劉　昕，吳天祥，趙群麗，朱俊杰，吳彩云

（1.貴州大學釀酒與食品工學院，貴州貴陽550025； 2.貴州省輕工業(yè)科學研究所，貴州貴陽550007）

基于Kriging代理模型對產(chǎn)不飽和脂肪酸的酒曲微生物混菌比例優(yōu)化

劉昕1，2，吳天祥1，趙群麗1，朱俊杰1，吳彩云1

（1.貴州大學釀酒與食品工學院，貴州貴陽550025； 2.貴州省輕工業(yè)科學研究所，貴州貴陽550007）

Kriging代理模型常常作為工程計算領域的一種優(yōu)化方法，通過選取動態(tài)點能有效提高Kriging代理模型的精確度，這種方法在優(yōu)化多目標問題上具有高精度的特點，本實驗設置了酒曲微生物混菌10組不同比例（V細∶V酵∶V霉=1∶0∶0、0∶0∶1、0∶1∶0、1∶1∶1、4∶4∶2、4∶2∶4、2∶4∶4、2∶2∶6、2∶6∶2、6∶2∶2）進行實驗，混合液態(tài)發(fā)酵7 d后，以5種不同的不飽和脂肪酸（肉豆蔻油酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸）甲酯化后的含量為基礎點進行Kriging方法模型建立。通過優(yōu)化模型的建立選取了3組混合比例（V細∶V酵∶V霉=1.6∶2.7∶5.7、1.7∶3.9∶4.4、1.9∶1.9∶6.2）進行驗證實驗，當預測值的含量與驗證實驗真實值的相對偏差小于10%時，說明此方法可行。通過驗證實驗，選取V細∶V酵∶V霉=1.9∶1.9∶6.2作為最終的優(yōu)化結果。

Kriging模型； 混合菌株； 液態(tài)發(fā)酵； 不飽和脂肪酸； 比例優(yōu)化

在中國白酒釀造過程中，微生物的參與及各方面的貢獻作用不可忽視。霉菌主要作為糖化功能菌，酵母主要參與產(chǎn)酒與生香，細菌在釀造過程中與大部分風味物質(zhì)的形成相聯(lián)系。所以白酒釀造過程中主要的三大類微生物彼此協(xié)同，也可能在某些階段相互抑制［1-9］。這些酒曲微生物在發(fā)酵和釀造的過程中除了形成主要的風味物質(zhì)，也會形成一些微量成分，這些微量成分除對酒體風味香氣有貢獻外，還對人體起到保健作用，其中一類微量成分——不飽和脂肪酸就是對人體有益的，它能防止心血管疾病、免疫調(diào)節(jié)、保護視網(wǎng)膜等［10-17］。

代理模型方法，又稱近似模型方法，是一種解決復雜工程優(yōu)化設計問題的方法。它的主要思路是利用樣本點擬合出的代數(shù)模型代替真實模型，從而減少求解真實模型所需花費的時間。Kriging模型由于適用于擬合高度非線性、多峰值的問題而得到了更廣泛的應用［18-20］。然而在利用Kriging代理模型［21-24］尋優(yōu)的過程中，通過初始樣本所建立的代理模型往往無法得到全局最優(yōu)，因為初始樣本并不能完全覆蓋整個設計空間；因此，在優(yōu)化設計的過程中，往往采用代理模型的動態(tài)更新，將一些新的采樣點加入模型樣本集；通過不斷改善模型的全局或者局部精度，來逐漸逼近一個收斂的優(yōu)化結果。

本研究通過氣相分析細菌、酵母、霉菌3種混合菌株液態(tài)發(fā)酵7 d后產(chǎn)的5種不飽和脂肪酸（肉豆蔻油酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸），將其甲酯化后的含量為Kriging代理模型的基點，采用Kriging代理模型來進行建模。通過建立的模型得到預測的實驗結果，最后通過驗證實驗找到最終優(yōu)化的混菌比例。采用新的優(yōu)化方法Kriging代理模型應用在生物類的統(tǒng)計分析中，為除響應面優(yōu)化法以外的另一種優(yōu)化思路提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

實驗菌種：細菌DX-2，酵母菌XJ-4，霉菌XM-4（細菌從董酒大曲中分離篩選得到；酵母菌、霉菌分別從董酒小曲中分離篩選得到）。

試劑：正己烷、乙醇均為色譜級，無水乙醇、甲醇、濃硫酸等化學試劑均為分析純（見表1）。

表1　實驗不飽和脂肪酸甲酯標準品

1.2儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌器（LS-B75L-I），江陰賓江醫(yī)療設備有限公司；臺式空氣恒溫搖床（TS-2102C），上海天呈實驗儀器制造有限公司；氣相色譜儀（Agilent 7890），美國Agilent。

1.3實驗方法

1.3.1搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

在裝有90 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基和10 mL浸提液（大、小酒曲浸提液分別添加設置為不同的實驗組）的250 mL三角瓶中，空白組則不添加浸提液裝100 mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基。分別將各種種子液以5%的接種量接入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別貼上標簽。置于恒溫30℃、180 r/min條件培養(yǎng)10 d。每天取發(fā)酵液測定其不飽和脂肪酸含量。

1.3.2發(fā)酵液甲酯化處理

取發(fā)酵液10 mL于25 mL具塞試管中，再加入甲醇2 mL，濃硫酸2滴，60℃水浴酯化30 min。冷卻后轉(zhuǎn)入30 mL分液漏斗中，依次加入5 mL正己烷、2 mL飽和NaCl，振蕩1 min，靜置分層后收集有機相于25 mL容量瓶中，水相連續(xù)用正己烷萃取2次，分別收集有機相于容量瓶中，定容后用于氣相色譜（GC）進樣分析。

1.3.3氣相色譜條件

KB-FFAP毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；Agilent 7890氣相色譜儀柱箱程序升溫條件35℃（5 min）→7℃/min→100℃（2 min）→10℃/min→220℃（4 min），載氣（N2）流速：0.4 mL/min；H2流速40 mL/min；Air流速400 mL/min；尾吹：30 mL/min；分流比：35∶1；進樣口溫度：240℃；FID檢測器溫度：260℃；進樣量1.0 μL。

1.3.4Kriging代理模型的建立

Kriging模型假設系統(tǒng)的響應值與自變量間的真實關系可表示成以下形式：

式中：y（x）為未知Kriging模型；f（x）為已知的關于x的函數(shù)，其為類似于響應面法的多項式模型，提供了設計空間內(nèi)的全局近似模型；z（x）為一隨機過程，是在全局模型的基礎上創(chuàng)建的均值為0但方差不為0的局部偏差。z（x）的協(xié)方差可表示為：

式中：R是相關矩陣；R（xi，xj）表示任意2個樣本點xi和xj的相關函數(shù)，目前已經(jīng)出現(xiàn)了多種相關函數(shù)，如指數(shù)函數(shù)、高斯函數(shù)、樣條函數(shù)等。本文選取高斯函數(shù)作為相關函數(shù)，其表達式為：

預測近似模型可寫為：

式中：Ys為樣本點響應量矩陣；f為全1列向量；R為樣本點相關矩陣。即：

r（x）為樣本點和預測點之間的相關向量：

（4）式中的未知常數(shù)β可由廣義最小二乘法得到：

方差由下式求得：

（3）式中的相關參數(shù)θ可通過極大似然估計得到：

表2　大曲浸提液組發(fā)酵7 d時各不飽和脂肪酸甲酯的含量

任意一個θ值都能生成一個插值模型，最終的Kriging模型是通過利用優(yōu)化方法找出最優(yōu)的θ值，使得似然函數(shù)最大，從而使得構造模型精度最高。

預測值y^（x）的精度取決于樣本點與預測點x之間的距離，樣本點離x越近，預測值y^（x）的誤差也就越小，通常用均方根誤差（RMSE）來表示。

1.4統(tǒng)計方法

所有的實驗組均做3個平行，得到的實驗數(shù)據(jù)取用平均值±標準偏差。用Excel 2010處理數(shù)據(jù)和Tecplot作圖。

2　結果與分析

設置了7組混菌實驗組及3組純種實驗組進行液態(tài)發(fā)酵，共10組實驗組分別為V細∶V酵∶V霉=1∶0∶0、0∶0∶1、0 ∶1∶0、1∶1∶1、4∶4∶2、4∶2∶4、2∶4∶4、2∶2∶6、2∶6∶2、6∶2∶2進行氣相（GC）分析并以分析的5種不飽和脂肪酸的含量為基礎分別進行Kriging代理模型數(shù)學方法建模優(yōu)化。通過純種液態(tài)發(fā)酵得到在發(fā)酵周期為7 d時，各不飽和脂肪酸甲酯的含量，見表2。

從表2可看出，各實驗組之間5種不飽和脂肪含量差異不大，其中，每組的5種不飽和脂肪酸中棕櫚油酸、油酸、亞油酸含量相對比其余的2種高。α-亞麻酸是各實驗組中最微量的。以表1中各不飽和脂肪酸甲酯化的含量為基礎，用1.3.4的數(shù)學方法及Matlab編程進行建模，用Modefrontier在建模的基礎上進行優(yōu)化。

盡管不同的種子液比例不僅影響產(chǎn)出多種甲酯的最大含量，同時也決定了含量出現(xiàn)最大時的時間節(jié)點，但由于含量與時間節(jié)點均是關于3種種子液含量的函數(shù)，為了簡化分析模型，忽略時間周期與最大含量之間的關系。另外為了獲得最優(yōu)的種子液比例，可采用窮舉法的思路大量嘗試各種比例，最終選出含量最高的比例，但該方法存在效率低、成本高的缺點，因此，本文采用了基于Kriging代理模型的方法，利用有限樣本構建種子液比例與含量之間的函數(shù)關系，該方法已在其他領域獲得巨大的成功，Kriging代理模型具備精度高、所需樣本少、計算速度快等特點。通過10次試驗的結果作為模型樣本，分別建立了肉豆蔲油酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、α-亞麻酸甲酯含量與酵母菌、細菌、霉菌種子液的函數(shù)模型（如圖1—圖5所示），其中x坐標是酵母菌種子液含量、y坐標是細菌種子液含量、Z軸是相應物質(zhì)的含量，3種種子液接種的總體積均為10 mL，該方法能使數(shù)學模型由四維模型降階到三維模型，便于圖像展示。

圖1　大曲浸提液組肉豆蔻油酸甲酯預測模型

圖2　大曲浸提液組棕櫚油酸甲酯預測模型

由圖1—圖5可以看出，當酵母菌∶細菌∶霉菌種子液含量比約為3.2∶2.7∶4.1時，肉豆蔲油酸甲酯含量到達峰值；酵母菌∶細菌∶霉菌種子液含量比約為3.5∶2.7∶3.8時，棕櫚油酸甲酯含量到達峰值；酵母菌∶細菌∶霉菌種子液含量比約為3.2∶3∶3.8時，油酸甲酯含量到達峰值；酵母菌優(yōu)化，符合現(xiàn)代人們追求身體保健的觀點［25-28］，并且從另一方面說明中國白酒中的微量成分對人們身體有重要作用。將優(yōu)化目標確定為α-亞麻酸甲酯的含量與其他4種物質(zhì)含量之和，由于其他4種物質(zhì)含量的數(shù)量級不同，采用簡單的累加會使得其中某一項物質(zhì)主導了優(yōu)化結果，因此對4種物質(zhì)之和進行了歸一化后累加的方式，利用多目標遺傳算法對2個目標進行了優(yōu)化，圖6是優(yōu)化結果?！眉毦妹咕N子液含量比約為10∶0∶0時，亞油酸甲酯含量到達峰值；酵母菌∶細菌∶霉菌種子液含量比約為2∶2∶6時，α-亞麻酸甲酯含量到達峰值。

圖3　大曲浸提液組油酸甲酯預測模型

圖4　大曲浸提液組亞油酸甲酯預測模型

圖5　大曲浸提液組α-亞麻酸甲酯預測模型

由于種子液比例與所產(chǎn)生物質(zhì)之間的函數(shù)關系相似度非常差，在很多時候存在著此消彼長的現(xiàn)象，因此如何選擇最優(yōu)比例需要建立物質(zhì)最優(yōu)含量的評價函數(shù)，多個文獻表明，α-亞麻酸的食物來源比較少，并且其在微量的情況下對人體有好處，因此以α-亞麻酸作為主要指標

圖6　大曲浸提液組優(yōu)化結果

由優(yōu)化結果可以看出，α-亞麻酸甲酯的含量與其他4種物質(zhì)含量之和的目標存在明顯的矛盾，α-亞麻酸甲酯的含量提升意味著其他4種物質(zhì)之和含量的降低，因此選出了3組具有代表性的優(yōu)化預測結果，見表3。

以上述3組優(yōu)化預測結果中的細菌、酵母菌、霉菌3種種子液的體積比為依據(jù)，進行驗證實驗。實驗的方法過程均與優(yōu)化之前的相同。經(jīng)過7 d的發(fā)酵周期，取發(fā)酵液進行GC分析，測定5種不飽和脂肪酸含量，與預測結果中的含量相比較，結果見表4。

根據(jù)Kriging模型優(yōu)化的理論，只要真實值與預測值之間的誤差小于10%，證明該方法可行，預測結果可信。從表4可看出，V細∶V酵∶V霉=1.6∶2.7∶5.7時，油酸甲酯與α-亞麻酸甲酯的真實值與預測值之間的誤差大于10%，而另外2個組中的5種不飽和脂肪酸的真實值與預測值之間的誤差均小于10%。當V細∶V酵∶V霉=1.9∶1.9 ∶6.2時，α-亞麻酸甲酯的含量比V細∶V酵∶V霉=1.7∶3.9∶4.4中的含量較高。綜合考慮，最終選擇V細∶V酵∶V霉=1.9∶1.9∶6.2為優(yōu)化的結果。

3　結論

通過采用新型的Kriging代理模型優(yōu)化方法對酒曲微生物混菌比例進行優(yōu)化，通過建立的模型優(yōu)化找到幾組預測精度高的混菌比例結果，將得到的預測比例進行驗證實驗，最終選取得到混菌比例中的各不飽和脂肪酸含量與預測值中的含量進行相對誤差偏差計算，誤差低于10%，便說明此方法成立，優(yōu)化可行。最后通過驗證實驗得到V細∶V酵∶V霉=1.9∶1.9∶6.2，為大曲浸提液實驗組的最終優(yōu)化結果?？傊?，本實驗利用建立Kriging模型方法來優(yōu)化生物類問題，是比較創(chuàng)新的一種思路和方法。此方法相對響應面優(yōu)化來說可以實現(xiàn)多目標優(yōu)化，提高了優(yōu)化效率，在精準度方面也比其更精準仔細。另外，把工程方面的計算方法應用在農(nóng)學、生物學等學科有時也是可行的，同時也促進了學科知識系統(tǒng)領域間的相互借鑒和融合。

表3　大曲浸提液組優(yōu)化預測結果

表4　大曲浸提液組驗證實驗結果

［1］郭坤亮.茅臺酒釀造微生物的生物多樣性成因及研究價值的探討［J］.釀酒，2002，29（2）：36-38.

［2］周靖，吳天祥.醬香大曲中紅曲霉的篩選及其酶活性能研究［J］.釀酒科技，2013（10）：24-26.

［3］唐麗江，王振華，王迪.高產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌菌株的篩選［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37（12）：5362-5363.

［4］王敏，朱會霞，孫金旭，等.高溫酵母的分離及其特性研究［J］.中國釀造，2006（11）：38-41.

［5］宋瑤，繆禮鴻，高素芹，等.耐高溫酒精酵母菌株的篩選及發(fā)酵能力比較［J］.中國釀造，2009（5）：38-41.

［6］熊子書.中國釀酒酵母菌的研究［J］.釀酒科技，2002（4）：23-27.

［7］程光勝.中國酒曲微生物利用的發(fā)展現(xiàn)狀［J］.釀酒科技，2014 （3）：122-124.

［8］王世農(nóng).傳統(tǒng)白酒酒曲微生物的研究進展［J］.遼寧師專學報，2012，14（1）：14-17.

［9］榮瑞金，李祖明，王德良，等.中國酒曲微生物研究進展［J］.中國釀造，2009（6）：5-8.

［10］黃發(fā)琳，王化斌.談中國白酒與健康的關系［J］.釀酒，2013，40 （5）：14-19.

［11］楊濤，李國友，吳林蔚，等.中國白酒健康因子的研究及其產(chǎn)生菌選育和在生產(chǎn)中的應用（I）中國白酒健康因子的研究［J］.釀酒科技，2010（12）：65-69.

［12］范文來，徐巖.白酒功能因子與品質(zhì)安全問題［J］.釀酒科技，2012（3）：17-22.

［13］唐賢華，楊官榮，黃志瑜，等.中國白酒與人體健康關系研究綜述［J］.釀酒，2014，41（5）：10-12.

［14］徐巖，范文來，葛向陽，等.科學認識中國白酒中的生物活性成分［J］.釀酒科技，2013（9）：1-6.

［15］范文來，胡光源，徐巖.頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測定藥香型白酒中萜烯類化合物［J］.食品科學，2012，33（14）：110-115.

［16］廖靈旋，于昊，黃建忠.多不飽和脂肪酸合成途徑研究進展［J］.微生物學雜志，2014，34（3）：80-85.

［17］吳天祥，田志強.品鑒貴州白酒［M］.北京：北京理工大學出版社，2012：28-30.

［18］Jin R，Chen W，Simpson T W.Comparative studies of metamodeling techniques under multiple modelling criteria ［J］.Struct Multidisc Optim，2001，23：1-13.

［19］Simpson T W，BookerAJ，Ghosh D.Approximation methods in multi-disciplinary analysis and optimization:a panel discussion［J］.Struct Multidisc Optim，2004，27：302-313.

［20］Jones D R，Schonlau M，Welch W J.Efficient global optimization of expensive black-box functions［J］.Journal of Global Optimization，1998，13：445-492.

［21］Wang H，Wang S P，Tomovic M M.Modified sequential Kriging optimization for multidisciplinary complex product simulation［J］.Chinese Journal of Aeronautics，2010，5：616-622.

［22］Jones D R，Schonlau M，Welch W J.Efficient global optimization of expensive black-box functions［J］.J Global Optim.1998，13：445-492.

［23］周香，陳文琳，王曉花，等.基于Kriging代理模型和遺傳算法的注塑件翹曲優(yōu)化［J］.塑性工程學報，2015，22（2）：142-147.

［24］黃尊地，梁習鋒，鐘睦.基于Kriging模型的擋風墻優(yōu)化設計［J］.中南大學學報，2011，42（7）：2052-2155.

［25］李麗萍，韓濤.富含α-亞麻酸植物資源的開發(fā)與利用［J］.食品科學，2007，28（11）：614-617.

［26］魏決，付忠旭，申毓晗，等.α-亞麻酸特異性脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選和誘變初探［J］.食品科學，2006，27（1）：105-107.

［27］徐春明，劉金龍.β-環(huán)糊精包合法純化紫蘇籽油中的α-亞麻酸［J］.食品科學，2012，33（24）：132-136.

［28］陶國琴，李晨.α-亞麻酸的保健功效及應用［J］.食品科學，2000，21（12）：140-143.

Optimization of Mixed Ratio of Microbial Strains to Produce Unsaturated Fatty Acids Based on Kriging Model

LIU Xin1，2，WU Tianxiang1，ZHAO Qunli1，ZHU Junjie1and WU Caiyun1
（1.School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025；2.Guizhou Institute of Light Industry，Guiyang，Guizhou 550007，China）

Kriging model，as a commonly-used optimization method in engineering calculation field，its accuracy could be improved effectively by selecting dynamic points.This method is featured by high precision in the optimization of multiple targets.In the experiment，ten groups of microbial strains of different mixed ratio（Vbacteria∶Vyeast∶Vmold=1∶0∶0，0∶0∶1，0∶1∶0，1∶1∶1，4∶4∶2，4∶2∶4，2∶4∶4，2∶2∶6，2∶6:∶2，6∶2∶2）were set up，7 d after mixed liquid fermentation，the Kriging models had been established with the content of five kinds of unsaturated fatty acids after esterification（fourteenolefinic acid methyl，palm methyl oleate，methyl oleate，linoleic acid methyl ester，alpha linolenic acid）as the basic points.The optimized Kriging models were then verified in three groups（mixed ratio of Vbacteria∶Vyeast∶Vmold=1.6∶2.7∶5.7，1.7∶3.9∶4.4，1.9∶1.9∶6.2）.As the deviation of predicted values and real values was less than 10%，the model was feasible.In conclusion，the mixed ratio Vbacteria∶Vyeast∶Vmold=1.9∶1.9∶6.2 was the best choice in practice.

Kriging model；mixed microbial strains；liquid-state fermentation；unsaturated fatty acids；ratio optimization

TS262.1；Q93-3；TS262.3

A

1001-9286（2016）09-0023-05

10.13746/j.njkj.2016192

董香型白酒工藝創(chuàng)新技術合作項目。

2016-05-31

劉昕（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術，E-mail：6123755@qq.com。

吳天祥（1965-），男，博士，教授，碩士生導師，研究方向為發(fā)酵工程，E-mail：ce.txwu@gzu.edu.cn。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-08-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160803.1038.008.html。