劉 佳， 丁青霞， 高 菊

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650500)

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普洱茶多酚的提取及提取工藝響應(yīng)面分析

劉 佳， 丁青霞， 高 菊*

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650500)

[目的] 優(yōu)化普洱茶中茶多酚的提取工藝條件。[方法]以購(gòu)自云南省臨滄市的普洱茶為原料，以總多酚提取率為優(yōu)化目標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面分析法分析乙醇濃度、浸提時(shí)間、浸提溫度和料液比對(duì)普洱總茶多酚提取的影響。[結(jié)果]確認(rèn)普洱茶中茶多酚提取最佳工藝為浸提時(shí)間1 h、浸提溫度90 ℃、料液比1∶25 g/ mL、乙醇濃度75%。實(shí)際測(cè)得的茶多酚得率為17.048 7%，和模型預(yù)測(cè)值相符。[結(jié)論] 研究可為普洱茶中茶多酚的工業(yè)化提取生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

普洱茶多酚；響應(yīng)面分析；提取工藝

茶多酚(Tea Polyphenols，TP)是茶內(nèi)多酚類化合物的統(tǒng)稱，有很多成分是茶葉所特有的，這些物質(zhì)共同組成了茶葉獨(dú)特的風(fēng)味和功效。茶多酚大部分為黃酮類化合物，最主要的是以兒茶素及其衍生物為主體的黃烷醇類，其含量約占茶多酚類的70%～80%，最主要有4種兒茶素組分，分別是表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)、表兒茶素(EC)[1]。

茶多酚的提取方法有很多種，一是利用茶多酚在不同有機(jī)溶液中溶解度不同的性質(zhì)采用溶劑提取工藝[3]。二是金屬離子鹽沉淀茶多酚工藝，即把茶葉水溶液或乙醇溶液在堿性環(huán)境下和沉淀劑生成沉淀，從而固定住茶多酚。多數(shù)中性鹽能夠利用靜電作用減弱多酚水中的溶解，讓多酚沉淀下來(lái)；同時(shí)中性鹽能夠因本身的電解質(zhì)性質(zhì)使多酚膠體去電去溶劑化，使得多酚鹽溶液鹽析[4]。絡(luò)合后的多酚由于電子軌道躍遷導(dǎo)致光吸收區(qū)出現(xiàn)變化，從而發(fā)生顏色變化，因此多酚類的金屬絡(luò)合物都有較鮮艷的顏色[5]。三是過(guò)柱層析分離提取茶多酚[6]，包括吸附柱層析、凝膠柱層析、離子交換柱層析等方法，而且過(guò)柱層析法提取茶多酚用料少，獲得的茶多酚純度較高，缺點(diǎn)是試驗(yàn)成本高。四是超臨界流體萃取法提取茶多酚[7]，和以上其他方法對(duì)比，超臨界流體萃取法提取茶多酚具有高速高效、溶劑消耗少、無(wú)殘留等特點(diǎn)，一般超臨界流體提取茶多酚使用的萃取劑是二氧化碳。

筆者綜合考慮茶多酚的物理化學(xué)性質(zhì)，為了能夠從原料中得到更多的茶多酚，采用的是溶劑提取茶多酚工藝和金屬離子鹽沉淀茶多酚工藝相結(jié)合的方法。該方法利用碳酸鈉鹽的電解質(zhì)屬性，增強(qiáng)茶多酚的析出；同時(shí)，利用茶多酚易溶于乙醇溶液和乙酸乙酯，而不溶于氯仿的性質(zhì)來(lái)分離提純茶多酚。茶葉中的咖啡堿易溶于氯仿，也能通過(guò)這個(gè)方法使茶多酚和咖啡堿分離，得到純度較高的茶多酚。

1　材料與方法

1.1方法原理茶葉粉末中蛋白質(zhì)等化合物不易溶于乙醇溶液，茶多酚和咖啡堿等都易溶于乙醇溶液，利用這一特性可以從茶葉粉末乙醇浸提液中分離大量茶多酚和咖啡堿，并將蛋白質(zhì)等去除。茶葉乙醇浸提液中的茶多酚易溶于乙酸乙酯，咖啡堿易溶于氯仿，根據(jù)這一個(gè)特性來(lái)分離茶多酚和咖啡堿。

1.2材料主要儀器：三口燒瓶、分液漏斗，蜀牛公司；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科技儀器有限公司；冷凝管、膠管、電動(dòng)水泵等冷凝設(shè)備；真空抽濾機(jī)；恒溫水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；電動(dòng)打粉機(jī)；紫外分光光度計(jì)。

主要原料及試劑：普洱茶，購(gòu)自云南省臨滄市茶葉市場(chǎng)；碳酸鈉(Na2CO3)，各濃度乙醇溶液，氯仿，乙酸乙酯，酒石酸亞鐵溶液，磷酸鹽緩沖液。

1.3普洱茶多酚提取工藝

1.3.1茶葉粉碎。取茶葉若干，稍微搗碎后放入電動(dòng)打粉機(jī)，粉碎時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)以免打粉機(jī)刀片溫度過(guò)高使茶葉粉末燒焦，應(yīng)該短時(shí)間打粉(1 min左右)，關(guān)機(jī)后搖動(dòng)，再開(kāi)機(jī)打粉。以上步驟重復(fù)數(shù)次直至茶葉粉末足夠細(xì)。

1.3.2普洱茶多酚浸提。取乙醇溶液加入三口燒瓶?jī)?nèi)，稱取一定質(zhì)量粉碎的茶葉，加入20%的碳酸鈉粉末后放入裝有不同濃度的乙醇溶液中，充分搖勻，加上冷凝管放入恒溫水浴鍋中冷凝回流水浴浸提一段時(shí)間。

1.3.3普洱茶多酚濃縮。浸提后的提取液傾出，使用真空抽濾抽干殘留的提取液，提取過(guò)的茶葉渣使用少量的酒精溶液沖洗，清洗液和之前的提取液一起倒入圓底燒瓶，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮提取液體積到原來(lái)體積的1/3左右，這時(shí)候大部分乙醇溶液被蒸發(fā)出來(lái)，提取液中剩下主要成分為水，方便下一步氯仿的萃取分離。

1.3.4普洱茶多酚的萃取分離。將上一步的濃縮提取液冷卻至室溫，倒入分液漏斗中，加入等量的氯仿溶液萃取3次。此步驟中濃縮的提取液必須降溫后再分液，否則會(huì)導(dǎo)致氯仿容易乳化，影響分離效果。上層為水層和茶多酚層，萃取時(shí)間30 min。將水層加入等體積的乙酸乙酯萃取2次，每次20 min。合并萃取液，旋蒸儀蒸干，回收乙酸乙酯。用藥匙刮下圓底燒瓶?jī)?nèi)的茶多酚結(jié)晶，稱量重量，計(jì)算得率，收集在密封袋中避光保存。

1.3.5茶多酚的測(cè)定。準(zhǔn)確稱取所制得的干燥粉末0.1 g，定容至100 mL水溶液備用。準(zhǔn)確吸取1 mL上述備用溶液置于25 mL的容量瓶中，加水4 mL，酒石酸亞鐵溶液5 mL，然后加pH 7.5的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，用蒸餾水做空白對(duì)照，在波長(zhǎng)540 nm的條件下，用分光光度計(jì)測(cè)出其吸光度，計(jì)算出茶多酚的含量[5]。

2　結(jié)果與分析

2.1影響普洱茶多酚提取的單因素分析

2.1.1浸提時(shí)間對(duì)普洱茶多酚提取率的影響。精確稱取普洱茶粉末5 g，固定乙醇濃度為60%，料液比為1∶30 g/mL，提取溫度為70 ℃，考察不同的浸提時(shí)間0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 h對(duì)提取普洱茶茶葉總多酚的影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在浸提時(shí)間1.25 h時(shí)茶多酚得率最高，初步認(rèn)定浸提時(shí)間1.25 h可以作為合適的提取時(shí)間。

2.1.2浸提溫度對(duì)普洱茶多酚提取率的影響。精確稱取普洱茶粉末5 g，固定乙醇濃度為60%，料液比為1∶30 g/mL，提取時(shí)間為1.25 h，考察不同的浸提溫度50、60、70、80、90 ℃對(duì)提取普洱茶茶葉總多酚的影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在浸提溫度為80

℃時(shí)普洱茶多酚得率最高，初步認(rèn)定最佳浸提溫度為80 ℃。

2.1.3料液比對(duì)普洱茶多酚提取率的影響。精確稱取普洱茶粉末5 g，固定乙醇濃度為60%，浸提溫度為80 ℃，提取時(shí)間為1.25 h，考察不同的料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶30和1∶40 g/mL對(duì)提取普洱茶茶葉總多酚的影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在料液比為1∶30 g/mL時(shí)普洱茶多酚得率最高，初步認(rèn)定最佳浸提料液比為1∶30 g/mL。

2.1.4乙醇濃度對(duì)普洱茶多酚提取率的影響。精確稱取普洱茶粉末5 g，固定浸提時(shí)間為1.25 h，料液比為1∶30 g/mL，提取溫度為70 ℃，考察不同的乙醇濃度15%、30%、45%、60%、75%對(duì)提取普洱茶茶葉總多酚的影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，茶多酚在乙醇濃度60%得率最高，初步認(rèn)定浸提乙醇濃度60%可以作為合適的提取濃度。

2.2影響普洱茶多酚提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)以上單因素試驗(yàn)獲得最佳的提取條件為基礎(chǔ)，選取浸提時(shí)間(A)、浸提溫度(B)、料液比(C)、乙醇濃度(D)幾個(gè)工藝因素，通過(guò)應(yīng)用Box-Behnken中心組合進(jìn)行4因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。其中，響應(yīng)面的因素水平編碼見(jiàn)表1，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　響應(yīng)面因素水平編碼

表2　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

接下表

2.4最優(yōu)工藝條件的確定根據(jù)回歸模型繪制響應(yīng)曲面圖，并分析各提取因素對(duì)茶多酚提取率的影響，見(jiàn)圖1。研究發(fā)現(xiàn)，B、D、BC、A2、D2之間存在相互影響。

注：浸提時(shí)間1.25 h,乙醇濃度60%。 Note: Extraction time is 1.25 h,ethanol concentration 60%.圖1　不同因素對(duì)茶多酚得率的響應(yīng)面Fig.1　Response surface of different factors on the yield of tea polyphenols

通過(guò)回歸方程分析可知，茶多酚得率達(dá)到最高時(shí)的最優(yōu)工藝條件如圖2所示：浸提時(shí)間0.97 h、浸提溫度89.42 ℃、料液比1∶25.44 g/mL、乙醇濃度74.52%，預(yù)測(cè)茶多酚的得率為17.463 3%。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)回歸模型的可靠性，采用接近上述茶多酚得率最優(yōu)工藝條件進(jìn)行6次試驗(yàn)，并取其平均值。實(shí)際試驗(yàn)條件為浸提時(shí)間1.00 h、浸提溫度90 ℃、料液比1∶25 g/mL、乙醇濃度75%,實(shí)際測(cè)得的茶多酚得率為(17.048 7±1.12)%，和預(yù)測(cè)得率十分接近。

注：乙醇濃度74.52%。Note: Ethanol concentration is 74.52%.圖2　最佳工藝條件立方圖Fig.2　Cube of the optimal technological conditions

3　結(jié)論與討論

茶多酚具有高效抗氧化能力，對(duì)人體有明顯的保健作用，也是一種比較常見(jiàn)的食品添加劑。茶多酚能夠抑制絡(luò)氨酸酶活性，減少黑色素生成[9]，還能對(duì)骨質(zhì)疏松癥有一定的預(yù)防和輔助治療的效果[10]，更具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗輻射、抗高血脂等功效[11]。該研究利用茶葉乙醇浸提液中的茶多酚易溶于乙酸乙酯，咖啡堿易溶于氯仿的原理，通過(guò)試驗(yàn)確認(rèn)普洱茶多酚提取實(shí)際條件下最佳工藝為浸提時(shí)間1.00 h、浸提溫度90 ℃、料液比1∶25 g/mL、乙醇濃度75%。實(shí)際測(cè)得的茶多酚得率為17.048 7%，和模型預(yù)測(cè)值相符。該試驗(yàn)中茶多酚得率比謝貞建等使用微波輔助提取茶多酚的方法要高[12]。該研究第一次得到臨滄茶區(qū)普洱茶茶多酚提取不同因素的響應(yīng)面分析圖，根據(jù)分析圖得到茶多酚優(yōu)化提取方案，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

[1] 朱斌,盧濤,蘭先秋,等.不同工藝對(duì)茶多酚提取效率和質(zhì)量的影響研究[J].四川職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2008，18(1):126-128.

[2] 董文賓,胡英,周玲.有機(jī)溶劑法制備茶多酚的工藝研究[J].中外食品加工技術(shù),2003(5):44-47.

[3] 鄧澤元,劉娟,肖艷玉,等.金屬鹽沉淀法提取茶多酚影響因素的研究[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(工科版),2001,23(3):92-98.

[4] 嚴(yán)明潮,羅明志.鹽析對(duì)兒茶素提取的影響[J].中國(guó)茶葉,1999(4):29.

[5] 邢其毅.基礎(chǔ)有機(jī)化學(xué)[M].北京：高等教育出版社，1994.

[6] 盧濤,蘭先秋,朱斌,等.不同茶多酚中兒茶素的測(cè)定及柱層析法提取EGCG的比較[J].化工進(jìn)展,2008,27(5):749-752.

[7] 于基成,金莉,薄爾琳,等.超臨界CO2萃取技術(shù)在茶多酚提取中的應(yīng)用[J].食品科技,2007,32(1):85-87.

[8] 王恒松,呂新勇,喻世濤,等.普洱茶中茶多酚和茶多糖的提取工藝研究[J].湖北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007，29(3):277-279.

[9] 汪建,楊長(zhǎng)福,王和生,等.茶多酚經(jīng)皮給藥對(duì)小鼠皮膚中酪氨酸酶活性的影響[J].中藥藥理與臨床,2013(4):82-83.

[10] 車(chē)曉明,陳亮,顧勇,等.茶多酚治療骨質(zhì)疏松癥的研究進(jìn)展[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志,2015(2):235-240.

[11] 張曉夢(mèng),倪艷,李先榮.茶多酚的藥理作用研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究,2013,36(2):157-160.

[12] 謝貞建,趙超群,鄒聯(lián)柱,等.普洱茶多酚的提取及抗氧化作用研究[J].食品與機(jī)械,2009,25(1):64-67.

Extraction of Polyphenols from Pu’er Tea and Analysis of Extraction Process Response Surface

LIU Jia,DING Qing-xia,GAO Ju*

(Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming,Yunnan 650500)

[Objective] The aim was to optimize conditions for extracting polyphenols from Pu’er tea.[Method] With Pu’er tea from Lincang City,Yunnan Province as raw materials, total polyphenol extraction rate as the optimization objective,on the basis of single factor experiment,effects of ethanol concentration,extraction time,extraction temperature and ratio of material to liquid on extraction of total polyphenols from Pu’er tea were analyzed by response surface analysis.[Result] The optimal conditions were as following: extraction time 1 h,extraction temperature 90 ℃,solid-liquid ratio 1∶25 g/mL,ethanol concentration 75%.The actual yield of polyphenol was 17.048 7%,which was in agreement with the predicted values.[Conclusion] The study can provide reference basis for industrial extraction and production of polyphenol in Pu’er tea.

Pu’er tea polyphenol; Response surface analysis; Extraction process

劉佳(1991- )，男，江西贛州人 ，碩士研究生，研究方向：茶次級(jí)代謝產(chǎn)物。*通訊作者，講師，博士，從事茶次級(jí)代謝產(chǎn)物研究。

2016-05-31

S 571.1

A

0517-6611(2016)24-088-03