楊 帥， 閔凡祥， 高云飛， 郭 梅， 王文重， 魏 琪， 董學(xué)志， 呂典秋*

(1. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江哈爾濱 150030；2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后工作站，黑龍江哈爾濱 150001)

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環(huán)境因子對馬鈴薯致病立枯絲核菌AG-3融合群生長的影響

楊 帥1,2， 閔凡祥1， 高云飛1， 郭 梅1， 王文重1， 魏 琪1， 董學(xué)志1， 呂典秋1,2*

(1. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江哈爾濱 150030；2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后工作站，黑龍江哈爾濱 150001)

[目的] 研究環(huán)境因子對馬鈴薯致病立枯絲核菌AG-3融合群生長狀況的影響，以明確黑龍江省馬鈴薯立枯絲核菌的環(huán)境適應(yīng)性，為該病害的防治提供理論依據(jù)。[方法] 采用生長速率法對立枯絲核菌菌絲在不同溫度、pH、光暗條件下的生長狀況進(jìn)行測定。[結(jié)果] 菌絲在4 ℃條件下不能生長，適宜溫度為19～25 ℃，全暗和全光條件下最適生長溫度分別為22 和25 ℃，黑暗條件有利于菌絲生長；在pH 4～11時 菌絲均能生長，以pH 6～7時菌絲生長速度較快；當(dāng)熱激20 min以上時，其致死溫度為50 ℃。[結(jié)論] 綜合評價了環(huán)境因子對立枯絲核菌AG-3融合群生長的影響，同時耐熱性測定表明短暫熱激對菌絲生長有一定的促進(jìn)作用，但當(dāng)時間過長或溫度過高時會嚴(yán)重抑制菌絲的生長。

馬鈴薯；立枯絲核菌；環(huán)境因子；生長

由立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起的馬鈴薯潰瘍病和黑痣病是馬鈴薯生產(chǎn)上最具威脅的土傳病害之一[1-2]，該病不僅在馬鈴薯苗期對芽眼、匍匐莖、地下莖等多個部位造成危害，引起潰瘍等癥狀，降低產(chǎn)量，而且可以在塊莖表面形成黑痣、裂口等癥狀，嚴(yán)重影響其后期的商品性，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]。近年來，隨著種植效益的提高和面積的不斷擴(kuò)大，馬鈴薯種植區(qū)重迎茬問題、缺少或忽視檢疫規(guī)范把關(guān)的種薯隨意調(diào)運(yùn)等問題，導(dǎo)致了該土傳病害在我國普遍發(fā)生，且危害逐年加重，嚴(yán)重影響著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

在我國，曾于1922和1932年分別在臺灣和廣東陸續(xù)發(fā)現(xiàn)過立枯絲核菌病[4]，但由于對馬鈴薯危害不重，并未引起人們的重視。之后，吉林、河北、內(nèi)蒙古、甘肅等省區(qū)雖也有過該病發(fā)生危害的記載，但未曾有過對該病的系統(tǒng)研究報道。近年來，國內(nèi)外對該病原菌的研究較多，包括生物學(xué)特性[5]、融合群類型[6]，以及病害流行、防治[7-8]等方面。目前，在代表著立枯絲核菌復(fù)合種中獨(dú)立進(jìn)化發(fā)展的融合群研究方面，國際公認(rèn)的已知融合群類型有14種，被命名為AG-1～AG-13和AG-BI[9-10]。其中，研究表明AG-3融合群是引起馬鈴薯立枯絲核菌病害的優(yōu)勢融合群[11-12]，田間發(fā)病率在大發(fā)生年份可達(dá)70%以上[13]。鑒于黑龍江省作為我國馬鈴薯種薯和商品薯生產(chǎn)基地的重要地位，以及馬鈴薯立枯絲核菌病害研究匱乏的現(xiàn)狀，筆者選取馬鈴薯主要致病融合群AG-3，研究溫度、光照和pH 3個環(huán)境因子對其生長狀況的影響，以明確黑龍江省馬鈴薯絲核菌的生長條件與環(huán)境的關(guān)系，為進(jìn)一步開展相關(guān)研究奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗材料供試病菌的分離與鑒定：2014～2015年于黑龍江省馬鈴薯主要生產(chǎn)田采集馬鈴薯潰瘍病和黑痣病樣品，采用常規(guī)組織分離法獲得病原立枯絲核菌，分別采用玻片對峙法和ITS區(qū)特異性引物PCR法進(jìn)行融合群測定后，選取部分純化的AG-3融合群菌株保存于4 ℃的PDA試管斜面上，備用。

供試菌餅的制備：將保存于斜面的供試菌種接種于PDA平板上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)至直徑約7 cm時，用直徑8 mm的打孔器切取菌落外緣制備成菌餅備用。

1.2試驗方法

1.2.1不同溫度對菌絲生長的影響。在生長良好的菌落邊緣用直徑8 mm的打孔器打取菌絲塊，接種于PDA平板上，設(shè)置4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34 ℃共計11個溫度梯度，將打孔器制備好的5 mm菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中心處，分別在全光和全暗條件下，于恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑。每處理3次重復(fù)。

1.2.2不同pH對菌絲生長的影響。將PDA培養(yǎng)基滅菌后，在無菌條件下用NaOH和HCl溶液將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)節(jié)至3、4、5、6、7、8、9、10、11、12共計10個pH梯度，將打孔器制備好的8 mm菌餅(25 ℃)接種于上述PDA培養(yǎng)基中心處，分別在全光和全暗條件下，于恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑。每處理3次重復(fù)。

1.2.3不同光照對菌絲生長的影響。在生長良好的菌落邊緣用直徑8 mm的打孔器打取菌絲塊，接種于PDA平板上,置于全光照、12 h光暗交替、全黑暗3種條件下，分別于19、22、25 ℃恒溫培養(yǎng)，2 d后用十字交叉法測量菌落直徑。每處理3次重復(fù)。

1.2.4綜合環(huán)境因子對菌絲生長的影響。選取7個溫度梯度(13、16、19、22、 25、28、31 ℃)和5個pH(6、7、8、 9、10)的處理組合，在連續(xù)光照和連續(xù)黑暗條件下于恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)對立枯絲核菌的生長情況進(jìn)行測定。菌餅制備和培養(yǎng)方法同上。當(dāng)菌餅被培養(yǎng)2 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑。每處理3次重復(fù)。

1.2.5菌絲致死溫度的測定。用8 mm打孔器在活化好的菌落邊緣打孔，將菌絲塊置于5 mL無菌離心管中，加入2 mL無菌水,分別在35、40、45、50、55、60和65 ℃共7個溫度設(shè)置的水浴鍋中處理10、15、20 min后取出離心管迅速冷卻,在25 ℃無菌條件下將菌絲塊取出置于PDA平板上培養(yǎng)，3 d后觀察其生長情況。每處理3次重復(fù)。1.2.6數(shù)據(jù)分析。選用DPS 7.05和Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。相關(guān)計算公式為：菌絲生長量=處理菌絲直徑-接種菌餅直徑

相對生長量=處理菌絲直徑-對照菌絲直徑

2　結(jié)果與分析

2.1不同溫度對菌絲生長的影響由圖1可知，在全暗培養(yǎng)條件下，除4 ℃時菌絲不生長外，7～34 ℃時菌絲均能生長，其中13～28 ℃時生長較快，22 ℃時生長最快，菌絲生長量為49.5 mm。在全光培養(yǎng)條件下，菌絲在4和34 ℃時均不生長，16～25 ℃時生長快速，25 ℃時生長最快，28 ℃時生長速度明顯降低。

圖1　不同溫度對菌絲生長的影響Fig.1　Effects of temperature on mycelial growth of Rhizoctonia solani

2.2不同pH對菌絲生長的影響由圖2可知，除pH為3和12時，菌絲不能生長外，在pH 4～11時菌絲生長情況差異明顯，在pH為6～8時菌絲生長速度相對較快。在全暗和全光條件下，2 d后菌落直徑分別達(dá)到36.5～44.5 和41.5～46.5 mm?？傮w來說，中性及偏堿性條件較有利于菌絲生長。

圖2　不同pH對菌絲生長的影響Fig.2　Effects of pH value on mycelial growth of Rhizoctonia solani

2.3不同光照對菌絲生長的影響由圖3可知，除25 ℃全暗條件下菌絲生長較慢外，均為全暗處理生長最快，其次是光暗交替處理，最后是全光處理。除22 ℃條件下，全光處理和光暗交替處理多重比較差異不顯著外，其他處理在0.05水平均差異顯著。

圖3　不同光照對菌絲生長的影響Fig.3 　Effects of different light condition on mycelial growth of Rhizoctonia solani

2.4綜合環(huán)境因子對菌絲生長的影響由圖4可知，在所設(shè)溫度范圍內(nèi)，總體上pH 6、7和8條件下菌絲生長量要高于其他pH處理，最佳生長pH為6和7，多重比較差異顯著(圖4-A和4-C，P<0.05)。同時，在設(shè)定pH條件下，菌絲生長測定結(jié)果表明，31 ℃處理的菌絲生長最為緩慢，在全暗條件下較好的生長溫度為19和22 ℃(圖4-B，P<0.05)，在全光條件下較好的生長溫度為22和25 ℃(圖4-D，P<0.05)。綜上，當(dāng)溫度為19～25 ℃、pH在6～7 時，是菌絲生長較佳的環(huán)境條件。

注：圖中(A)和(B)分別為全暗條件下溫度和pH對菌絲生長的影響，(C)和(D)分別為全光條件下溫度和pH對菌絲生長的影響。圖中不同的小寫字母為多重比較結(jié)果(P < 0.05)。Note: (A) and (B) were the mycelial growth influenced by temperature and pH under dark condition, (C) and (D) were the mycelial growth influenced by temperature and pH under light condition. Different lowercases were the results of multiple comparisons (P<0.05). 圖4　 綜合環(huán)境因子對菌絲生長的影響Fig. 4　Effects of environmental factors on mycelial growth of Rhizoctonia solani

2.5菌絲生長致死溫度的測定結(jié)果從設(shè)定溫度處理分析，55～65 ℃熱激條件下，菌絲均不能生長。從設(shè)定熱激時長分析，在熱激20 min條件下，菌絲經(jīng)50 ℃處理2 d后不能生長，其他熱激時長下，菌絲經(jīng)35～50 ℃處理后均能在25 ℃條件下生長。由圖5-A和5-B可知，除50 ℃菌絲生長速度受到抑制外，短暫熱激10～15 min對菌絲生長均有不同程度的促進(jìn)作用，菌絲生長速度超過對照，不同菌株之間生長量不同。由圖5-C可知，在熱激20 min以上時，不同菌株間菌絲生長均變緩慢。

注：圖中(A)、(B)和(C)分別為熱激10、15和20 min時不同溫度下菌絲的相對生長量。Note: (A), (B) and (C) were the relative mycelial growthes affected by different temperatures under the condition of 10, 15, 20 min respectively.圖5　不同熱激時長下溫度處理對立枯絲核菌菌絲生長的影響Fig. 5　Effects of different heat shock time and temperature on mycelial growth of Rhizoctonia solani

3　結(jié)論與討論

立枯絲核菌作為世界性分布的一種土壤習(xí)居菌，因具有侵染范圍廣、腐生競爭能力強(qiáng)、存活時間長且難于防治等特點(diǎn)，一直以來都被認(rèn)為是最具破壞性的土傳植物病原菌之一。目前關(guān)于立枯絲核菌生物學(xué)特性研究的報道很多，但主要集中在20世紀(jì)80～90年代，且國內(nèi)外所得結(jié)果并不一致。如尤國信等[14]認(rèn)為禾谷絲核菌生長溫度在2.5～34.0 ℃，最適溫度為23.0 ℃，但趙桂東等[15]對侵染大豆、水稻、玉米、大麥、棉花的絲核菌的菌絲最適生長溫度研究表明，上述5種絲核菌的最適生長溫度均不相同。同時，張穗[16]對不同融合群絲核菌生長溫度的研究表明，不同融合群類型對溫度的適應(yīng)性不同，最適生長溫度也相差較大。在馬鈴薯絲核菌的生物學(xué)研究方面，李乾坤等[5]研究得出絲核菌生長溫度范圍是4～34 ℃，最適生長溫度為23 ℃，而日本學(xué)者M(jìn)oromizato等[17]研究表明絲核菌生長溫度為5～40 ℃，最適生長溫度為25 ℃。因此，有針對性地開展生物學(xué)特性研究有助于明確黑龍江省優(yōu)勢致病融合群的生長條件與環(huán)境的關(guān)系，為進(jìn)一步開展相關(guān)研究奠定理論基礎(chǔ)。

生存環(huán)境是病原菌賴以生存的前提基礎(chǔ)，對環(huán)境條件的適應(yīng)性和耐受性也是決定著病原菌能否順利完成侵染、流行的關(guān)鍵因素。筆者針對溫度、pH和光照對馬鈴薯致病立枯絲核菌AG-3融合群菌絲生長的影響開展研究，結(jié)果表明，在不同光照條件下，菌絲生長狀況略有不同，全暗條件更有利于菌絲生長，除4 ℃時菌絲不生長外，其他溫度條件下均能生長，適宜溫度為19～25 ℃。這一結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致，如Anguiz等[18]和Ritchie等[19]分別于1989和2009年報道的AG-3融合群在試管和培養(yǎng)皿中的最適生長溫度均為20～25 ℃。同時，在pH研究方面，該試驗結(jié)果表明pH為4～11時，菌絲能夠生長但不同pH間差異明顯，其中pH為6～7時菌絲生長速度相對較快，是AG-3融合群菌絲生長的適宜條件。這一結(jié)果與劉寶玉等[20]的研究結(jié)果一致，但相對于Ritchie等[19]報道的最適pH為5.6要略高一點(diǎn)。

在立枯絲核菌耐熱性研究方面，國內(nèi)外的相關(guān)報道較少。其中，劉志恒等[21-22]對甜瓜果腐病病原立枯絲核菌的生物學(xué)特性研究表明，在10 min熱激條件下其致死溫度為50 ℃。臺蓮梅等[23]報道的馬鈴薯立枯絲核菌在10 min熱激條件下的菌絲致死溫度為49 ℃。筆者等也針對菌絲的耐熱性開展了初步研究，結(jié)果表明，菌絲在50 ℃條件下熱激10和15 min時菌絲仍可以生長，只是與對照相比非常緩慢，只有在熱激20 min時50 ℃才成為其致死溫度。因此，該研究發(fā)現(xiàn)短暫熱激在一定程度上有促進(jìn)菌絲生長的作用，當(dāng)時間過長或溫度過高時會對菌絲生長產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制作用。該研究結(jié)果在熱激時間上與前人報道存在差異，可能與試驗菌株來源不同有關(guān)。因長期處于不同的生態(tài)環(huán)境，為了更好地適應(yīng)不同的生態(tài)環(huán)境，不同融合群之間以及同一融合群的不同菌株間可能通過生理生化、表觀遺傳等方式造成它們在生物學(xué)特性方面的各種差異，這部分工作還有待于進(jìn)一步研究。

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Influence of Environmental Factors on Growth Status of AG-3 for Potato PathogenicRhizoctoniasolani

YANG Shuai1,2, MIN Fan-xiang1, GAO Yun-fei1, LV Dian-qiu1,2*et al

(1. Virus-free Seedling Research Institute, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin, Heilongjiang 150030; 2. Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences Postdoctoral Programme, Harbin, Heilongjiang 150001)

[Objective] The aim was to study effects of environmental factors on the growth status of anastomosis group AG-3, to determine environmental adaptation ofRhizoctoniasolanifrom Heilongjiang Province, which provides a theoretical basis for control of the disease. [Method] The growth status ofRhizoctoniasolaniunder different conditions of temperature, pH and light was determined by growth rate method. [Result] The mycelium could grow under the setting temperature except 4 ℃, the optimal temperature was 19-25 ℃, and the fastest growth under the condition of dark and light was 22 and 25 ℃ respectively, and the growth of mycelia was accelerated by darkness. The range of pH was 4-11, and the optimal pH for growth was 6-7. Meanwhile, the lethal temperature was 50 ℃ after heat shocking more than 20 minutes. [Conclusion] The effect of environmental factors on the mycelial growth of AG-3 is comprehensively evaluated, and determination of heat resistance indicates that there is a promotion on mycelial growth by heat shocking when the time and temperature is not too long or too high.

Potato;Rhizoctoniasolani; Environmental factors; Growth

科技部“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃研究項目(2012BAD06B02)；國際合作項目“中挪馬鈴薯土傳有害生物監(jiān)控技術(shù)合作研究”(2013DFA31970)；黑龍江省農(nóng)科院“引進(jìn)博士人才科研啟動金”項目(201507-15)。

楊帥(1982- )，男，黑龍江牡丹江人，助理研究員，博士，從事馬鈴薯真菌病害研究。*通訊作者，研究員，從事馬鈴薯栽培生理和生物技術(shù)研究。

2016-07-13

S 435.32

A

0517-6611(2016)24-151-04