環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增反應(yīng)能夠應(yīng)用于多種核酸的同時(shí)檢測(cè)。為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增參與的高通量核酸檢測(cè)，Luo等[32]利用集成電極微流控芯片作為檢測(cè)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis，MTB)、流感嗜血桿菌(Haemophilus Influenza，HIN)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumonia，KPN)三種核酸鏈的同時(shí)檢測(cè)，檢出限可以低至28、17和16拷貝/微升。

2.2 基于核酸酶的核酸檢測(cè)

核酸酶是一類(lèi)對(duì)底物核酸具有切刻或者連續(xù)消化能力的蛋白酶，自20世紀(jì)60年代以來(lái)，它常作為一種模型蛋白被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的研究中。核酸酶的作用方式和底物特異性都隨著來(lái)源的不同而存在差異，根據(jù)核酸酶作用位置的不同，將其分為限制性?xún)?nèi)切酶和核酸外切酶兩種。

大多數(shù)限制性?xún)?nèi)切酶可以識(shí)別含有回文序列的雙鏈DNA，并對(duì)其兩條核酸鏈均進(jìn)行切割。同時(shí)，限制性核酸內(nèi)切酶中還有一類(lèi)特殊的酶稱(chēng)為切刻內(nèi)切酶(Nicking Endonuclease，NEase)，這類(lèi)酶只能在特定的酶切位點(diǎn)上對(duì)雙鏈DNA中的一條鏈進(jìn)行酶切水解作用，最終造成一個(gè)切口而不是切斷。利用切刻內(nèi)切酶的這個(gè)特殊性質(zhì)來(lái)切割信號(hào)探針并反復(fù)循環(huán)使用靶核酸鏈，可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的循環(huán)放大，已被廣泛地應(yīng)用于構(gòu)建核酸或其它相關(guān)靶分子的生物傳感器。Zou等[33]提出了一個(gè)串聯(lián)使用分叉DNA單鏈內(nèi)切酶(Flap Endonuclease)和NEase的核酸信號(hào)放大檢測(cè)方法(Cascade Enzymatic Signal Amplification,CESA)。傳感器設(shè)計(jì)原理如圖4所示，兩條探針鏈up和dp可以與靶核酸鏈T1雜交，由于探針dp設(shè)計(jì)的熔鏈溫度Tm與酶反應(yīng)的溫度一致，當(dāng)兩條探針與T1鏈的雜交序列發(fā)生重疊時(shí)，dp鏈的5′端的分叉鏈會(huì)被分叉DNA單鏈內(nèi)切酶割下，切割后的dp探針從T1鏈上脫離下來(lái)。up和T1的雜交鏈進(jìn)入第一步循環(huán)，獲得大量的dp鏈。被切割下來(lái)的分叉鏈與5′端磷酸化的鏈通過(guò)連接酶連接后，形成一個(gè)酶切位點(diǎn)，打開(kāi)分子信標(biāo)，并在切刻內(nèi)切酶的作用下對(duì)其進(jìn)行切割分離，啟動(dòng)新一輪的循環(huán)放大反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)檢出限為1 fmol/L的核酸超靈敏檢測(cè)。

核酸外切酶可以沿著核酸鏈末端依次水解作為核酸骨架的磷酸二酯鍵并生成單核苷酸。依據(jù)作用底物單雙鏈的區(qū)別，可將核酸外切酶分成兩類(lèi)，對(duì)單鏈具有特異性水解能力的核酸外切酶，如大腸桿菌核酸外切酶Ⅰ(exoⅠ)和核酸外切酶Ⅶ(exo Ⅶ)，以及能特異性水解雙鏈的核酸外切酶，如大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ(exo Ⅲ)和λ-噬菌體核酸外切酶(λ-exo)等。這些酶中還可以根據(jù)酶切起點(diǎn)的不同，分為從分子鏈的3′末端或5′末端開(kāi)始切斷的酶。核酸外切酶Ⅲ作用雙鏈DNA時(shí)，沿著3′→5′方向逐步催化去除單核苷酸，沒(méi)有特異性的結(jié)合位點(diǎn)，但是對(duì)雙鏈DNA的3′端突出末端和單鏈不發(fā)生水解作用。利用核酸外切酶Ⅲ特異性剪切水解互補(bǔ)3′端的這個(gè)特性，在目標(biāo)物存在時(shí)，可將信號(hào)分子如染料分子與其猝滅劑分離，恢復(fù)熒光信號(hào)。進(jìn)一步循環(huán)使用目標(biāo)物，可放大核酸信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度。隨著熒光分析的快速發(fā)展，大量猝滅劑被應(yīng)用到基于核酸外切酶Ⅲ的信號(hào)放大方法中，如猝滅基團(tuán)[34]、氧化石墨烯[35,36]、單壁碳納米管[37]、鈀納米線[38]等。除了使用猝滅回升的信號(hào)生成手段，Willner等[39]構(gòu)建了核酸外切酶Ⅲ參與量子點(diǎn)-染料熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET)信號(hào)放大方法。此外，比色信號(hào)[40]、化學(xué)發(fā)光信號(hào)[41]和電化學(xué)信號(hào)[42]等被引入核酸外切酶參與的信號(hào)放大檢測(cè)方法，很大程度上拓展了核酸外切酶的應(yīng)用范圍。值得一提的是，Lu等人[43]將核酸外切酶Ⅲ輔助的靶核酸循環(huán)放大技術(shù)與流式細(xì)胞儀微球相結(jié)合，構(gòu)建了一個(gè)快速、可再生的高通量多元核酸同時(shí)檢測(cè)平臺(tái)。相比傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀微球方法，靈敏度提高了58.6%。

根據(jù)核酸酶底物不同，可分為核糖核酸酶與脫氧核糖核酸酶。核糖核酸酶(RNase)是一類(lèi)具有水解RNA能力的核酸酶。例如RNase H是一種沒(méi)有序列特異性的酶，可以識(shí)別DNA和RNA組成的異源雙鏈核酸分子并特定地剪切RNA鏈[44]。利用這個(gè)特性，Goodrich等[45]構(gòu)建了一個(gè)基于RNase H和RNA微陣列的超靈敏核酸檢測(cè)平臺(tái)。如圖5所示，微陣列上的RNA序列可以特異性識(shí)別靶核酸DNA鏈并形成異源雙鏈核酸分子，在RNase H的催化作用下，RNA被水解成小碎片，釋放出的靶核酸鏈繼續(xù)與另一條RNA結(jié)合并導(dǎo)致其降解，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸鏈的循環(huán)放大。該平臺(tái)直接使用表面等離子體共振成像技術(shù)，對(duì)10 fmol/L濃度的DNA單鏈進(jìn)行定量。該方法不僅可對(duì)未純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，還可利用微陣列表面DNA-RNA異源雙鏈核酸分子的等溫吸附線，對(duì)反應(yīng)過(guò)程中RNase H的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。DNase I是一類(lèi)能夠非特異性水解單鏈或者雙鏈DNA的酶，水解產(chǎn)物可能是單個(gè)脫氧核苷酸，也可能是以單鏈或雙鏈結(jié)構(gòu)存在的寡脫氧核苷酸鏈。更重要的是，DNase I對(duì)DNA-RNA異源雙鏈核酸分子中的DNA單鏈有很強(qiáng)的水解能力，常常被應(yīng)用于RNA的分析檢測(cè)中。此外，氧化石墨烯對(duì)核酸鏈的非特異性吸附作用能保護(hù)核酸鏈不被DNase I降解，為基于DNase I的信號(hào)放大方法提供了條件[46]。

2.3 基于連接酶的核酸檢測(cè)

DNA連接酶(DNA Ligase)也可稱(chēng)為DNA黏合酶，主要起著連接DNA鏈的3′羥基末端和另一條DNA鏈的5′磷酸根末端的作用。連接酶最終通過(guò)磷酸二酯鍵將兩段相鄰的DNA鏈連接起來(lái)，形成一條完整的DNA鏈，從而在分子生物學(xué)領(lǐng)域起著特殊而關(guān)鍵的作用。自從1991年連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Ligasechain Reaction，LCR)[47]提出后，該方法展示出了出眾的信號(hào)放大能力和選擇性。相關(guān)生物傳感器的設(shè)計(jì)通常是利用兩條DNA探針和一條引物鏈雜交后，構(gòu)成具有一個(gè)切口的雙鏈結(jié)構(gòu)，然后啟動(dòng)連接酶連接切口。Yin等[48]使用靶核酸鏈作為引物鏈，納米金偶聯(lián)的DNA作為探針鏈，開(kāi)展核酸高靈敏檢測(cè)方法研究(圖6)。在靶核酸鏈輔助下，Ampligase DNA連接酶發(fā)生連接反應(yīng)，將兩個(gè)納米金連接起來(lái)，加熱變性后，靶核酸鏈游離出來(lái)，可以與另外兩條未連接的探針雜交，啟動(dòng)新的連接酶反應(yīng)。這個(gè)過(guò)程循環(huán)反復(fù)，靶核酸鏈模板被成倍放大，越來(lái)越多的納米金通過(guò)核酸鏈的連接作用而聚集在一起，發(fā)生顏色變化。基于DNA連接酶和納米金聚集的方法所產(chǎn)生的信號(hào)，不僅可以用紫外-可見(jiàn)吸收光譜法進(jìn)行檢測(cè)，還可以用動(dòng)態(tài)光散射的方法來(lái)檢測(cè)，其檢出限極低，分別為1.5 amol/L和0.1 amol/L。

除納米金作為探針和信號(hào)的載體[48,49]外，大量其他材料也可作為載體應(yīng)用于信號(hào)放大檢測(cè)技術(shù)。Chen等[50]將一條探針鏈與磁珠相連，另一條探針鏈修飾上生物素，通過(guò)連接酶的連接、磁珠的分離以及生物素-親和素的特異性作用，將辣根過(guò)氧化物酶連接在磁珠上，產(chǎn)生比色信號(hào)，檢出限為30 pmol/L。Zhu等[51]將兩條探針鏈分別修飾在量子點(diǎn)和磁珠上，利用T4連接酶和電化學(xué)信號(hào)，構(gòu)建了多目標(biāo)microRNA同時(shí)檢測(cè)的核酸傳感器[51]。

3 工具酶在蛋白質(zhì)及小分子檢測(cè)中的應(yīng)用

除了核酸，蛋白質(zhì)(如凝血酶)和小分子(如腺苷)等其他活性分子，在生物的各項(xiàng)生命活動(dòng)中也都起到了舉足輕重的作用。這些生物分子的快速靈敏檢測(cè)，對(duì)于了解其正常功能具有直接而現(xiàn)實(shí)的意義。

3.1 核酸適配子輔助的蛋白質(zhì)及小分子檢測(cè)

1990年，Tuerk和Gold利用SELEX技術(shù)成功篩選出了聚合酶的寡核苷酸，為其命名核酸適配體，從此開(kāi)啟了核酸適配體研究的新時(shí)代[52]。核酸適配體是一段能結(jié)合不同靶分子的DNA或者RNA序列，它們之間的這種結(jié)合能力具有高度特異性和親合力。利用核酸適配體作為轉(zhuǎn)換器，可以實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)與蛋白質(zhì)及小分子檢測(cè)之間輕松的轉(zhuǎn)換，從而將核酸工具酶參與的信號(hào)放大方法靈活地應(yīng)用到蛋白及小分子的檢測(cè)當(dāng)中。

與核酸檢測(cè)類(lèi)似，Yu等[53]將分子信標(biāo)上修飾有熒光基團(tuán)的莖延長(zhǎng)，組成一段血小板源生長(zhǎng)因子BB(PDGF-BB)的適配子序列。與靶蛋白PDGF-BB結(jié)合后，分子信標(biāo)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引物鏈結(jié)合上去，啟動(dòng)Klenow fragment exo-聚合酶的擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程中，在形成一條完全互補(bǔ)的DNA雙鏈的同時(shí)，改變了適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，靶蛋白脫離出來(lái)，進(jìn)入靶分子循環(huán)置換聚合反應(yīng)(Circular Common Target Molecule Displacement Polymerization，CCDP)，實(shí)現(xiàn)靶分子的放大檢測(cè)。為了進(jìn)一步降低體系的背景，獲得更高的靈敏度，Hu等[54]引入氧化石墨烯作為猝滅劑，實(shí)現(xiàn)γ-干擾素的高靈敏檢測(cè)，檢出限低至1.5 fmol/L。除了通過(guò)與靶分子結(jié)合后探針二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，暴露出引物鏈的結(jié)合序列，觸發(fā)酶的復(fù)制聚合反應(yīng)，還可以利用核酸適配子與靶分子的高親和性，競(jìng)爭(zhēng)出游離的引物鏈，在模板鏈和phi29聚合酶的作用下，啟動(dòng)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)靶分子的放大檢測(cè)(圖7A)。Chen等[20]利用這個(gè)策略，構(gòu)建了一個(gè)基于適配子和滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，以凝血酶作模板，檢出限為2 fmol/L。Huang等[55]利用類(lèi)似的方法結(jié)合電極上修飾的捕獲探針，將靶分子觸發(fā)擴(kuò)增出的滾環(huán)反應(yīng)產(chǎn)物捕獲，并作為電化學(xué)信號(hào)的載體，對(duì)赭曲霉素A的檢出限低至0.065 ppt。Yuan等[56]用環(huán)介導(dǎo)的等溫放大技術(shù)取代滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，構(gòu)建了赭曲霉素A電化學(xué)檢測(cè)方法。如圖7B所示，以核酸適配體作為環(huán)介導(dǎo)的等溫放大反應(yīng)的引物，靶分子與核酸適配子結(jié)合后從納米金修飾的電極上脫離，聚合擴(kuò)增反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行，用電信號(hào)變化的程度對(duì)靶分子進(jìn)行定量，檢出限為0.3 pmol/L。

切刻內(nèi)切酶參與的蛋白質(zhì)及小分子放大檢測(cè)的方法，通常是設(shè)計(jì)一段包含有特定核酸適配子序列的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，當(dāng)靶分子與適配子序列結(jié)合后，改變核酸發(fā)卡的二級(jí)結(jié)構(gòu)，暴露出的序列作為模板鏈與引物鏈雜交，形成具有酶切位點(diǎn)的雙鏈結(jié)構(gòu)，在切刻內(nèi)切酶的作用下，引物鏈被剪切形成一個(gè)切口。模板鏈與引物鏈分離，緊接著與另一條引物鏈結(jié)合，如此循環(huán)，產(chǎn)生大量帶有切口的引物鏈。通過(guò)設(shè)計(jì)帶有不同信號(hào)載體的引物鏈，構(gòu)建出產(chǎn)生不同信號(hào)的蛋白及小分子傳感器[57 - 59]。

3.2 無(wú)適配子輔助的蛋白質(zhì)及小分子檢測(cè)

除了核酸適配子的特異性結(jié)合作用，傳統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)也可與工具酶參與的信號(hào)放大技術(shù)結(jié)合，構(gòu)建蛋白質(zhì)的高靈敏檢測(cè)方法。Wu等[60]首次將滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)引入一個(gè)基于紙芯片的電化學(xué)發(fā)光體系，結(jié)合DNA功能化的碳點(diǎn)(Carbon Dots，CDs)，實(shí)現(xiàn)了蛋白的高靈敏度和選擇性檢測(cè)，如圖8所示。首先，在紙芯片的纖維素表面通過(guò)種子生長(zhǎng)法修飾一層納米金薄膜，再通過(guò)夾心免疫的方式捕獲靶蛋白分子—人免疫球蛋白(Human IgG，H-IgG)，當(dāng)二抗上標(biāo)記的納米金與引物鏈偶聯(lián)以后，在環(huán)狀模板鏈和Phi29 DNA聚合酶存在下啟動(dòng)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，復(fù)制并延長(zhǎng)引物鏈形成一條很長(zhǎng)的核酸單鏈，將大量DNA功能化的CDs通過(guò)互補(bǔ)雜交作用負(fù)載到滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物上，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，檢出限低至0.15 fmol/L。Liu等[61]利用端粒酶擴(kuò)增技術(shù)參與的夾心免疫方法，將巰基丙酸修飾的電極作為反應(yīng)的載體，生物素修飾的二抗和生物素修飾的引物鏈通過(guò)親和素的作用連接在一起。端粒酶的擴(kuò)增反應(yīng)將引物復(fù)制延長(zhǎng)，產(chǎn)生一條很長(zhǎng)的具有大量TTAGGG重復(fù)序列的核酸單鏈，在K+和卟啉鐵的輔助下，形成若干個(gè)具有高度催化活性的G四鏈體DNAzyme，產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。

有些蛋白質(zhì)和小分子因?yàn)榫哂刑厥獾纳飳W(xué)功能，可以利用這些特殊的能力結(jié)合工具酶參與的信號(hào)放大技術(shù)，構(gòu)建高靈敏檢測(cè)方法。最典型的就是對(duì)各種修飾酶的檢測(cè)。多聚核酸激酶(Polynucleotide Kinase，PNK)[62]是一種具有5′端激酶和3′端磷酸酶活性的蛋白酶，可以催化核酸鏈末端從5′-OH/3′-PO4轉(zhuǎn)換成5′-PO4/3′-OH。多聚核酸激酶在細(xì)胞活動(dòng)中的5′端磷酸化過(guò)程中扮演了重要的角色，與多種神經(jīng)疾病緊密相關(guān)。Zhang等[63]利用多聚核酸激酶具有的5′端磷酸化能力，結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，構(gòu)建了一個(gè)多聚核酸激酶的檢測(cè)方法。連接酶的催化作用除了需要5′端的磷酸基團(tuán)和3′端的羥基作為反應(yīng)底物外，還需要消耗ATP來(lái)供給能量。利用這個(gè)特點(diǎn)，Yang等[64]設(shè)計(jì)了兩條發(fā)卡核酸探針，伸出的莖端相互之間互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成一個(gè)具有兩個(gè)切口的啞鈴狀結(jié)構(gòu)，可以被核酸外切酶完全水解。只有在ATP存在的時(shí)候，T4連接酶將兩個(gè)切口連接起來(lái)，形成一個(gè)閉合結(jié)構(gòu)，阻礙核酸外切酶的水解作用。嵌入試劑插入啞鈴結(jié)構(gòu)的雙鏈部分產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的超靈敏檢測(cè)，檢出限為1.2 pmol/L。

4 工具酶組合的多重放大技術(shù)及應(yīng)用

為了獲得更高的檢測(cè)靈敏度，將多種信號(hào)放大技術(shù)結(jié)合起來(lái)使用是一種有效途徑?；谇锌虄?nèi)切酶與DNA聚合酶組合作用的等溫循環(huán)鏈置換放大技術(shù)，是近年來(lái)被廣泛使用的一種工具酶組合信號(hào)放大技術(shù)。該技術(shù)的基本原理是：通過(guò)堿基的互補(bǔ)配對(duì)雜交形成切刻內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)后，切刻內(nèi)切酶在該位點(diǎn)對(duì)其中的一條核酸鏈進(jìn)行切刻作用產(chǎn)生3′端為羥基的切口。聚合酶識(shí)別該切口的3′端，以未切割的序列為模板，沿著3′到5′的方向復(fù)制聚合置換被切割鏈的另一段序列，最后形成一條完整的雙鏈結(jié)構(gòu)。形成的雙鏈DNA再次被切刻內(nèi)切酶識(shí)別剪切，啟動(dòng)聚合酶反應(yīng)。如此“切刻-聚合-置換”的不斷循環(huán)，得到大量單鏈核酸結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)核酸鏈的擴(kuò)增與信號(hào)放大的目的。由于操作簡(jiǎn)單、擴(kuò)增效果顯著，切刻內(nèi)切酶與DNA聚合酶組合使用的多重放大技術(shù)受到很多生化分析科研工作者的青睞。利用該放大技術(shù)，Willner等[65]設(shè)計(jì)了一種基于切刻內(nèi)切酶和DNA聚合酶組合的DNA機(jī)器，并將其用于核酸的放大檢測(cè)。如圖9所示，目標(biāo)核酸鏈作為DNA機(jī)器的“運(yùn)轉(zhuǎn)軌道”，與引物結(jié)合后，作為模板鏈啟動(dòng)DNA聚合反應(yīng)，形成完整的雙鏈DNA。復(fù)制擴(kuò)增出的核酸鏈被切刻內(nèi)切酶剪切形成切口，在聚合酶的作用下從“運(yùn)轉(zhuǎn)軌道”上置換下來(lái)，結(jié)合有引物鏈的目標(biāo)核酸鏈，進(jìn)入“聚合-置換-切刻”的循環(huán)過(guò)程，利用DNA機(jī)器的運(yùn)轉(zhuǎn)，產(chǎn)生大量核酸單鏈，最終導(dǎo)致納米金的聚集產(chǎn)生比色信號(hào)，檢出限為0.1 pmol/L。

為進(jìn)一步提高生物分子檢測(cè)的靈敏度，Zhang等[66]提出了基于多重聚合延伸循環(huán)酶切的指數(shù)級(jí)信號(hào)放大技術(shù)。當(dāng)目標(biāo)核酸鏈作為引物鏈與模板鏈結(jié)合后，啟動(dòng)聚合酶反應(yīng)，聚合延伸產(chǎn)生切割位點(diǎn)。聚合產(chǎn)物鏈在切刻內(nèi)切酶作用下形成切口，切口的3′端繼續(xù)進(jìn)行延伸置換反應(yīng)，形成一重聚合延伸循環(huán)酶切反應(yīng)。置換下來(lái)的核酸鏈作為引物鏈與另一條模板鏈結(jié)合，觸發(fā)另一重聚合延伸循環(huán)酶切反應(yīng)。兩層循環(huán)反應(yīng)的疊加，大大提高了目標(biāo)核酸鏈檢測(cè)的靈敏度，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)核酸鏈的指數(shù)級(jí)信號(hào)放大。最后置換出的信號(hào)鏈以DNAzyme四鏈體的形式產(chǎn)生比色信號(hào)，檢出限為2.5 pmol/L。利用類(lèi)似的原理，Wang等[67]將基于多層聚合延伸循環(huán)酶切的指數(shù)級(jí)信號(hào)放大技術(shù)應(yīng)用到microRNA的檢測(cè)中，檢出限為0.1 amol/L。除了切刻內(nèi)切酶，其它剪切酶，如λ核酸外切酶(λ-exo)，也被引入聚合延伸循環(huán)酶切反應(yīng)中。λ核酸外切酶能特異性地水解雙鏈DNA磷酸化的5′端，而對(duì)單鏈DNA和未磷酸化的雙鏈DNA沒(méi)有作用。利用λ核酸外切酶的這個(gè)特性，Zhou等[68]設(shè)計(jì)了一個(gè)5′端磷酸化的DNA發(fā)卡形探針。以γ-干擾素為靶蛋白模型，與探針鏈上的核酸適配子區(qū)域特異性結(jié)合，打開(kāi)發(fā)卡，在引物鏈和聚合酶的作用下啟動(dòng)DNA聚合反應(yīng)。γ-干擾素被聚合延伸的引物鏈置換下來(lái)，進(jìn)入聚合置換靶分子循環(huán)系統(tǒng)。聚合產(chǎn)生的DNA雙鏈的磷酸化5′端觸發(fā)λ核酸外切酶的水解反應(yīng)。酶水解作用剩下的兩段序列，一段進(jìn)入雜交剪切鏈循環(huán)系統(tǒng)，另一段作為信號(hào)載體，以DNAzyme四鏈體的形式產(chǎn)生比色信號(hào)。在雙重循環(huán)放大系統(tǒng)的輔助下，實(shí)現(xiàn)γ-干擾素的可視化檢測(cè)，檢出限為50 pmol/L。

5 結(jié)論與展望

核酸工具酶具有催化能力高、序列識(shí)別能力強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和以及生物相容性好等優(yōu)勢(shì)，因而被廣泛地應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)和小分子等生物活性分子的分析檢測(cè)。由于檢測(cè)條件與待測(cè)物含量的限制，核酸工具酶參與的信號(hào)放大技術(shù)在生物分子的分析檢測(cè)中受到了廣泛關(guān)注。通過(guò)結(jié)合熒光、化學(xué)發(fā)光、比色和電化學(xué)分析等檢測(cè)手段，核酸工具酶參與的信號(hào)放大技術(shù)為生命科學(xué)的研究不斷提供新的思路和方法，逐漸成為生化分析領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)?？梢灶A(yù)見(jiàn)，核酸工具酶參與的信號(hào)放大技術(shù)必將在解決生化檢測(cè)中的實(shí)際問(wèn)題方面發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。