劉俊俊， 鄢愛平， 王曉芬， 郭 嵐， 萬益群*，

(1.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西南昌 330031；2.南昌大學(xué)分析測試中心，江西南昌 330047)

酪氨酸(Tyr)是20種用來合成蛋白質(zhì)的蛋白氨基酸之一，它屬于芳香族氨基酸，亦是人體的半必需氨基酸[1,2]。對(duì)羥苯基乳酸(PHPLA)、對(duì)羥苯基丙酸(PHPA)是Tyr的重要代謝產(chǎn)物，包含一系列的信號(hào)分子：神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)因素。這些物質(zhì)的分布和含量與人的行為、功能和病理狀態(tài)等密切相關(guān)[3]。研究表明，Tyr的代謝異常可導(dǎo)致多種氨基酸代謝疾病[4,5]、神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病[6]、惡性腫瘤[7,8]等。因此，對(duì)人體體液中Tyr及其代謝產(chǎn)物的研究，可在臨床方面為疾病，特別是腫瘤的早期診斷和病理學(xué)研究提供重要的參考依據(jù)。

目前，Tyr的研究較為深入，但其代謝產(chǎn)物的研究相對(duì)較少。分析方法主要有分光光度法[9]、液相色譜法[10 - 12]、毛細(xì)管電泳法[13]、氣相色譜法[14 - 16]等。離子色譜法(IC)因其靈敏度和分離效率高，且流動(dòng)相簡單、環(huán)保而備受關(guān)注。本文采用陰離子交換色譜-熒光檢測法(IEC-FLD)，系統(tǒng)地探討了Tyr、PHPLA和PHPA的分離分析條件，建立了人體血清中上述三種化合物同時(shí)分析新方法，為Tyr及其代謝產(chǎn)物的臨床研究提供了方法學(xué)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ICS-2500型離子色譜儀(美國，Dionex公司)，包括GP50四元梯度泵、LC25色譜柱箱、FLD-3000熒光檢測器和Chemeleon6.8色譜工作站；F-4500型熒光光度計(jì)(日本，日立公司)；Milli-QS超純水裝置(美國，Millipore公司)；AP210電子天平(美國，Ohaus公司)；MS2迷你振蕩器(廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司)；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

酪氨酸(Tyr,純度>99%)、對(duì)羥苯基丙酸(PHPA,純度>98%),購于美國Acros Orgnics公司；對(duì)羥苯基乳酸(PHPLA,純度>98%)購于美國Sigma公司；50% NaOH溶液(Sigma Aldrich)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)。

1.2 血清樣本的采集與處理

1.2.1血清樣本的采集早晨7～8時(shí)，抽取人體空腹時(shí)靜脈血5 mL(n=12，血樣分別來源于南昌九四醫(yī)院和北京大學(xué)深圳醫(yī)院)，置于采血管中，之后將所采血樣于常溫下3 000 r/min離心10 min，上層血清用于分析檢測。

1.2.2血清樣本前處理取血清500 μL于1.5 mL離心管中，加等體積的乙腈，之后于MS2迷你振蕩器以3 000 r/min轉(zhuǎn)速混勻1 min，室溫靜置10 min，再以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。取上清液，過0.22 μm水系濾膜后，進(jìn)樣分析。

1.3 色譜分析條件

色譜柱：IonPac AG21保護(hù)柱(50×2 mm)，IonPac AS21分析柱(250×2 mm)；柱溫：35 ℃；淋洗液：4 mmol/L NaOH；流速：0.45 mL/min；進(jìn)樣體積：25 μL。熒光分析條件：激發(fā)波長277 nm，發(fā)射波長340 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離條件的選擇

本文分別考察了AS18陰離子交換柱(IonPac AS18)與AS21陰離子交換柱(IonPac AS21)對(duì)目標(biāo)物的分離情況。采用IonPac AS18分離柱，流動(dòng)相為30 mmol/L NaOH溶液，三種物質(zhì)分離良好，保留時(shí)間在20 min之內(nèi)，但分析物熒光響應(yīng)信號(hào)較弱；IonPac AS21分離柱較IonPac AS18分離柱對(duì)各物質(zhì)的保留能力弱，NaOH溶液濃度為4 mmol/L時(shí)，各物質(zhì)已完全分離，且熒光信號(hào)增強(qiáng)，因?yàn)槿N物質(zhì)對(duì)pH值的變化比較敏感，pH值增大，物質(zhì)的熒光響應(yīng)降低，如圖1所示。因此，本文選擇IonPac AS21分離柱、4 mmol/L NaOH溶液對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離。同時(shí)考察了淋洗液流速對(duì)目標(biāo)物分離效果的影響。結(jié)果表明，流速增大，物質(zhì)的出峰時(shí)間縮短，且信號(hào)響應(yīng)也相應(yīng)增強(qiáng)，在柱壓允許范圍內(nèi)，本文選定流速為0.45 mL/min，三種分析物在20 min內(nèi)完全分離。在優(yōu)化條件下，Tyr、PHPLA和PHPA色譜分離圖見圖2。

2.2 熒光波長的選擇

配制Tyr、PHPLA和PHPA濃度均為1.0 mg/L溶液，在熒光光度計(jì)上對(duì)各物質(zhì)的激發(fā)和發(fā)射光譜進(jìn)行掃描，得到各物質(zhì)的最大激發(fā)和最大發(fā)射波長分別為λex=277 nm、λem=306 nm。但因?yàn)樵摷ぐl(fā)和發(fā)射波長比較接近，Raleigh散射現(xiàn)象較為嚴(yán)重，使得離子色譜中噪音較高，靈敏度降低。若增大發(fā)射波長，可以降低噪音，但物質(zhì)的熒光強(qiáng)度減弱，檢出限也發(fā)生了相應(yīng)變化。實(shí)驗(yàn)中固定激發(fā)波長λex=277 nm，對(duì)不同發(fā)射波長(λem)條件下各物質(zhì)的檢出限做了比較，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，當(dāng)λex=277 nm、λem=340 nm的條件下各物質(zhì)的檢出限相對(duì)較低。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

人血清中含有大量蛋白質(zhì)，如果直接進(jìn)樣分析會(huì)影響色譜柱柱效及其壽命[17]，故去除血清中的蛋白質(zhì)很有必要。本文分別考察了甲醇和乙腈沉降蛋白的效果。結(jié)果表明：以甲醇為沉淀劑，沉降蛋白效果較差；以乙腈為沉淀劑，蛋白質(zhì)除去較為完全，滿足實(shí)驗(yàn)要求。因此本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈為血清蛋白沉淀劑。

2.4 干擾實(shí)驗(yàn)

2.5 線性方程、線性范圍和檢出限

配制一系列不同濃度的Tyr及其代謝產(chǎn)物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在已優(yōu)化的色譜分析條件下，以峰面積(A)對(duì)濃度(c)進(jìn)行線性擬合，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，Tyr、PHPLA和PHPA分別在0.30～25 mg/L、0.025～2 mg/L和0.025～2 mg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，測得三種物質(zhì)的檢出限(以S/N=3計(jì))分別為0.024 mg/L、0.020 mg/L、0.019 mg/L。

表1 酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.6 回收率和精密度

為了考察方法的準(zhǔn)確度及精密度，在乳腺癌患者血清樣品中添加了3個(gè)不同水平的Tyr、PHPLA和PHPA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加入回收試驗(yàn)，每個(gè)水平平行測定6次，結(jié)果見表2。三種物質(zhì)的加標(biāo)回收率在72.6%～99.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.27%～6.62%之間，表明該方法準(zhǔn)確可靠，可滿足實(shí)際樣品的測定要求。

表2 血清樣品加標(biāo)回收結(jié)果(n=6)

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2.7 樣品測定

應(yīng)用所建立的分析方法，對(duì)健康人血清(1號(hào))、腦梗死合并肺部感染患者血清(2～4號(hào))、重度營養(yǎng)不良患者血清(5號(hào))、乳腺癌患者血清(6～12號(hào))進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，在腦梗死患者及部分乳腺癌患者血清中檢測到PHPLA，圖4為9號(hào)血樣以及血樣加標(biāo)的色譜圖。

表3 人體血清中酪氨酸及其代謝產(chǎn)物分析結(jié)果(n=3)

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3 結(jié)論

本文應(yīng)用離子色譜-熒光檢測技術(shù)，建立了人體血清中酪氨酸及其代謝產(chǎn)物同時(shí)分析新方法。該方法色譜流動(dòng)相組成相對(duì)簡單、環(huán)保，且樣品前處理簡便。通過樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，證明所建立的方法能夠滿足實(shí)際血清樣品檢測需求，可為酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的臨床應(yīng)用研究提供方法學(xué)參考。