孫溢華，張春莉，施定基，賈曉會(huì)，賈睿，何培民

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光質(zhì)對工程聚球藻7002生長及psbA啟動(dòng)子的調(diào)控

孫溢華1，張春莉2，施定基3，賈曉會(huì)1，賈睿1，何培民1

1 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306 2 Department of Molecular Membrane Biology, Max Planck Institute of Biophysics, Max-von-Laue-Str.3, D-60438 Frankfurt am Main, Germany 3 中國科學(xué)院植物研究所，北京 100093

工程聚球藻的基因及其所用載體的啟動(dòng)子PpsbA均受光質(zhì)調(diào)控，利用該機(jī)制可通過光質(zhì)調(diào)控提高聚球藻的光合效率及其外源基因表達(dá)率。以轉(zhuǎn)基因聚球藻7002為實(shí)驗(yàn)材料，通過優(yōu)化光強(qiáng)、溫度及pH，解除光限制因素并提高光能利用率。通過改變白光、紅光及藍(lán)光的比例，調(diào)控光質(zhì)組成及單色光的光強(qiáng)，檢測細(xì)胞生長、外源基因的表達(dá)及基因的轉(zhuǎn)錄。研究結(jié)果表明：高比例藍(lán)光下，基因的表達(dá)率達(dá)到2.4%，是純白光下的3倍，重組蛋白VP28的積累量提高至2倍。高比例紅光抑制了基因及外源基因的表達(dá)，但促使生物量在3 d內(nèi)突破1.5 g/L。本研究為藍(lán)藻的生物制藥和工程藍(lán)藻代謝產(chǎn)物的產(chǎn)業(yè)化提供了理論基礎(chǔ)。

光生物反應(yīng)器，聚球藻7002，psbA啟動(dòng)子，VP28，光質(zhì)調(diào)控，psbA

隨著藍(lán)藻的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，光質(zhì)調(diào)控已成為提高生物量及目的產(chǎn)物表達(dá)的重要途徑[1-3]，轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的光調(diào)控機(jī)制逐步被揭示[4]。光質(zhì)是光源所包含的所有單色光的光強(qiáng)及波長的總稱，直接影響藻細(xì)胞的光合作用及代謝途徑。聚球藻光系統(tǒng)Ⅱ的捕光天線主要受基因的調(diào)控[5]，基因?qū)赓|(zhì)具有較敏感的響應(yīng)機(jī)制[6]。同時(shí)，工程藍(lán)藻常用的載體啟動(dòng)子PpsbA[7]與藍(lán)藻的基因同源[8]，藍(lán)光與紅光分別誘導(dǎo)的信號通路可同時(shí)調(diào)節(jié)藍(lán)藻本身的基因及其載體啟動(dòng)子PpsbA[9]。然而，相對于野生藍(lán)藻，轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻的最適光合條件已有顯著改變[10]，若要研究光質(zhì)對于基因及PpsbA的調(diào)控，必須先排除光合作用的干擾因素 (總光強(qiáng)、溫度與pH)，以達(dá)到最大光合效率。

新型光生物反應(yīng)器 (SDJ，上海聯(lián)環(huán)生物工程設(shè)備有限公司) 可對總光強(qiáng)、溫度、pH、光質(zhì)進(jìn)行精確調(diào)控，能夠使藻細(xì)胞達(dá)到最大光合效率，是工程藍(lán)藻研究及產(chǎn)業(yè)化探索的重要工具。光生物反應(yīng)器配備的LED光源可提供穩(wěn)定的光質(zhì) (紅光615–630 nm，藍(lán)光440–475 nm)，已普遍應(yīng)用于微藻培養(yǎng)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，相同LED光質(zhì)對于不同藻種的影響顯示出差異，例如藍(lán)光促進(jìn)擬綠球藻sp. 細(xì)胞增殖[12]，卻會(huì)抑制小球藻sp. 的生長并促進(jìn)其油脂積累[13]。因此，研究LED光質(zhì)對工程藍(lán)藻生長的影響是產(chǎn)業(yè)化的必要途徑。

白斑綜合癥病毒 (WSSV) 于1992年首先在中國臺(tái)灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)，20年來WSSV在亞洲、南北美洲、歐洲和非洲造成的經(jīng)濟(jì)損失已超過70億美元，尚未見在規(guī)模生產(chǎn)中應(yīng)用有效藥物來防治[14]。Witteveldt等[15]首次用大腸桿菌表達(dá)的VP28 (WSSV被膜中的結(jié)構(gòu)蛋白)，經(jīng)口服和注射接種，可提高對蝦抗WSSV的能力。Jia等[10]使用轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻，經(jīng)口服后攻毒，成功提高了對蝦的成活率，證明口服轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻能有效抵抗WSSV。工程藍(lán)藻口服劑的研制已進(jìn)入中試階段，其中工程藍(lán)藻的規(guī)模培養(yǎng)是產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)。聚球藻屬sp. 由于適合光反應(yīng)器培養(yǎng)，已被廣泛用于規(guī)模培養(yǎng)的研究[16]，因此轉(zhuǎn)基因聚球藻7002[17]在產(chǎn)業(yè)化上非常具有前景。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)基因聚球藻的搖床培養(yǎng)

轉(zhuǎn)基因聚球藻. PCC7002由中國科學(xué)院植物研究所提供，裝在含150 mL BG-11培養(yǎng)基[18]的250 mL搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min，光照為50 μmol/(m2·s)，連續(xù)光照。

1.2 凈光合作用的單因素試驗(yàn)

聚球藻7002的葉綠素濃度通過公式(1)[19]測定：

= 14.96′(678–750)–0.616′(720–750) (1)

式中，表示葉綠素濃度 (mg/ml)；750、720、678分別表示750 nm、720 nm、678 nm處的吸光值。將待測藻液的濃度調(diào)整至每毫升樣品所含葉綠素為10 μg。

凈光合速率使用氧電極 (Hansatech，UK) 測定，溫度由恒溫水浴箱 (Julubo，Germany) 通過循環(huán)水控制。測定樣品在不同條件下的凈光合速率(光強(qiáng)，溫度，pH)[20]。凈光合速率計(jì)算采用公式(2)：

NPR =××60×1 000/(2)

式中，NPR (μmol O2/mg Chlah) 表示凈光合速率 (Net photosynthetic rate)；為記錄紙走的斜率 (/min)；為常數(shù)，表示一定溫度下水中的溶氧量 (mol O2/mL)；為樣品的葉綠素濃度 (mg/mL)；60表示60 min；1 000表示記錄紙的滿量程為1 000。

1.3 轉(zhuǎn)基因聚球藻的光生物反應(yīng)器培養(yǎng)

封閉式光生物反應(yīng)器為SDJ-5L型光合發(fā)酵系統(tǒng) (上海聯(lián)環(huán)生物工程設(shè)備有限公司)，由全自動(dòng)圓柱形玻璃反應(yīng)器及外置LED光源構(gòu)成。該系統(tǒng)可對pH、溫度、光照進(jìn)行恒定控制，培養(yǎng)條件 (光照、溫度、pH) 按照優(yōu)化后的指標(biāo) ((300±10) μmol/(m2·s)，37 ℃，pH 7.5) 進(jìn)行設(shè)置。工作體積為3.5 L，初始接種量使藻液750達(dá)到0.1±0.02，平均空氣流量為 1 L/min，平均CO2的體積分?jǐn)?shù)為0.5%。培養(yǎng)時(shí)長為72 h。LED光源采用白、紅、藍(lán)進(jìn)行調(diào)控，平均光強(qiáng)測定采用公式(3)[21]：

式中，av為平均光強(qiáng) (μmol/(m2·s))；為入射光強(qiáng) (μmol/(m2·s))；為光衰減系數(shù)；為反應(yīng)器半徑 (m)。聚球藻7002的光衰減系數(shù)計(jì)算采用如下公式(4)[22]：

= (–2.39 + 7.77750) (4)

式中，為光衰減系數(shù)；750為藻液吸光值。

調(diào)控白光、紅光、藍(lán)光的配比并設(shè)置White、Red、Blue、Balance共4個(gè)實(shí)驗(yàn)組(表1)，通過公式(3)測定并調(diào)控平均光強(qiáng)，使得平均光強(qiáng)符合優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn) ((300±10) μmol/(m2·s))。

表1 光質(zhì)配比及平均光強(qiáng)

1.4表達(dá)率測定及VP28蛋白檢測

Trizol法提取轉(zhuǎn)基因聚球藻7002的總RNA。以總RNA為模板，用試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA(Tiangen，China)。序列參照文獻(xiàn)[17]并設(shè)計(jì)的qPCR引物 (表2)。管家基因16s rRNA的引物采用已有模板[23]。20 μL PCR反應(yīng)體系包括 2 μL cDNA，0.6 μL正向引物與反向引物，10 μL SYBRFast qPCR Master Mix (2X) (KAPA，USA)。參照J(rèn)ia等[10]的方法，計(jì)算表達(dá)率并用Western blotting檢測蛋白條帶。

表2 本實(shí)驗(yàn)所用引物

1.5的表達(dá)分析

在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 上找到對應(yīng)的蛋白序列(ID: 501262777)、(ID: 501264014)、(ID: 501264746)，并利用tblastn反向定位到聚球藻7002基因組全序列(CP000951) 的對應(yīng)片段(region: 1489906-1490985)、(region: 161804-162883)、(region: 2245055-2246134)。分別設(shè)計(jì)qPCR引物 (表2)。取接種前的樣品 (藻種) 作為參照，每隔24 h對White、Red、Blue三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的樣品進(jìn)行檢測，其中qPCR方法及反應(yīng)體系同1.5。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH、光強(qiáng)、溫度對藻細(xì)胞光合作用的影響

光合作用中，除了光強(qiáng)直接供給電子激活的能量，溫度與pH對酶活力的影響決定了光合作用的效率[24]。因此，必須首先排除溫度與pH的干擾，使得光強(qiáng)的能量最大限度地輸入光系統(tǒng)Ⅱ，才能進(jìn)一步分析出光的成分(光質(zhì))對于捕光效果的影響。在溫度為35 ℃、pH為7.3的條件下，研究光強(qiáng) (50–800 μmol/(m2·s)) 對凈光合速率的影響(圖1A)。隨著光強(qiáng)的增加，凈光合速率不斷增加。當(dāng)光強(qiáng)達(dá)到400 μmol/(m2·s)時(shí)，凈光合速率出現(xiàn)下降，從320 μmol O2/mg Chlah左右下降至281 μmol O2/mg Chlah。在光強(qiáng)為300 μmol/(m2·s)，pH為7.3的條件下，研究溫度 (15–50 ℃) 對凈光合速率的影響 (圖1B)。隨著溫度增加，凈光合速率不斷增加。當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃后，凈光合速率突然下降，50 ℃時(shí)凈光合速率從320 μmol O2/mg Chlah變?yōu)?。在光強(qiáng)為300 μmol/(m2·s)，溫度為35 ℃的條件下，研究pH 5.5–9.0對凈光合速率的影響(圖1C)。隨著pH增加，凈光合速率不斷增加。當(dāng)pH達(dá)到7.5后，凈光合速率開始下降，凈光合作用從326 μmol O2/mg Chlah下降至210 μmol O2/mg Chlah。

圖1 光強(qiáng)、溫度、pH對凈光合速率的影響

2.2 藻細(xì)胞干生物量的積累

光生物反應(yīng)器培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，我們嘗試用單色光 (藍(lán)光) 來培養(yǎng)聚球藻，但細(xì)胞生長速度極慢，細(xì)胞樣品的采集與處理遇到較大困難，并且細(xì)胞濃度過低嚴(yán)重影響到基因與蛋白的檢測。因此，為了方便實(shí)驗(yàn)以及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需要，本研究以3 d內(nèi)干生物量達(dá)到1 g/L為最低標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行光質(zhì)配比的設(shè)定。隨著細(xì)胞密度的升高，入射光強(qiáng)并不能實(shí)時(shí)反映藻細(xì)胞的光能利用率[22]。從開始培養(yǎng)到結(jié)束，藻細(xì)胞的光能利用率處于一個(gè)由高至低的動(dòng)態(tài)的變化過程。本研究采用平均光強(qiáng)代替入射光作為計(jì)量參數(shù)[26]，計(jì)算出了平均光強(qiáng)的變化范圍 (表1)，以求反應(yīng)實(shí)際的光能利用率[11]。White、Red、Blue、Balance四個(gè)實(shí)驗(yàn)組72 h的干生物量分別為1.48 g/L、1.68 g/L、1.22 g/L、1.38 g/L。圖3中，培養(yǎng)前36 h內(nèi)，4組藻細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，干生物量積累速度差異不顯著。培養(yǎng)36 h后，Red組與Blue、Balance組的干生物量積累速度差異顯著，Red組生長速度最快；Red與Blue組差異極顯著，Blue組明顯生長較慢；White組與Balance組差異不顯著，生長速度較接近。光生物反應(yīng)器的驗(yàn)證培養(yǎng)結(jié)果表明，在生物量積累上，已經(jīng)超過了同類實(shí)驗(yàn)[22,25]，3 d內(nèi)平均干重超過1.2 g/L。

圖2 不同光質(zhì)組成下干生物量積累曲線

圖3 不同光質(zhì)組成下vp28表達(dá)率變化曲線

2.3基因的表達(dá)量與VP28蛋白的積累

寧文艷等[27]提出光調(diào)控啟動(dòng)子PpsbA是魚腥藻的高效表達(dá)載體，未經(jīng)光調(diào)控的PpsbA表達(dá)效率是IPTG調(diào)控下Ptac的1.17倍。然而尚未有報(bào)道指出轉(zhuǎn)基因魚腥藻的載體啟動(dòng)子PpsbA可接受光質(zhì)調(diào)控，未經(jīng)光調(diào)控的轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120的表達(dá)效率只有0.1%–1%[10]。轉(zhuǎn)基因聚球藻7002所用表達(dá)載體為prl-489，啟動(dòng)子為PpsbA[17]。本文中高比例藍(lán)光促進(jìn)了基因的表達(dá)，并促進(jìn)了的轉(zhuǎn)錄，這與Tsinoremas等[9]研究轉(zhuǎn)基因聚球藻7942結(jié)果一致。圖3與圖5的結(jié)果證明，載體啟動(dòng)子PpsbA與光合基因的轉(zhuǎn)錄在時(shí)空效應(yīng)上具有一致性，均受到藍(lán)光的誘導(dǎo)作用。然而外源蛋白 (VP28) 的積累量(圖4) 差異不如外源基因表達(dá)差異明顯 (圖3)，這可能是DNA轉(zhuǎn)錄與mRNA翻譯的時(shí)空差異造成的。圖3中，White、Red、Blue、Balance四組基因表達(dá)率總體均呈現(xiàn)上升趨勢，前36 h內(nèi)4組表達(dá)率都較低。其中，Blue與Balance組表達(dá)率較高，White與Red組表達(dá)率較低，36 h后前兩組與后兩組相比差異明顯。Blue與Balance組在前36 h及60 h后差異不顯著，而在36 h至60 h之間差異明顯。White與Red組在72 h內(nèi)差異都不明顯。Blue組中基因表達(dá)率最高達(dá)到2.41%，出現(xiàn)于第72 h。Red組中基因表達(dá)率最低達(dá)到0.11%，出現(xiàn)于12 h。圖4中，總蛋白條帶在PAGE上無明顯差別，而VP28條帶在PVDF上差異較為明顯?；叶戎祻纳俚蕉喾謩e為Red、White、Balance、Blue，說明Blue組蛋白積累量最高，Red組蛋白積累量最少，并且Blue組與Red組差異明顯。

圖4 不同光質(zhì)組成下VP28的相對含量

2.4的表達(dá)差異

圖5顯示，接種后光能利用率較高，轉(zhuǎn)錄效率比接種前提高了50%–75%。White與Red組的總mRNA表達(dá)量高于Blue組。隨時(shí)間變化，總mRNA含量呈下降趨勢。、、在3組中都呈下降趨勢，其中、在White與Red組中下降速度較快，分別從第1天的0.72、0.48下降至第3天的0.32、0.28，分別從0.72、0.42下降至0.21、0.11。而在Blue組中，與的下降速度明顯較慢，從第1天的0.34、0.78分別下降至第3天的0.20、0.40。Blue組的與始終高于White與Red組，而Red組的與始終處于較低水平。與純白光相比，高比例紅光并不影響基因總mRNA含量，但最終提高了轉(zhuǎn)基因聚球藻7002的干生物量積累；高比例藍(lán)光抑制了總mRNA的含量，從而抑制了干生物量的積累，但促進(jìn)了與的轉(zhuǎn)錄。這可能是由于不同比例的紅光、藍(lán)光影響了Rubisco與碳酸酐酶的活性[28]，從而影響了碳循環(huán)途徑。本文中高比例紅光促進(jìn)了生物量的積累，這可能是因?yàn)榧t光誘導(dǎo)了一種以鈣調(diào)蛋白為二級信使的信號通路[29]，并促進(jìn)了的表達(dá)。

圖5 不同光質(zhì)組成下psbA的相對表達(dá)量

3 結(jié)論

本文研究了光質(zhì)調(diào)控對工程聚球藻7002生長及表達(dá)的影響，確定最優(yōu)光能利用條件，使得生物量在3 d內(nèi)突破1.2 g/L。當(dāng)白光，紅光與藍(lán)光的光強(qiáng)比為3∶1∶2時(shí)，重組蛋白VP28表達(dá)翻倍。發(fā)現(xiàn)藍(lán)光可促進(jìn)啟動(dòng)子PpsbA表達(dá)，紅光可提高生物量的積累。通過檢測基因轉(zhuǎn)錄及目的蛋白表達(dá)，證明基因響應(yīng)了光質(zhì)調(diào)控。研究結(jié)果對工程藍(lán)藻的規(guī)模培養(yǎng)、重組蛋白的高效表達(dá)、轉(zhuǎn)基因生物制藥具有重要的參考價(jià)值。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Effects of light quality on cell growth and psbA promoter of engineered Synechococcus sp. PCC7002

Yihua Sun1, Chunli Zhang2, Dingji Shi3, Xiaohui Jia1, Rui Jia1, and Peimin He1

1 College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China 2 Department of Molecular Membrane Biology, Max Planck Institute of Biophysics, Max-von-Laue-Str.3, D-60438 Frankfurt am Main, Germany 3 Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China

Light quality can regulate bothgenes and vector promoter psbA of the engineered. Through light regulation, we tried to improve yield of the recombinant protein forgene-expressedsp. PCC7002. To drive photon-capturing efficiently, three limiting factors (irradiance, temperature and pH) were optimized by measuring net photosynthesis. High cell density cultures were performed with variant ratios of white, red and blue light in a 5-L photo-bioreactor. Yields of biomass, expressions ofand transcription levels ofwere compared. High ratio blue light-inducedtranscription had tripled and the relative accumulation of VP28 protein was doubled. The relative expressions ofandhad positive correlations with higher ratio of blue light, not the red light. With high ratio red light inducing, dry biomass reached 1.5 g/L in three days. Therefore, we speculated that red light accelerated biomass accumulation of the transgenic strain and blue light promoted transcription for PpsbA and. These results provided useful information for mass production of cyanobacteria and its secondary metabolites.

biophotoreactor,sp. PCC7002, psbA promoter, VP28, light quality regulation, psbA

January 3, 2016; Accepted: January 29, 2016

Rui Jia. Tel: +86-21-61900449; E-mail: rjia@shou.edu.cn

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2014AA093506).

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2014AA093506) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-02-03 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160203.1100.002.html

孫溢華, 張春莉, 施定基, 等. 光質(zhì)對工程聚球藻7002生長及psbA啟動(dòng)子的調(diào)控. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(9): 1286–1290.

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