張宇虹

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河南　新鄉(xiāng)　453007)

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重金屬鉻(Cr6+)脅迫對地黃幼苗生長影響的研究

張宇虹

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河南新鄉(xiāng)453007)

本研究以懷地黃苗為材料，采用組織培養(yǎng)法，探究了不同Cr6+濃度及脅迫時間對其幼苗株高、根莖葉生長狀況及生物量、死亡率的影響。結(jié)果表明：在給定脅迫時間下，低濃度的Cr6+(0.5 mmol/L)對懷地黃幼苗生長表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用，鮮重、干重、根長、葉片數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢，而高濃度Cr6+對幼苗生長表現(xiàn)出明顯的抑制作用。懷地黃幼苗在1 mmol/L Cr6+濃度下仍可以較好地生長，可見地黃對重金屬鉻毒害的抵抗能力較強(qiáng)。

鉻(Cr6+)脅迫；懷地黃幼苗；組織培養(yǎng)；生長

近年來，我國的重金屬污染日趨嚴(yán)重，分布范圍極其廣泛。經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展使得許多工礦企業(yè)迅速猛增，如金屬冶煉、機(jī)械加工、化工廠、農(nóng)藥廠等。這些高污染工業(yè)基地排出了大量的工業(yè)污水、礦渣、粉塵等，使得重金屬進(jìn)入到土壤、河流和環(huán)境當(dāng)中，重金屬污染日益嚴(yán)重[1]。土壤重金屬污染可影響農(nóng)作物及中草藥產(chǎn)量和質(zhì)量，并可通過食物鏈危害人類的健康。懷地黃是河南焦作(古懷慶府)地方特產(chǎn)，因地下部分的塊根呈現(xiàn)黃白色而得名，其塊根為傳統(tǒng)中藥亦是著名的四大懷藥之一。焦作市是河南省著名的老工業(yè)基地，礦業(yè)、制革工業(yè)、電化學(xué)工業(yè)發(fā)達(dá)，工業(yè)發(fā)展勢頭迅猛的同時重金屬污染尤為嚴(yán)重。重金屬鉻作為工業(yè)五毒之一，在焦作市礦區(qū)內(nèi)長期堆積、風(fēng)化遷移，是焦作地區(qū)土壤重金屬污染的重要來源之一。而制革工業(yè)是一個污染嚴(yán)重的產(chǎn)業(yè)，鉻因能使皮革柔軟富有彈性而被視為制革工業(yè)中不可缺少的皮革鞣劑。此外六價鉻還常在電化學(xué)工業(yè)中作為鉻酸使用。

鉻是一種強(qiáng)毒性重金屬，在人體內(nèi)蓄積不能被降解，進(jìn)入人體細(xì)胞后會對肝、腎等內(nèi)臟器官和遺傳物質(zhì)造成傷害，使蛋白質(zhì)和酶等失去活性并可能誘發(fā)基因突變，甚至致癌。目前，關(guān)于鉻對水稻[2-3]、玉米[4-5]、豆類[6-7]等多種植物的出芽及根生長發(fā)育的影響及其毒害機(jī)理已有報道，但鉻對中藥地黃的生長發(fā)育影響至今尚無研究報道。作為藥用價值主要在根部的懷地黃，鉻污染對懷地黃生長影響的研究有著重要意義。

本研究中，我們以懷地黃85-5品種的無菌苗為材料在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組培，研究了不同濃度鉻(Cr6+)對懷地黃幼苗生長的影響，為初步改善懷地黃的產(chǎn)量和品質(zhì)、早期預(yù)報工業(yè)鉻污染的危害、有效利用鉻污染土壤以及確定其對鉻的耐受能力等提供了有用的參考資料。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料和處理

供試材料為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的85-5地黃無菌苗，取其莖段接種于MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)室中培養(yǎng)35天后取生長狀況相對一致的幼苗莖段進(jìn)行鉻脅迫處理。以MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度為0.6%，pH值為5.8～6.2，在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量的重鉻酸鉀進(jìn)行處理，培養(yǎng)室溫度為25±1℃，光照強(qiáng)度為2 000 Ix，光照時間為14 h/d，RH=70%～80%。培養(yǎng)基中六價鉻離子濃度(鉻離子濃度以純鉻計)梯度設(shè)為0、0.5、1、2、3和5 mmol/L(其中0為對照組)共6個處理，每個處理3瓶，每瓶接5株幼苗。全程觀察記錄其生長變化情況，并在第21天取材測量其生長指標(biāo)。

1.2測定方法

株高測量是從莖基部一直測量到苗頂端，葉的測量是取每株幼苗的三個最大葉片測量后計算平均值，葉長取葉片的主脈長度，葉寬取葉片最寬處的長度，葉面積以葉長×葉寬表示。根長測量是取每株幼苗的三條最長根測量后計算平均值。根、莖、葉各組分分開分別測定鮮質(zhì)量，然后于烘箱中105℃烘5小時后測干質(zhì)量。由于3 mmol/L和5 mmol/L處理的幼苗脅迫21天時已經(jīng)死亡，故只對其生物量進(jìn)行了測量。

1.3數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2010統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。對于同組間數(shù)據(jù)的三次重復(fù)觀測分別計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。對于處理組，則用學(xué)生t檢驗(yàn)方法分別計算其與對照組差異的顯著性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過origin軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1Cr6+濃度和脅迫時間對懷地黃幼苗生長的總體影響

為研究Cr6+對地黃生長的影響，我們將地黃分為6組分別給予不同濃度的Cr6+進(jìn)行培養(yǎng)，并檢測不同Cr6+濃度和脅迫時間對懷地黃幼苗株高的影響。如圖1所示，當(dāng)Cr6+濃度低于2 mmol/L時，在脅迫的第1天到第10天對懷地黃幼苗生長無明顯影響。到脅迫的第21天，0.5 mmol/L、1 mmol/L處理的幼苗株高分別為對照的96.1%、86.2%。當(dāng)Cr6+濃度為2 mmol/L時，幼苗生長受到抑制，在第21天Cr6+濃度為2 mmol/L組株高為對照65.4%，極顯著低于對照組(p=0.005<0.01)，葉片枯萎率為42.2%，幼苗死亡率為20%；當(dāng)Cr6+濃度達(dá)到3 mmol/L時，懷地黃幼苗在整個過程中幾乎無生長，幼苗死亡率為100%。

圖1　Cr6+脅迫條件下懷地黃幼苗生長狀況

(A)不同Cr6+濃度處理?xiàng)l件下，植株第6、10、21天的生長狀況采樣。(B)不同Cr6+濃度處理對懷地黃幼苗株高的影響(第21天)(星號表示與對照組的差異顯著性。*：差異顯著；**：差異極顯著)。(C)不同Cr6+濃度脅迫條件下懷地黃幼苗的葉片枯萎率(第21天)。(D)不同Cr6+濃度脅迫條件下懷地黃幼苗的死亡率(第21天)。

2.2Cr6+濃度和脅迫時間對懷地黃幼苗根部的影響

地黃幼苗的根部決定地黃塊根的生物量，因而我們檢測了不同Cr6+濃度和脅迫時間對地黃幼苗根部的影響。當(dāng)Cr6+濃度小于2 mmol/L時，第1天到第10天懷地黃幼苗根部生長無明顯差別，第21天時0.5 mmol/L處理的幼苗根長跟對照組相比有顯著增加(3.75%，p<0.05)，根數(shù)有顯著減少(13.70%，p<0.05)。1 mmol/L處理的幼苗根長和根數(shù)則顯著減少(36.07%，28.53% ，p<0.05)。當(dāng)Cr6+濃度達(dá)到2 mmol/L時，第1天到第10天懷地黃幼苗根部幾乎無變化，第21天時測量的根長，根數(shù)和對照組相比有極顯著的減少(47.78%，62.13%，

圖2　不同Cr6+濃度脅迫條件對懷地黃根部的影響(第21天)

(星號表示與對照組的差異顯著性。*：差異顯著；**：差異極顯著)

p<0.01)。當(dāng)Cr6+濃度進(jìn)一步提高到3 mmol/L和5 mmol/L時，第10天時幼苗已經(jīng)出現(xiàn)部分枯萎壞死，第21天時幼苗已經(jīng)全部枯萎死亡。這表明當(dāng)Cr6+濃度較低時，其對根的生長影響相對較少，當(dāng)濃度達(dá)到2 mmol/L甚至更高時，Cr6+對幼根生長短時間內(nèi)即表現(xiàn)出極顯著的抑制作用。

2.3Cr6+濃度和脅迫時間對懷地黃幼苗葉片的影響

根據(jù)圖1A，脅迫第6天時，3 mmol/L和5 mmol/L Cr6+脅迫的幼苗葉片普遍偏黃綠色，葉片卷曲，干皺，有枯萎跡象；2 mmol/L Cr6+的幼苗有半數(shù)葉片開始發(fā)黃，葉片背部發(fā)黑，其它濃度幼苗正常生長。脅迫第10天，0.5、1 mmol/L Cr6+處理的幼苗中部分新生葉片也開始呈現(xiàn)出失綠現(xiàn)象。脅迫第21天，當(dāng)Cr6+濃度不超過1mmol/L時，前期的失綠現(xiàn)象已經(jīng)消失，葉片顏色恢復(fù)正常，葉數(shù)和葉寬與對照組無顯著差異，而葉片長度和面積均有所下降(圖3)。當(dāng)Cr6+濃度達(dá)到2 mmol/L時，葉數(shù)和對照組相比有顯著的減少(33.3%，p<0.05)，葉長、葉寬、葉面積的減少則達(dá)到極顯著水平。當(dāng)Cr6+濃度達(dá)到3 mmol/L時，葉的四種指標(biāo)均有(極)顯著下降，表明懷地黃幼苗葉片已經(jīng)無法進(jìn)行光合作用儲存物質(zhì)供機(jī)體生長。

圖3　不同濃度鉻脅迫對懷地黃葉片生長的影響(第21天)(星號表示與對照組的差異顯著性。*：差異顯著；**：差異極顯著)

2.4Cr6+脅迫對懷地黃幼苗鮮質(zhì)量、干質(zhì)量的影響

地黃的塊根是其藥用部分，因此我們檢測了不同濃度Cr6+對懷地黃根莖生物量的影響。 如圖4所示，在 0.5 mmol/L的Cr6+濃度條件下，懷地黃根和葉的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均有顯著增長，分別是對照的125.45%和113.34%。之后隨著Cr6+濃度的增加，開始表現(xiàn)出對懷地黃生長的抑制作用。并且Cr6+對懷地黃的鮮、干質(zhì)量的抑制作用隨著Cr6+濃度的增加呈加重趨勢，當(dāng)Cr6+濃度達(dá)到2 mmol/L時，幼苗的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均顯著下降。

圖4　不同濃度Cr6+脅迫對懷地黃幼苗鮮質(zhì)量(A)和干質(zhì)量(B)的影響(第21天)

3　討論與結(jié)論

土壤是人類賴以生存的主要自然資源之一 ,也是植物生長的重要組成部分。土壤中重金屬污染的日益嚴(yán)重，不僅影響了糧食作物的產(chǎn)量、質(zhì)量，而且對其他經(jīng)濟(jì)作物的價值，如中藥的藥用價值等也產(chǎn)生了極大的影響。

目前關(guān)于重金屬污染，尤其是鉻污染對中藥地黃的生長和毒害作用尚無相關(guān)研究報道。本研究首次研究了不同鉻濃度和脅迫時間對地黃幼苗生長的影響。研究結(jié)果表明，當(dāng)鉻濃度較低時，鉻離子的存在反而對懷地黃的生長有一定的促進(jìn)作用，而巢麗儀等[5]、石貴玉等[8]研究也表明，低濃度鉻對玉米，煙草等植物的生長有一定的促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)中低濃度鉻雖對葉片數(shù)量、鮮質(zhì)量起到了促進(jìn)作用，但是對葉片長度、寬度、面積均起到了抑制作用，這說明低濃度鉻能夠促進(jìn)葉片光合作用積累有機(jī)產(chǎn)物，并有利于其個數(shù)的增加，卻不利于單個葉片表面積的增大。另外本實(shí)驗(yàn)中低濃度鉻脅迫的幼苗根、莖干質(zhì)量均有所下降，只有葉的干質(zhì)量增加，說明此濃度時鉻對干物質(zhì)積累的促進(jìn)作用主要表現(xiàn)在植物的葉片上。另外，本研究發(fā)現(xiàn)Cr6+濃度達(dá)到1 mmol/L時對植物根部生長開始有顯著的抑制作用。懷地黃幼苗在高濃度Cr6+的脅迫下，株高、根長、根數(shù)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉面積等生長指標(biāo)均顯著低于對照植株。隨著脅迫時間的增加和鉻濃度的提高，植株開始逐漸出現(xiàn)葉枯萎，甚至死亡。

Van Assche等[9]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)重金屬離子能與酶和蛋白質(zhì)結(jié)合，并且替換金屬蛋白中的必需元素，使酶失去活性，阻礙植物的正常生長和光合作用。因此鉻對懷地黃生長的毒害作用可能是由于鉻抑制幼苗體內(nèi)酶的活性，使植株新陳代謝發(fā)生了紊亂。王五宏等[10]研究了水培條件下鉻脅迫對四個品種苗用型大白菜生長的影響，其中雙耐、浙白8號在100 μmol/L脅迫下鮮質(zhì)量抑制率分別為63.40%、49.04%,浙白6號和早熟5號在50 μmol/L脅迫下鮮質(zhì)量抑制率達(dá)到70%。陳耕云等[11]對煙草的研究表明，當(dāng) Cr6 +濃度達(dá)到 800 μmol/L 時，煙草的生長發(fā)育完全被抑制。在本研究中Cr6 +濃度達(dá)到 3 mmol/L對懷地黃幼苗的生長有強(qiáng)烈的抑制作用，與上述研究結(jié)果研究一致。另外，由于煙草和懷地黃同屬合瓣花亞綱管狀花目，本實(shí)驗(yàn)中懷地黃幼苗在1mmol/L仍可以較好的生長，可見地黃相比其他植物對重金屬鉻毒害的抵抗能力更強(qiáng)。

綜上所述，本研究以生長參數(shù)指標(biāo)作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，探究了懷地黃經(jīng)重金屬鉻脅迫的生長狀況及致死濃度。研究結(jié)果表明，土壤重金屬的污染不僅影響農(nóng)作物的生長，其對中草藥植物的生長也有毒害作用。本研究可為改善地黃質(zhì)量和預(yù)防土壤重金屬污染對地黃的生長提供有效的評估依據(jù)。另外，本研究僅以生長參數(shù)指標(biāo)作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，而沒有對生理指標(biāo)進(jìn)行測定，故今后將會對鉻對懷地黃幼苗生理生化特性的影響以及其它重金屬對懷地黃幼苗生長的影響進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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[11]陳耕云, 石貴玉, 徐美燕, 等. 重金屬 Cr6+對煙草組織培養(yǎng)的影響[J]. 河池學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版, 2006, 26(2): 28-30.

The effect of Chromium (Cr6+) stress on Rehmannia glutinosa seedling

Zhang Yuhong

(College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China)

e studied the stress effects in Rehmannia glutinosa seedlings by tissue culture under different Cr6+concentrations and the time of Cr6+stress. The plant height, growth status of root, stem, and leaf, biomass and mortality were measured. The results indicated that, in given stress time, low concentration of Cr6+(0.5mmol/L)had a positive effect on fresh weight, dry weight, root length, and leaf number of Rehmannia glutinosa seedlings, while high concentration of Cr6+significantly reduced their biological activities. Rehmannia glutinosa seedlings could still grow well when the Cr6+concentration was up to 1.0 mmol/L, which suggested they had strong tolerance ability to Cr6+.

chromium (Cr6+) stress; Rehmannia glutinosa seedlings; tissue culture; growth

2014年度河南師范大學(xué)校級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃(編號：20140138)

2016-06-05; 2016-07-18 修回

張宇虹，女，1996年生，河南三門峽人，本科，研究方向： 植物遺傳學(xué)。E-mail：yuhongruoyi@163.com

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