楊金玉　張海軍　王　晶　岳洪源　武書庚

齊廣海1　官　堃2　GERRITS Gert Jan2

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京100081；2.天津帝凱維動物營養(yǎng)有限公司，天津300457)

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葡萄原花青素對感染柔嫩艾美爾球蟲肉仔雞生長性能和免疫功能的影響

楊金玉1,2張海軍1*王晶1岳洪源1武書庚1

齊廣海1官堃2GERRITS Gert Jan2

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京100081；2.天津帝凱維動物營養(yǎng)有限公司，天津300457)

本試驗(yàn)旨在研究飼糧中添加葡萄原花青素(GPC)對感染柔嫩艾美爾球蟲肉仔雞生長性能和免疫功能的影響。選用350只1日齡科寶-500(Cobb-500)健康肉仔雞(公雛)，隨機(jī)分為5個組，每組7個重復(fù)，每個重復(fù)10只雞。空白對照組和負(fù)對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上添加7.5、15.0和30.0 mg/kg GPC的試驗(yàn)飼糧。14日齡時，負(fù)對照組和3個試驗(yàn)組每只肉仔雞經(jīng)口腔攻毒5×104個柔嫩艾美爾球蟲卵囊，空白對照組每只肉仔雞灌服同體積的生理鹽水。試驗(yàn)期42 d，分為前期(1～21日齡)和后期(22～42日齡)2個階段。結(jié)果表明：1)與空白對照組相比，負(fù)對照組肉仔雞試驗(yàn)各階段的平均日增重(ADG)均顯著降低(P<0.05)，22～42日齡和1～42日齡時的料重比(F/G)顯著增加(P<0.05)；飼糧中添加7.5和15.0 mg/kg GPC顯著改善了柔嫩艾美爾球蟲攻毒引起的22～42日齡和1～42日齡時ADG的降低和F/G的增加(P<0.05)；而飼糧中添加30.0 mg/kg GPC顯著降低了22～42日齡時的ADG、平均日采食量(ADFI)和1～42日齡時的ADG(P<0.05)。2)與負(fù)對照組相比，飼糧中添加GPC顯著降低了肉仔雞的盲腸病變評分、血便堆數(shù)和球蟲卵囊排出數(shù)(P<0.05)。3)飼糧中添加GPC顯著抑制了柔嫩艾美爾球蟲攻毒引起的肉仔雞脾臟指數(shù)增加(P<0.05)；柔嫩艾美爾球蟲攻毒引起T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著增加(P<0.05)，飼糧中添加7.5和15.0 mg/kg GPC使T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率進(jìn)一步增加(P>0.05)；飼糧中添加7.5和15.0 mg/kg GPC可使B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率增加(P>0.05)；柔嫩艾美爾球蟲攻毒引起外周血γδ T細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05)，飼糧中添加15.0 mg/kg GPC使外周血γδ T細(xì)胞比例進(jìn)一步增加(P>0.05)。4)與空白對照組相比，柔嫩艾美爾球蟲攻毒顯著增加了回腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IEL)數(shù)量和盲腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平(P<0.05)，飼糧中添加7.5和15.0 mg/kg GPC使IEL數(shù)量和sIgA水平進(jìn)一步增加(P<0.05)。綜上所述，飼糧中添加GPC可提高感染柔嫩艾美爾球蟲肉仔雞的免疫功能，緩解柔嫩艾美爾球蟲感染造成的生長抑制，其中7.5和15.0 mg/kg GPC的抗球蟲效果較好。

葡萄原花青素；肉仔雞；柔嫩艾美爾球蟲；生長性能；免疫功能

球蟲是寄生在家禽腸道細(xì)胞的原蟲。球蟲病已經(jīng)成為治療費(fèi)用昂貴的疾病之一，全世界每年因球蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)20億英鎊[1]，我國每年用于球蟲病防治的費(fèi)用高達(dá)6～18億元[2]。目前，球蟲的防治仍主要依賴于抗球蟲藥，但是近50年密集持續(xù)的藥物使用已經(jīng)使球蟲產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性[3]。因此，尋找安全可靠的抗球蟲藥替代物已經(jīng)迫在眉睫。

葡萄原花青素(grape procyanidins，GPC)是一種天然存在的植物多酚，也是葡萄副產(chǎn)品中的主要活性物質(zhì)。大量研究表明，GPC具有良好的抗氧化活性[4]，可有效抑制由鹽酸阿霉素(DXR)造成的大鼠心肌氧化損傷[5]，顯著削弱對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠肝中毒和肝細(xì)胞DNA損傷[6]，緩解二甲基亞硝胺(DMNA)誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞毒性[7]。研究也顯示，球蟲入侵家禽腸道后會引起嚴(yán)重的氧化應(yīng)激[8]，而GPC可通過激活機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)抑制氧化應(yīng)激，進(jìn)而抵抗球蟲損傷[9]。

研究表明，GPC在提高機(jī)體免疫功能方面也具有良好的作用[10]。Gessner等[11]發(fā)現(xiàn)飼糧中添加葡萄籽提取物和葡萄渣提取物可顯著抑制仔豬十二指腸核轉(zhuǎn)錄因子kappa B的活性，降低仔豬腸炎發(fā)生率；Hogan等[12]研究發(fā)現(xiàn)葡萄渣提取物(富含GPC)可以明顯降低高脂飼糧誘導(dǎo)的肥胖性炎癥大鼠血漿C-反應(yīng)蛋白的濃度；Magrone等[13]發(fā)現(xiàn)葡萄酒多酚可促進(jìn)白細(xì)胞介素-12(IL-12)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)及免疫球蛋白的分泌釋放，緩解免疫紊亂；還可促進(jìn)一氧化氮釋放，保護(hù)感染組織。GPC的免疫調(diào)節(jié)功能是否有助于家禽對抗球蟲感染目前尚不十分清楚。

球蟲主要損傷家禽腸道，而腸道是家禽重要的消化吸收和免疫器官，因此球蟲感染勢必會引起生長抑制和免疫紊亂。Mcdougald等[14]研究發(fā)現(xiàn)，家禽飼糧中添加2%圓葉葡萄渣(MP)，可顯著降低球蟲引起的腸道損傷評分；Wang等[9]也發(fā)現(xiàn)GPC可以緩解球蟲引起的肉雞生長抑制，但其機(jī)制尚不明確。本課題組的前期研究表明，體外條件下，GPC可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖活化[15]；以小麥-豆粕型飼糧為基礎(chǔ)飼糧時，GPC可提高肉仔雞的免疫功能[16]，推測GPC可能通過提高免疫功能來抵抗球蟲感染。此外，本課題組研究也表明，盲腸竇分泌型免疫球蛋白A(sIgA)和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IEL)在家禽機(jī)體抵抗球蟲過程中發(fā)揮著重要作用[17]，但GPC是否可通過激活腸道免疫抵抗球蟲，目前還知之甚少。

本試驗(yàn)旨在探究GPC對感染柔嫩艾美爾球蟲肉仔雞生長性能、腸道損傷程度、免疫器官指數(shù)、淋巴細(xì)胞增殖活化、盲腸黏膜sIgA水平和回腸IEL增殖的影響，初步揭示GPC抗球蟲感染的相關(guān)機(jī)理，為其在肉仔雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

GPC由天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司提供，原花青素含量99.47%，其中含寡聚原花青素(OPC)65.19%，原花青素單體9.88%，多聚原花青素24.93%。

1.2試驗(yàn)設(shè)計與試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)選用350只1日齡科寶-500(Cobb-500)健康肉仔雞公雛，隨機(jī)分為5個組，每組7個重復(fù)，每個重復(fù)10只雞?？瞻讓φ战M和負(fù)對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上添加7.5、15.0和30.0 mg/kg GPC的試驗(yàn)飼糧。14日齡時，負(fù)對照組和3個試驗(yàn)組每只肉仔雞經(jīng)口腔攻毒5×104個柔嫩艾美爾球蟲卵囊，空白對照組每只肉仔雞灌服同體積的生理鹽水。試驗(yàn)期42 d，分為前期(1～21日齡)和后期(22～42日齡)2個階段。

在參照NRC(1994)和NY/T 33—2004的基礎(chǔ)上，配制小麥-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3飼養(yǎng)管理

單層網(wǎng)上籠養(yǎng)，自然光照加人工補(bǔ)光，光照強(qiáng)度為30 lx，1～7日齡每天光照24 h，8日齡后每天光照23 h、黑暗1 h。雞舍溫度第1周33～35 ℃，之后每周下降2 ℃，至21 ℃不再下降。肉雞自由采食和飲水，常規(guī)免疫。

1.4測定指標(biāo)及方法

1.4.1生長性能

試驗(yàn)前稱雛雞初始體重，分別于試驗(yàn)的第14、21、42天09:00之前，以重復(fù)為單位稱空腹體重，記錄試驗(yàn)雞每天的耗料量，統(tǒng)計肉雞1～14日齡、15～21日齡、22～42日齡耗料量，計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.4.2血便堆數(shù)、盲腸病變評分和球蟲卵囊排出

于19日齡(攻毒后第5天)測定柔嫩艾美爾球蟲感染肉仔雞的血便堆數(shù)。

于21日齡(攻毒后第7天)時，每個重復(fù)隨機(jī)選1只雞，處死，按Johnson等[18]的方法測定盲腸病變評分，盲腸病變評分標(biāo)準(zhǔn)如下。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供 Vitamin premix provided the following per kg of diets：VA 12 500 IU，VD32 500 IU，VE 15 IU，VK32.65 mg，VB12 mg，VB26 mg，VB120.025 mg，生物素 biotin 0.35 mg，葉酸 folic acid 1.25 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 12 mg，煙酸 niacin 50 mg。

2)礦物質(zhì)預(yù)混料為每千克飼糧提供 Mineral premix provided the following per kg of diets：Cu 8 mg，Zn 75 mg，F(xiàn)e 80 mg，Mn 100 mg，Se 0.15 mg，I 0.35 mg。

3)營養(yǎng)水平括號內(nèi)為實(shí)測值，其余均為計算值。Nutrient levels in the parentheses were measured values, while the others were calculated values.

0分：未見病變；

1分：盲腸壁有極少量散在出血斑，腸壁不增厚，內(nèi)容物正常；

2分：盲腸內(nèi)容物有極少量血液，腸壁增厚，可見多處出血斑；

3分：盲腸內(nèi)有多量血液或盲腸核，腸壁增厚，有明顯的盲腸變形和萎縮；

4～5分：盲腸顯著萎縮，病變達(dá)直腸部位，腸壁極度增厚，腸內(nèi)有血凝塊或盲腸核。

若兩側(cè)盲腸病變不一致，則以病變重的一側(cè)為準(zhǔn)，進(jìn)行病變評分。

參照Lillehoj[19]的方法測定球蟲卵囊排出。于攻毒后第7～10天，采用全收糞法收集排泄物中的卵囊，用麥?zhǔn)舷x卵計數(shù)板(Mcmaster’s chamber slide)計數(shù)卵囊，測定攻毒球蟲7～10 d后每天每只雞每克糞便的卵囊數(shù)(OPG)，以4 d的平均值進(jìn)行統(tǒng)計。

1.4.3免疫器官指數(shù)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和γδ T細(xì)胞比例

于21日齡(攻毒后7 d)測定免疫器官指數(shù)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和血液中γδ T細(xì)胞比例。

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)參考Mosmann[20]的方法并略作改動，雖然該方法不失經(jīng)典但材料較陳舊，故略有修改，具體如下：翅靜脈采血，肝素鈉抗凝，立即將抗凝血用D-Hanks液作1∶1稀釋，離心管中加入1 mL淋巴細(xì)胞分離液(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，之后慢慢加入2倍體積的稀釋血液，使之平鋪于分離液上，4 ℃ 1 800×g離心30 min，可見液體分層，上層為血漿，中層為分離液，下層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。在上層和中層之間的界面上可見一薄層混濁帶，即為淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的混合物，取約1 mL的中間白細(xì)胞層，加入3～5倍體積的RPMI-1640營養(yǎng)液(購自美國Gibco公司)，洗滌3次，每次4 ℃ 2 500 r/min離心10 min，棄上清。然后將細(xì)胞懸浮于RPMI-1640完全培養(yǎng)液，臺盼藍(lán)染色，計數(shù)活細(xì)胞數(shù)(>95%)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/mL。將細(xì)胞植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入190 μL的細(xì)胞懸液，隨后分別加入10 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)、刀豆蛋白(ConA)(美國Sigma公司，終濃度45 μg/mL)或脂多糖(LPS)(美國Sigma公司，終濃度25 μg/mL)，PBS作為對照組，ConA組作為T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化組，LPS組作為B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化組。培養(yǎng)體系為200 μL，將板置于5% CO2，40 ℃ CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)56 h，之后每孔輕輕吸棄上清100 μL，加入100 μL不含小牛血漿的RPMI-1640培養(yǎng)液，同時加入初濃度5 mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)溶液(美國Sigma公司)10 μL，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)，待紫色結(jié)晶完全溶解后，酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm波長下測定吸光度(OD)值。

外周血淋巴細(xì)胞中γδ T細(xì)胞比例的測定參照張海軍等[21]的方法進(jìn)行。

1.4.4回腸IEL數(shù)量和盲腸黏膜sIgA水平

于21日齡(攻毒后7 d)測定回腸IEL數(shù)量和盲腸黏膜sIgA水平，sIgA水平用覆蓋有sIgA的陽性面積與整個視野面積的比值來表示，方法參照高俊[17]的報道。

1.5數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010初步處理，采用SPSS 16.0軟件的單因素方差分析(one-way ANONA)程序進(jìn)行統(tǒng)計分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，其中腸道損傷評分、血便堆數(shù)和卵囊排出數(shù)等非連續(xù)觀察數(shù)據(jù)因不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Kruskal-Wallis方法進(jìn)行分析，顯著性標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為P<0.05，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2　結(jié)果與分析

2.1GPC對柔嫩艾美爾球蟲感染肉仔雞生長性能的影響

由表2可知，飼糧中添加GPC對1～14日齡肉仔雞的生長性能指標(biāo)無顯著影響(P>0.05)。15～21日齡時，與空白對照組相比，負(fù)對照組肉仔雞的ADG顯著降低(P<0.05)；而飼糧中GPC的添加緩解了球蟲攻毒引起的ADG下降，其生長性能指標(biāo)與空白對照相比無顯著差異(P>0.05)。22～42日齡時，與空白對照組相比，負(fù)對照組肉仔雞的ADG顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)/G顯著增加(P<0.05)；而飼糧中7.5和15.0 mg/kg GPC的添加顯著改善了球蟲攻毒引起的ADG的降低和F/G的增加(P<0.05)；與空白對照組相比，飼糧中30.0 mg/kg GPC的添加顯著降低了ADG和ADFI(P<0.05)。1～42日齡時，負(fù)對照組和30.0 mg/kg GPC組肉仔雞的ADG顯著低于其他各組(P<0.05)，負(fù)對照組的F/G顯著高于其他各組(P<0.05)。綜上，球蟲攻毒降低了肉仔雞的生長性能，飼糧中7.5和15.0 mg/kg GPC的添加緩解了球蟲攻毒引起的生長抑制。

2.2GPC對柔嫩艾美爾球蟲感染肉仔雞盲腸病變評分、血便堆數(shù)和球蟲卵囊排出數(shù)的影響

由表3可知，與負(fù)對照組相比，飼糧中添加GPC顯著降低了肉仔雞的盲腸病變評分、血便堆數(shù)和球蟲卵囊排出數(shù)(P<0.05)，其中7.5、15.0和30.0 mg/kg GPC組的卵囊排出數(shù)分別降低了66.9%、80.8%和45.4%，以15.0 mg/kg GPC組的抗球蟲效果最佳。

表2　GPC對柔嫩艾美爾球蟲感染肉仔雞生長性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表3　GPC對柔嫩艾美爾球蟲感染肉仔雞盲腸病變評分、血便堆數(shù)和球蟲卵囊排出的影響

2.3GPC對柔嫩艾美爾球蟲感染肉仔雞免疫器官指數(shù)和外周血淋巴細(xì)胞的影響

由表4可知，與空白對照組相比，負(fù)對照組肉仔雞的脾臟指數(shù)顯著增加(P<0.05)，而各GPC添加組與空白對照組相比無顯著差異(P>0.05)。與空白對照組相比，負(fù)對照組和各GPC添加組的外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著增加(P<0.05)；與負(fù)對照組相比，7.5和15.0 mg/kg GPC組的外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率分別增加了16.1%和5.4%(P>0.05)。7.5和15.0 mg/kg GPC組的外周血B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著大于30.0 mg/kg GPC組(P<0.05)。與空白對照組相比，負(fù)對照組的外周血γδ T細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05)，15.0 mg/kg GPC組的外周血γδ T細(xì)胞比例大于負(fù)對照組，但差異不顯著(P>0.05)。各組間的胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)未見顯著差異(P>0.05)。

表4　GPC對柔嫩艾美爾球蟲感染肉仔雞免疫器官指數(shù)和外周血淋巴細(xì)胞的影響

2.4GPC對柔嫩艾美爾球蟲感染肉仔雞腸道免疫功能的影響

由表5可知，與空白對照組相比，負(fù)對照組的回腸IEL數(shù)量增加了41.9%(P<0.05)；7.5和15.0 mg/kg GPC組的IEL數(shù)量進(jìn)一步增加，較空白對照組分別增加了69.3%和116.7%(P<0.05)；而30.0 mg/kg GPC組的IEL數(shù)量與負(fù)對照組無顯著差異(P>0.05)。與空白對照組相比，負(fù)對照

組的盲腸黏膜sIgA水平增加了36.3%(P<0.05)；飼糧中添加GPC使sIgA水平進(jìn)一步升高，7.5、15.0和30.0 mg/kg GPC組的sIgA水平比空白對照組分別升高了107.6%、149.6%和94.3%(P<0.05)。綜上，飼糧中添加7.5和15.0 mg/kg GPC均可有效調(diào)節(jié)腸道IEL數(shù)量和sIgA水平，以15.0 mg/kg GPC組效果最好。

表5　GPC對柔嫩艾美爾球蟲感染肉仔雞腸道免疫功能的影響

3　討　論

3.1GPC對柔嫩艾美爾球蟲感染肉仔雞生長性能的影響

球蟲是寄生在家禽腸道上皮的一種原生蟲，主要破壞腸道上皮細(xì)胞，影響正常的消化吸收，造成生長緩慢和飼料效率降低。本研究結(jié)果顯示，1～14日齡時各組肉仔雞的生長性能差異不顯著，與之前的研究結(jié)果相一致[16]，原因可能是飼喂時間過短GPC還沒有發(fā)揮作用；攻毒后，球蟲損傷了機(jī)體腸道，引起消化吸收功能障礙，造成營養(yǎng)浪費(fèi)，而飼糧中添加7.5和15.0 mg/kg GPC緩解了這一損傷，與Wang等[9]和Mcdougald等[14]的研究較為一致，提示飼糧中添加7.5和15.0 mg/kg GPC可保持雞只的健康生長狀態(tài)，抵抗球蟲感染造成的生長抑制。球蟲感染會引起氧化應(yīng)激和免疫抑制，課題組的前期研究結(jié)果也揭示了GPC具有較好的抗氧化和促免疫作用[20-21]，這可能是GPC改善肉仔雞生長性能的重要原因。

值得注意的是，盡管試驗(yàn)全期30.0 mg/kg GPC組的F/G顯著低于負(fù)對照組，但ADG與負(fù)對照組差異不顯著，這是由于30.0 mg/kg GPC組的ADFI較低造成的，提示飼糧中添加30.0 mg/kg GPC的抗球蟲效果有限，可能是因?yàn)楦邉┝縂PC對飼料的適口性有負(fù)面影響。

3.2GPC對柔嫩艾美爾球蟲感染肉仔雞盲腸病變評分、血便堆數(shù)和球蟲卵囊排出數(shù)的影響

腸道是機(jī)體最重要的消化吸收器官，其健康程度直接影響雞只的生長速度；球蟲入侵腸道上皮細(xì)胞后，破壞腸道上皮的完整性，引起出血，出現(xiàn)血便；球蟲寄生并在腸道上皮細(xì)胞內(nèi)大量增殖，并隨糞便排出體外。本試驗(yàn)結(jié)果表明飼糧中添加GPC顯著降低了球蟲攻毒肉仔雞的盲腸病變評分、血便堆數(shù)和球蟲卵囊排出數(shù)，這與Wang等[9]研究結(jié)果相一致。

本課題組前期試驗(yàn)研究顯示，GPC對球蟲并無顯著的直接殺傷作用(未發(fā)表資料)，故可推測GPC可能通過激活機(jī)體自身免疫系統(tǒng)來抵抗球蟲感染。

3.3GPC對柔嫩艾美爾球蟲感染肉仔雞免疫器官發(fā)育和外周血淋巴細(xì)胞的影響

與哺乳動物的淋巴結(jié)相似，脾臟是雞最大的外周免疫器官，也是機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)、產(chǎn)生抗體的重要器官，其發(fā)育狀況與機(jī)體的免疫狀況密切相關(guān)。此外，脾臟直接與血液相通，極易受到血液中自由基的攻擊發(fā)生氧化應(yīng)激。有研究表明，球蟲感染會破壞肉雞脾臟的抗氧化體系，損害脾臟組織結(jié)構(gòu)[22-23]。還有報道指出肉仔雞感染球蟲后脾臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞腫脹，紅髓內(nèi)血細(xì)胞增多，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤[24]。本試驗(yàn)研究顯示，感染球蟲的負(fù)對照組肉仔雞的脾臟指數(shù)顯著增加，這可能與球蟲感染引起的抗氧化失衡及炎癥反應(yīng)有關(guān)。本課題組前期研究顯示，飼糧中添加7.5和15.0 mg/kg GPC對肉仔雞的脾臟指數(shù)無顯著影響，提示在正常飼養(yǎng)狀態(tài)下GPC可能對脾臟指數(shù)無顯著作用[16]。然而，本試驗(yàn)結(jié)果則顯示飼糧中添加GPC可將感染球蟲肉仔雞的脾臟指數(shù)恢復(fù)至未感染時的正常水平，提示GPC對處于球蟲感染狀態(tài)肉仔雞脾臟指數(shù)有較為顯著的改善作用，這可能與GPC的抗炎作用[11-12]和緩解氧化應(yīng)激作用[9]有關(guān)。GPC抑制球蟲感染引起的脾臟指數(shù)升高的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率反映了機(jī)體T、B淋巴細(xì)胞的反應(yīng)和增殖活性，而球蟲感染后機(jī)體的細(xì)胞免疫起主導(dǎo)作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)球蟲感染肉仔雞的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于空白對照組，提示機(jī)體發(fā)生了應(yīng)對球蟲入侵的免疫反應(yīng)；而飼糧中添加GPC提高了T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，與之前的研究較為一致[15-16]。GPC激活細(xì)胞免疫，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，抵抗球蟲入侵，這可能是GPC抗球蟲的機(jī)理之一。而球蟲感染后機(jī)體的體液免疫作用相對較弱，本試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)球蟲感染負(fù)對照組與空白對照組之間胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)的顯著差異。但飼糧中添加GPC提高了B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，可能是因?yàn)榍蛳x入侵破壞了腸道黏膜屏障，引起病原微生物的大量入侵，激活體液免疫，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分泌抗體，有利于機(jī)體預(yù)防球蟲感染引起的繼發(fā)疾病。

Bessay等[25]和Swinkels等[26]的研究顯示，球蟲感染后雞腸道γδ T細(xì)胞數(shù)量迅速增多。Yun等[27]比較了2個品系蛋雞在球蟲感染后腸道淋巴細(xì)胞亞群的變化，發(fā)現(xiàn)在球蟲感染后高耐受雞腸道γδ T細(xì)胞數(shù)量顯著高于低耐受雞。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)球蟲感染負(fù)對照組肉仔雞外周血的γδ T細(xì)胞比例顯著高于空白對照組，這與前人研究較為一致。γδ T細(xì)胞通過促進(jìn)角化細(xì)胞生長因子和表皮生長因子(EGF)的生成，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的增殖和分化等[28-30]，而球蟲感染可活化機(jī)體γδ T細(xì)胞發(fā)揮自身免疫保護(hù)作用。本試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)飼糧中添加GPC具有顯著提高肉仔雞外周血γδ T細(xì)胞增殖的作用，可能是由于球蟲感染后腸道γδ T細(xì)胞比例顯著提高，但經(jīng)過循環(huán)，到達(dá)血液中的γδ T細(xì)胞并未達(dá)到顯著變化。

3.4GPC對柔嫩艾美爾球蟲感染肉仔雞腸道免疫功能的影響

黏膜內(nèi)免疫細(xì)胞占機(jī)體所有免疫細(xì)胞的80%，黏膜免疫在機(jī)體的免疫保護(hù)中占有非常重要的地位。黏膜免疫系統(tǒng)是由集合黏膜相關(guān)淋巴組織和彌散黏膜相關(guān)淋巴組織組成，集合黏膜相關(guān)淋巴組織是捕捉抗原和產(chǎn)生免疫效應(yīng)細(xì)胞與免疫記憶細(xì)胞的主要場所。盲腸扁桃體是集合黏膜相關(guān)淋巴組織的一部分，而IEL是彌散黏膜淋巴組織的一部分。IEL是一類獨(dú)特的淋巴細(xì)胞群，在細(xì)胞介導(dǎo)的黏膜免疫和維持上皮的完整性中起著重要作用，具有胞內(nèi)顆粒(如穿孔素、粒酶和絲氨酸酯酶等)，有細(xì)胞殺傷作用，也可以分泌淋巴細(xì)胞因子(如腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、白細(xì)胞介素-2等)，在防御腸道病原菌入侵方面也發(fā)揮著重要作用[31-32]。本試驗(yàn)顯示飼糧中添加GPC顯著提高了球蟲感染后肉仔雞回腸IEL數(shù)量，提示GPC通過促進(jìn)IEL增殖活化，分泌細(xì)胞因子和胞內(nèi)顆粒，直接或間接殺滅球蟲。

黏膜相關(guān)淋巴組織中的B細(xì)胞多為sIgA的產(chǎn)生細(xì)胞，受抗原刺激后直接將sIgA分泌到附近黏膜，發(fā)揮局部免疫作用。鄭明學(xué)等[23]發(fā)現(xiàn)，感染柔嫩艾美爾球蟲雞的盲腸黏膜局部淋巴細(xì)胞顯著增生，盲腸黏膜局部致敏的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生sIgA，可將球蟲阻留在腸腔，以便消化液和其他物質(zhì)的作用將球蟲殺滅，據(jù)此認(rèn)為腸道局部分泌型抗體和細(xì)胞免疫共同協(xié)調(diào)發(fā)揮綜合保護(hù)作用。劉晶[33]認(rèn)為sIgA抗球蟲感染的可能作用機(jī)制為：sIgA黏附在蟲體表面，通過中和以及調(diào)理吞噬等空間阻礙作用降低蟲體的活力，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞受體分子構(gòu)型發(fā)生改變，抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用直接作用于子孢子和裂殖子，阻止其入侵及在細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育。本試驗(yàn)顯示飼糧中添加GPC顯著提高了球蟲感染后肉仔雞盲腸黏膜sIgA的分泌水平，進(jìn)而通過空間阻隔效應(yīng)減少了球蟲與腸壁細(xì)胞的接觸損傷。

4　結(jié)　論

① 肉仔雞飼糧中添加適量GPC可抑制球蟲感染引起的生長性能下降。

② 肉仔雞飼糧中添加適量GPC可提高球蟲感染后外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。

③ 肉仔雞飼糧中添加適量GPC可提高球蟲感染后回腸IEL數(shù)量和盲腸黏膜sIgA水平，維持腸道健康。

④ 在本試驗(yàn)球蟲感染模型條件下，肉仔雞飼糧中GPC的適宜添加劑量為7.5～15.0 mg/kg。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: fowlfeed@163.com

(責(zé)任編輯李慧英)

Effects of Grape Procyanidins on Growth Performance and Immune Function of Broiler Chicks Challenged withEimeriatenella

YANG Jinyu1,2ZHANG Haijun1*WANG Jing1YUE Hongyuan1WU Shugeng1QI Guanghai1GUAN Kun2GERRITS Gert Jan2

(1.Key Laboratory of Feed Biotechnology of Ministry of Agriculture, Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2. Tianjin DKVE Animal Nutrition Co., Ltd., Tianjin 300457, China)

This study was conducted to investigate the effects of dietary grape procyanidins (GPC) on the performance and immune function of broiler chicks challenged withEimeriatenella. A total of 350 one-day-old healthy male broiler chicks (Cobb-500) were randomly allotted into 5 groups with 7 replicates per group and 10 chicks per replicate. Chicks in blank control (BC) group and negative control (NC) group were fed the basal diet, and the others in experimental groups were fed the basal diet supplemented with 7.5, 15.0 and 30.0 mg/kg GPC, respectively. At 14 days of age, chicks in NC group and 3 experimental groups were challenged with 5×104Eimeriatenellaoocysts per bird by oral, whereas chicks in BC group administered by perfusion with the same amount of saline. The experimental period lasted for 42 days containing 2 periods of early period (1 to 21 days of age) and later period (22 to 42 days of age). The results showed as follows: 1) compared with BC group, the average daily gain (ADG) of broiler chicks during all experimental stages in NC group was significantly decreased and the ratio of feed to gain (F/G) during 22 to 42 and 1 to 42 days of age was significantly increased (P<0.05). Dietary supplemented with 7.5 and 15.0 mg/kg GPC significantly inhibited the ADG decrease and F/G increase induced byEimeriatenellachallenged during 22 to 42 and 1 to 42 days of age (P<0.05). Dietary supplemented with 30.0 mg/kg GPC significantly decreased the ADG and average daily feed intake (ADFI) during 22 to 42 days of age and ADG during 1 to 42 days of age (P<0.05). 2) Compared with NC group, dietary supplemented with GPC significantly decreased cecal lesion score, bloody stool piles and the number of coccidial oocysts excretion (P<0.05). 3) Dietary supplemented with GPC significantly inhibited the increase of the spleen index of broiler chicks induced byEimeriatenellachallenged (P<0.05). T lymphocyte transformation rate (TLR) was significantly increased byEimeriatenellachallenged (P<0.05), and dietary supplemented with 7.5 and 15.0 mg/kg GPC further increased it (P>0.05). Dietary supplemented with 7.5 and 15.0 mg/kg GPC increased the B lymphocyte transformation rate (BLR) (P>0.05). The γδ T lymphocytes percentage in peripheral blood was significantly increased byEimeriatenellachallenged (P<0.05), and dietary supplemented with 15.0 mg/kg GPC further increased it (P>0.05). 4) Compared with NC group, the ileum intraepithelial lymphocytes (IEL) number and caecal mucosa secretory IgA (sIgA) level were significantly increased byEimeriatenellachallenged (P<0.05), and dietary supplemented with 7.5 and 15.0 mg/kg GPC further increased them (P<0.05). In conclusion, dietary supplemented with GPC improves immune function and relieve growth inhibition of broiler chicks challenged withEimeriatenella, and the supplementation of 7.5 and 15.0 mg/kg GPC have the better anticoccidial effect.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(9)：2802-2811]

grape procyanidins; broiler chicks;Eimeriatenella; growth performance; immune function

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.09.019

2016-03-23

國家自然科學(xué)基金(31272456)；家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(CARS-PSTP)；國家科技支撐計劃(2011BAD26B04)

楊金玉(1988—)，男，河北邯鄲人，碩士，研究方向?yàn)閯游餇I養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail: jinyu.yang@dkve.com

張海軍，副研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail: fowlfeed@163.com

S816.7

A

1006-267X(2016)09-2802-10