殷桂芳， 王 元， 房文紅*， 沈錦玉， 陳進(jìn)軍

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001)

噁喹酸(Oxolinic Acid，OA)是喹諾酮類的第二代廣譜殺菌藥，通過干擾細(xì)菌DNA螺旋酶從而影響細(xì)菌染色體超螺旋而達(dá)到殺菌作用[1]。噁喹酸是我國國家標(biāo)準(zhǔn)漁藥中的抗菌藥物之一[2]，廣泛用于防治魚類系統(tǒng)性細(xì)菌性疾病[3]，尤其是海水養(yǎng)殖動物弧菌病[4,5]。我國目前沒有規(guī)定養(yǎng)殖蝦中噁喹酸最高殘留限量(MRL)，僅規(guī)定了魚(肌肉和皮)的MRL為300 μg·kg-1[6]。歐盟畜禽獸醫(yī)殘留限量標(biāo)準(zhǔn)也僅是規(guī)定了魚(肌肉和皮)的MRL為100 μg·kg-1[7]，而日本肯定列表中規(guī)定了蝦產(chǎn)品中噁喹酸的MRL為30 μg·kg-1[8]。有關(guān)生物樣品中噁喹酸的測定方法己有報(bào)道[9 - 14]，但大多集中在魚類。

我國水產(chǎn)養(yǎng)殖動物種類繁多，不同水產(chǎn)動物采用同一種方法具有局限性。本研究優(yōu)化了檢測波長、流動相和生物樣品提取方法，建立了對蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺和鰓等組織中噁喹酸的反相高效液相色譜(RP-HPLC)測定方法，為對蝦藥代動力學(xué)研究和藥物殘留檢測奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2475熒光檢測器；Millipore Milli-Q Advantage超純水儀；Bertin precellys 240均質(zhì)器；Eppendorf微量移液器；Hitachi CF16RⅡ高速冷凍離心機(jī)；亞榮RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Rephile 0.22 μm微孔濾膜。

1.2 試劑和試驗(yàn)材料

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)為東海水產(chǎn)研究所海南瓊海研究中心室內(nèi)池養(yǎng)殖，海水鹽度33，水溫30 ℃±1 ℃，保持24 h充氣，投喂不含噁喹酸的對蝦全價(jià)飼料，無噁喹酸使用記錄。挑選健康、體長9.0±0.5 cm用于試驗(yàn)。

噁喹酸標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：準(zhǔn)確稱取0.0100 g噁喹酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)于50 mL燒杯中，加0.5 mol·L-1NaOH溶液200 μL溶解，甲醇定容至100 mL，濃度100 μg·mL-1，4 ℃保存。噁喹酸原粉(純度≥98.0%)購于濰坊三江醫(yī)藥集團(tuán)。甲醇、乙腈、四氫呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷和正己烷均為色譜純(德國Merck公司)；四丁基溴化銨、磷酸、甲酸和草酸均為分析純(國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)。

1.3 色譜條件

色譜柱為Aglient Zorbax SB-C18柱(150×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.01 mol·L-1四丁基溴化銨(磷酸調(diào)節(jié)pH為2.75)，流速1.0 mL·min-1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL，熒光檢測器λex=265 nm、λem=380 nm。為使藥峰和雜峰更好分開，分離不同組織樣品時(shí)流動相比例有所不同，血漿和肌肉的流動相比例為25∶75(V/V);肝胰腺和鰓的流動相比例為18∶82(V/V)。

1.4 樣品前處理

1.4.1血淋巴樣品取出樣品，于室溫融解后，1 000 r·min-1離心5 min，取0.2 mL上清液于1.5 mL離心管中，加入等體積乙腈，渦旋振蕩2 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液經(jīng)微孔濾膜過濾，濾液用于HPLC分析。

1.4.2肌肉、肝胰腺和鰓樣品樣品于室溫解凍后，取適量于均質(zhì)器中均質(zhì)。準(zhǔn)確稱取均質(zhì)后樣品(肌肉1.00 g、肝胰腺和鰓0.50 g)于10 mL離心管中，加入1 mL 0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)，旋渦振蕩器上振蕩2 min，加入5 mL乙腈，繼續(xù)振蕩5 min，于10 000 r·min-1離心5 min，收集上清液；殘?jiān)僦貜?fù)提取兩次，合并三次上清液于100 mL具塞茄形蒸發(fā)瓶中，于45 ℃旋蒸至近干；加入1 mL流動相和1 mL正己烷，超聲15 min，至瓶底殘留物完全溶解，將混合液體轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，12 000 r·min-1離心5 min，吸取下層液體，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液用于HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1檢測波長選擇合適的激發(fā)波長和發(fā)射波長，對熒光檢測的靈敏度和選擇性都很重要。實(shí)驗(yàn)比較了λex/λem=265/380 nm、λex/λem=312/369 nm和λex/λem=327/369 nm 3組檢測波長下的目標(biāo)物的峰寬、峰高和峰面積。結(jié)果表明采用λex/λem=265/380 nm時(shí)峰高和峰面積最大，在該組波長下峰形和靈敏度都得到了提高。

2.1.2流動相比較不同流動相條件下噁喹酸的色譜行為，5種流動相分別為乙腈∶四氫呋喃∶0.02 mol·L-1磷酸=16∶15∶69(V/V/V)[9]、乙腈∶0.01 mol·L-1草酸=35∶65(V/V)[12]、乙腈∶0.01 mol·L-1草酸∶甲醇=30∶60∶10(V/V)[11]、乙腈∶0.1%甲酸=60∶40[10]和乙腈∶0.01 mol·L-1四丁基溴化銨=25∶75(V/V)[15]，對文獻(xiàn)中的流動相比例做了適當(dāng)調(diào)整。比較1 μg·g-1濃度添加噁喹酸的對蝦肌肉樣品在5種流動相條件下的色譜行為，其峰寬、峰高和峰面積見表1。綜合考慮峰寬、峰高及雜峰干擾，最終確定檢測肌肉和血淋巴樣品的流動相為：乙腈∶0.01 mol·L-1四丁基溴化銨(磷酸調(diào)節(jié)pH為2.75)=25∶75(V/V)，保留時(shí)間為6.18 min(圖1A、B)；因肝胰腺和鰓樣品中內(nèi)源性物質(zhì)干擾，為使目標(biāo)峰和雜質(zhì)峰更好分開，將流動

表1 不同流動相下噁喹酸藥峰峰寬、峰高和峰面積(n=3)

相比例調(diào)整為18∶82(V/V)，保留時(shí)間在12.82 min(圖1C、D)。

2.2 提取液的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了不同提取液提取肌肉中噁喹酸的回收率(表2)，4種提取液分別為乙腈[12]、酸化乙腈(1%乙酸乙腈)[10]、乙酸乙酯[9,11]和二氯甲烷[13,14]。不同提取液對肌肉提取效果不同，乙腈提取效果最好，其次為酸化乙腈，再次為乙酸乙酯，二氯甲烷最差。二氯甲烷加入后，肌肉凝固變?yōu)檩^致密的一團(tuán)難以分散，阻礙了噁喹酸的提取，從而導(dǎo)致回收率最低。

表2 不同提取液提取肌肉中添加噁喹酸的回收率

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限

應(yīng)用優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，建立噁喹酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.002～10 μg·mL-1范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。檢測血漿和肌肉組織樣品采用的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=242.51x-5.03(R2=0.9996)，檢測肝胰腺和鰓組織樣品采用的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=209.52x-4.03(R2=0.9999)。對蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺和鰓加標(biāo)后噁喹酸定量限分別為0.02 μg·mL-1、0.01 μg·g-1、0.02 μg·g-1和0.02 μg·g-1。

2.4 回收率及精密度

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定對蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺和鰓中噁喹酸回收率，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，按“樣品前處理”方法處理，采用HPLC測定，測得各組織回收率結(jié)果如表3所示?？梢钥闯?，各組織的噁喹酸回收率都較高，均在80%以上；通過精密度試驗(yàn)，得出對蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺和鰓中的日內(nèi)精密度分別為：2.75%、1.60%、2.81%和4.02%，日間精密度分別為:2.91%、3.85%、4.73%和4.49%。

表3 噁喹酸在對蝦組織樣品中的回收率

3 結(jié)論

本文在考察檢測波長、流動相和提取方法的基礎(chǔ)上，建立了檢測對蝦組織樣品中噁喹酸殘留的反相高效液相色譜法。該方法操作簡單，無雜峰干擾，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性高，滿足藥物殘留檢測要求。