劉　昕，吳天祥，趙群麗，朱俊杰，吳彩云

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025； 2.貴州省輕工業(yè)科學(xué)研究所，貴州貴陽(yáng)550007）

基于Kriging代理模型對(duì)產(chǎn)不飽和脂肪酸的酒曲微生物混菌比例優(yōu)化

劉昕1，2，吳天祥1，趙群麗1，朱俊杰1，吳彩云1

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025； 2.貴州省輕工業(yè)科學(xué)研究所，貴州貴陽(yáng)550007）

Kriging代理模型常常作為工程計(jì)算領(lǐng)域的一種優(yōu)化方法，通過(guò)選取動(dòng)態(tài)點(diǎn)能有效提高Kriging代理模型的精確度，這種方法在優(yōu)化多目標(biāo)問(wèn)題上具有高精度的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了酒曲微生物混菌10組不同比例（V細(xì)∶V酵∶V霉=1∶0∶0、0∶0∶1、0∶1∶0、1∶1∶1、4∶4∶2、4∶2∶4、2∶4∶4、2∶2∶6、2∶6∶2、6∶2∶2）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，混合液態(tài)發(fā)酵7 d后，以5種不同的不飽和脂肪酸（肉豆蔻油酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸）甲酯化后的含量為基礎(chǔ)點(diǎn)進(jìn)行Kriging方法模型建立。通過(guò)優(yōu)化模型的建立選取了3組混合比例（V細(xì)∶V酵∶V霉=1.6∶2.7∶5.7、1.7∶3.9∶4.4、1.9∶1.9∶6.2）進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，當(dāng)預(yù)測(cè)值的含量與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)真實(shí)值的相對(duì)偏差小于10%時(shí)，說(shuō)明此方法可行。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，選取V細(xì)∶V酵∶V霉=1.9∶1.9∶6.2作為最終的優(yōu)化結(jié)果。

Kriging模型； 混合菌株； 液態(tài)發(fā)酵； 不飽和脂肪酸； 比例優(yōu)化

在中國(guó)白酒釀造過(guò)程中，微生物的參與及各方面的貢獻(xiàn)作用不可忽視。霉菌主要作為糖化功能菌，酵母主要參與產(chǎn)酒與生香，細(xì)菌在釀造過(guò)程中與大部分風(fēng)味物質(zhì)的形成相聯(lián)系。所以白酒釀造過(guò)程中主要的三大類微生物彼此協(xié)同，也可能在某些階段相互抑制［1-9］。這些酒曲微生物在發(fā)酵和釀造的過(guò)程中除了形成主要的風(fēng)味物質(zhì)，也會(huì)形成一些微量成分，這些微量成分除對(duì)酒體風(fēng)味香氣有貢獻(xiàn)外，還對(duì)人體起到保健作用，其中一類微量成分——不飽和脂肪酸就是對(duì)人體有益的，它能防止心血管疾病、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)視網(wǎng)膜等［10-17］。

代理模型方法，又稱近似模型方法，是一種解決復(fù)雜工程優(yōu)化設(shè)計(jì)問(wèn)題的方法。它的主要思路是利用樣本點(diǎn)擬合出的代數(shù)模型代替真實(shí)模型，從而減少求解真實(shí)模型所需花費(fèi)的時(shí)間。Kriging模型由于適用于擬合高度非線性、多峰值的問(wèn)題而得到了更廣泛的應(yīng)用［18-20］。然而在利用Kriging代理模型［21-24］尋優(yōu)的過(guò)程中，通過(guò)初始樣本所建立的代理模型往往無(wú)法得到全局最優(yōu)，因?yàn)槌跏紭颖静⒉荒芡耆采w整個(gè)設(shè)計(jì)空間；因此，在優(yōu)化設(shè)計(jì)的過(guò)程中，往往采用代理模型的動(dòng)態(tài)更新，將一些新的采樣點(diǎn)加入模型樣本集；通過(guò)不斷改善模型的全局或者局部精度，來(lái)逐漸逼近一個(gè)收斂的優(yōu)化結(jié)果。

本研究通過(guò)氣相分析細(xì)菌、酵母、霉菌3種混合菌株液態(tài)發(fā)酵7 d后產(chǎn)的5種不飽和脂肪酸（肉豆蔻油酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸），將其甲酯化后的含量為Kriging代理模型的基點(diǎn)，采用Kriging代理模型來(lái)進(jìn)行建模。通過(guò)建立的模型得到預(yù)測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最后通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)找到最終優(yōu)化的混菌比例。采用新的優(yōu)化方法Kriging代理模型應(yīng)用在生物類的統(tǒng)計(jì)分析中，為除響應(yīng)面優(yōu)化法以外的另一種優(yōu)化思路提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

實(shí)驗(yàn)菌種：細(xì)菌DX-2，酵母菌XJ-4，霉菌XM-4（細(xì)菌從董酒大曲中分離篩選得到；酵母菌、霉菌分別從董酒小曲中分離篩選得到）。

試劑：正己烷、乙醇均為色譜級(jí)，無(wú)水乙醇、甲醇、濃硫酸等化學(xué)試劑均為分析純（見(jiàn)表1）。

表1　實(shí)驗(yàn)不飽和脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品

1.2儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器（LS-B75L-I），江陰賓江醫(yī)療設(shè)備有限公司；臺(tái)式空氣恒溫?fù)u床（TS-2102C），上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；氣相色譜儀（Agilent 7890），美國(guó)Agilent。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

在裝有90 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基和10 mL浸提液（大、小酒曲浸提液分別添加設(shè)置為不同的實(shí)驗(yàn)組）的250 mL三角瓶中，空白組則不添加浸提液裝100 mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基。分別將各種種子液以5%的接種量接入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別貼上標(biāo)簽。置于恒溫30℃、180 r/min條件培養(yǎng)10 d。每天取發(fā)酵液測(cè)定其不飽和脂肪酸含量。

1.3.2發(fā)酵液甲酯化處理

取發(fā)酵液10 mL于25 mL具塞試管中，再加入甲醇2 mL，濃硫酸2滴，60℃水浴酯化30 min。冷卻后轉(zhuǎn)入30 mL分液漏斗中，依次加入5 mL正己烷、2 mL飽和NaCl，振蕩1 min，靜置分層后收集有機(jī)相于25 mL容量瓶中，水相連續(xù)用正己烷萃取2次，分別收集有機(jī)相于容量瓶中，定容后用于氣相色譜（GC）進(jìn)樣分析。

1.3.3氣相色譜條件

KB-FFAP毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；Agilent 7890氣相色譜儀柱箱程序升溫條件35℃（5 min）→7℃/min→100℃（2 min）→10℃/min→220℃（4 min），載氣（N2）流速：0.4 mL/min；H2流速40 mL/min；Air流速400 mL/min；尾吹：30 mL/min；分流比：35∶1；進(jìn)樣口溫度：240℃；FID檢測(cè)器溫度：260℃；進(jìn)樣量1.0 μL。

1.3.4Kriging代理模型的建立

Kriging模型假設(shè)系統(tǒng)的響應(yīng)值與自變量間的真實(shí)關(guān)系可表示成以下形式：

式中：y（x）為未知Kriging模型；f（x）為已知的關(guān)于x的函數(shù)，其為類似于響應(yīng)面法的多項(xiàng)式模型，提供了設(shè)計(jì)空間內(nèi)的全局近似模型；z（x）為一隨機(jī)過(guò)程，是在全局模型的基礎(chǔ)上創(chuàng)建的均值為0但方差不為0的局部偏差。z（x）的協(xié)方差可表示為：

式中：R是相關(guān)矩陣；R（xi，xj）表示任意2個(gè)樣本點(diǎn)xi和xj的相關(guān)函數(shù)，目前已經(jīng)出現(xiàn)了多種相關(guān)函數(shù)，如指數(shù)函數(shù)、高斯函數(shù)、樣條函數(shù)等。本文選取高斯函數(shù)作為相關(guān)函數(shù)，其表達(dá)式為：

預(yù)測(cè)近似模型可寫(xiě)為：

式中：Ys為樣本點(diǎn)響應(yīng)量矩陣；f為全1列向量；R為樣本點(diǎn)相關(guān)矩陣。即：

r（x）為樣本點(diǎn)和預(yù)測(cè)點(diǎn)之間的相關(guān)向量：

（4）式中的未知常數(shù)β可由廣義最小二乘法得到：

方差由下式求得：

（3）式中的相關(guān)參數(shù)θ可通過(guò)極大似然估計(jì)得到：

表2　大曲浸提液組發(fā)酵7 d時(shí)各不飽和脂肪酸甲酯的含量

任意一個(gè)θ值都能生成一個(gè)插值模型，最終的Kriging模型是通過(guò)利用優(yōu)化方法找出最優(yōu)的θ值，使得似然函數(shù)最大，從而使得構(gòu)造模型精度最高。

預(yù)測(cè)值y^（x）的精度取決于樣本點(diǎn)與預(yù)測(cè)點(diǎn)x之間的距離，樣本點(diǎn)離x越近，預(yù)測(cè)值y^（x）的誤差也就越小，通常用均方根誤差（RMSE）來(lái)表示。

1.4統(tǒng)計(jì)方法

所有的實(shí)驗(yàn)組均做3個(gè)平行，得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。用Excel 2010處理數(shù)據(jù)和Tecplot作圖。

2　結(jié)果與分析

設(shè)置了7組混菌實(shí)驗(yàn)組及3組純種實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，共10組實(shí)驗(yàn)組分別為V細(xì)∶V酵∶V霉=1∶0∶0、0∶0∶1、0 ∶1∶0、1∶1∶1、4∶4∶2、4∶2∶4、2∶4∶4、2∶2∶6、2∶6∶2、6∶2∶2進(jìn)行氣相（GC）分析并以分析的5種不飽和脂肪酸的含量為基礎(chǔ)分別進(jìn)行Kriging代理模型數(shù)學(xué)方法建模優(yōu)化。通過(guò)純種液態(tài)發(fā)酵得到在發(fā)酵周期為7 d時(shí)，各不飽和脂肪酸甲酯的含量，見(jiàn)表2。

從表2可看出，各實(shí)驗(yàn)組之間5種不飽和脂肪含量差異不大，其中，每組的5種不飽和脂肪酸中棕櫚油酸、油酸、亞油酸含量相對(duì)比其余的2種高。α-亞麻酸是各實(shí)驗(yàn)組中最微量的。以表1中各不飽和脂肪酸甲酯化的含量為基礎(chǔ)，用1.3.4的數(shù)學(xué)方法及Matlab編程進(jìn)行建模，用Modefrontier在建模的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。

盡管不同的種子液比例不僅影響產(chǎn)出多種甲酯的最大含量，同時(shí)也決定了含量出現(xiàn)最大時(shí)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，但由于含量與時(shí)間節(jié)點(diǎn)均是關(guān)于3種種子液含量的函數(shù)，為了簡(jiǎn)化分析模型，忽略時(shí)間周期與最大含量之間的關(guān)系。另外為了獲得最優(yōu)的種子液比例，可采用窮舉法的思路大量嘗試各種比例，最終選出含量最高的比例，但該方法存在效率低、成本高的缺點(diǎn)，因此，本文采用了基于Kriging代理模型的方法，利用有限樣本構(gòu)建種子液比例與含量之間的函數(shù)關(guān)系，該方法已在其他領(lǐng)域獲得巨大的成功，Kriging代理模型具備精度高、所需樣本少、計(jì)算速度快等特點(diǎn)。通過(guò)10次試驗(yàn)的結(jié)果作為模型樣本，分別建立了肉豆蔲油酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、α-亞麻酸甲酯含量與酵母菌、細(xì)菌、霉菌種子液的函數(shù)模型（如圖1—圖5所示），其中x坐標(biāo)是酵母菌種子液含量、y坐標(biāo)是細(xì)菌種子液含量、Z軸是相應(yīng)物質(zhì)的含量，3種種子液接種的總體積均為10 mL，該方法能使數(shù)學(xué)模型由四維模型降階到三維模型，便于圖像展示。

圖1　大曲浸提液組肉豆蔻油酸甲酯預(yù)測(cè)模型

圖2　大曲浸提液組棕櫚油酸甲酯預(yù)測(cè)模型

由圖1—圖5可以看出，當(dāng)酵母菌∶細(xì)菌∶霉菌種子液含量比約為3.2∶2.7∶4.1時(shí)，肉豆蔲油酸甲酯含量到達(dá)峰值；酵母菌∶細(xì)菌∶霉菌種子液含量比約為3.5∶2.7∶3.8時(shí)，棕櫚油酸甲酯含量到達(dá)峰值；酵母菌∶細(xì)菌∶霉菌種子液含量比約為3.2∶3∶3.8時(shí)，油酸甲酯含量到達(dá)峰值；酵母菌優(yōu)化，符合現(xiàn)代人們追求身體保健的觀點(diǎn)［25-28］，并且從另一方面說(shuō)明中國(guó)白酒中的微量成分對(duì)人們身體有重要作用。將優(yōu)化目標(biāo)確定為α-亞麻酸甲酯的含量與其他4種物質(zhì)含量之和，由于其他4種物質(zhì)含量的數(shù)量級(jí)不同，采用簡(jiǎn)單的累加會(huì)使得其中某一項(xiàng)物質(zhì)主導(dǎo)了優(yōu)化結(jié)果，因此對(duì)4種物質(zhì)之和進(jìn)行了歸一化后累加的方式，利用多目標(biāo)遺傳算法對(duì)2個(gè)目標(biāo)進(jìn)行了優(yōu)化，圖6是優(yōu)化結(jié)果?！眉?xì)菌∶霉菌種子液含量比約為10∶0∶0時(shí)，亞油酸甲酯含量到達(dá)峰值；酵母菌∶細(xì)菌∶霉菌種子液含量比約為2∶2∶6時(shí)，α-亞麻酸甲酯含量到達(dá)峰值。

圖3　大曲浸提液組油酸甲酯預(yù)測(cè)模型

圖4　大曲浸提液組亞油酸甲酯預(yù)測(cè)模型

圖5　大曲浸提液組α-亞麻酸甲酯預(yù)測(cè)模型

由于種子液比例與所產(chǎn)生物質(zhì)之間的函數(shù)關(guān)系相似度非常差，在很多時(shí)候存在著此消彼長(zhǎng)的現(xiàn)象，因此如何選擇最優(yōu)比例需要建立物質(zhì)最優(yōu)含量的評(píng)價(jià)函數(shù)，多個(gè)文獻(xiàn)表明，α-亞麻酸的食物來(lái)源比較少，并且其在微量的情況下對(duì)人體有好處，因此以α-亞麻酸作為主要指標(biāo)

圖6　大曲浸提液組優(yōu)化結(jié)果

由優(yōu)化結(jié)果可以看出，α-亞麻酸甲酯的含量與其他4種物質(zhì)含量之和的目標(biāo)存在明顯的矛盾，α-亞麻酸甲酯的含量提升意味著其他4種物質(zhì)之和含量的降低，因此選出了3組具有代表性的優(yōu)化預(yù)測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表3。

以上述3組優(yōu)化預(yù)測(cè)結(jié)果中的細(xì)菌、酵母菌、霉菌3種種子液的體積比為依據(jù)，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的方法過(guò)程均與優(yōu)化之前的相同。經(jīng)過(guò)7 d的發(fā)酵周期，取發(fā)酵液進(jìn)行GC分析，測(cè)定5種不飽和脂肪酸含量，與預(yù)測(cè)結(jié)果中的含量相比較，結(jié)果見(jiàn)表4。

根據(jù)Kriging模型優(yōu)化的理論，只要真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間的誤差小于10%，證明該方法可行，預(yù)測(cè)結(jié)果可信。從表4可看出，V細(xì)∶V酵∶V霉=1.6∶2.7∶5.7時(shí)，油酸甲酯與α-亞麻酸甲酯的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間的誤差大于10%，而另外2個(gè)組中的5種不飽和脂肪酸的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間的誤差均小于10%。當(dāng)V細(xì)∶V酵∶V霉=1.9∶1.9 ∶6.2時(shí)，α-亞麻酸甲酯的含量比V細(xì)∶V酵∶V霉=1.7∶3.9∶4.4中的含量較高。綜合考慮，最終選擇V細(xì)∶V酵∶V霉=1.9∶1.9∶6.2為優(yōu)化的結(jié)果。

3　結(jié)論

通過(guò)采用新型的Kriging代理模型優(yōu)化方法對(duì)酒曲微生物混菌比例進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)建立的模型優(yōu)化找到幾組預(yù)測(cè)精度高的混菌比例結(jié)果，將得到的預(yù)測(cè)比例進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終選取得到混菌比例中的各不飽和脂肪酸含量與預(yù)測(cè)值中的含量進(jìn)行相對(duì)誤差偏差計(jì)算，誤差低于10%，便說(shuō)明此方法成立，優(yōu)化可行。最后通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到V細(xì)∶V酵∶V霉=1.9∶1.9∶6.2，為大曲浸提液實(shí)驗(yàn)組的最終優(yōu)化結(jié)果?？傊?，本實(shí)驗(yàn)利用建立Kriging模型方法來(lái)優(yōu)化生物類問(wèn)題，是比較創(chuàng)新的一種思路和方法。此方法相對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化來(lái)說(shuō)可以實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)優(yōu)化，提高了優(yōu)化效率，在精準(zhǔn)度方面也比其更精準(zhǔn)仔細(xì)。另外，把工程方面的計(jì)算方法應(yīng)用在農(nóng)學(xué)、生物學(xué)等學(xué)科有時(shí)也是可行的，同時(shí)也促進(jìn)了學(xué)科知識(shí)系統(tǒng)領(lǐng)域間的相互借鑒和融合。

表3　大曲浸提液組優(yōu)化預(yù)測(cè)結(jié)果

表4　大曲浸提液組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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Optimization of Mixed Ratio of Microbial Strains to Produce Unsaturated Fatty Acids Based on Kriging Model

LIU Xin1，2，WU Tianxiang1，ZHAO Qunli1，ZHU Junjie1and WU Caiyun1
（1.School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025；2.Guizhou Institute of Light Industry，Guiyang，Guizhou 550007，China）

Kriging model，as a commonly-used optimization method in engineering calculation field，its accuracy could be improved effectively by selecting dynamic points.This method is featured by high precision in the optimization of multiple targets.In the experiment，ten groups of microbial strains of different mixed ratio（Vbacteria∶Vyeast∶Vmold=1∶0∶0，0∶0∶1，0∶1∶0，1∶1∶1，4∶4∶2，4∶2∶4，2∶4∶4，2∶2∶6，2∶6:∶2，6∶2∶2）were set up，7 d after mixed liquid fermentation，the Kriging models had been established with the content of five kinds of unsaturated fatty acids after esterification（fourteenolefinic acid methyl，palm methyl oleate，methyl oleate，linoleic acid methyl ester，alpha linolenic acid）as the basic points.The optimized Kriging models were then verified in three groups（mixed ratio of Vbacteria∶Vyeast∶Vmold=1.6∶2.7∶5.7，1.7∶3.9∶4.4，1.9∶1.9∶6.2）.As the deviation of predicted values and real values was less than 10%，the model was feasible.In conclusion，the mixed ratio Vbacteria∶Vyeast∶Vmold=1.9∶1.9∶6.2 was the best choice in practice.

Kriging model；mixed microbial strains；liquid-state fermentation；unsaturated fatty acids；ratio optimization

TS262.1；Q93-3；TS262.3

A

1001-9286（2016）09-0023-05

10.13746/j.njkj.2016192

董香型白酒工藝創(chuàng)新技術(shù)合作項(xiàng)目。

2016-05-31

劉昕（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：6123755@qq.com。

吳天祥（1965-），男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程，E-mail：ce.txwu@gzu.edu.cn。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-08-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160803.1038.008.html。