何　珊　劉迎春　李玲瑤　梁　瑋　高　峰*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018；3.內(nèi)蒙古生物制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018)

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妊娠后期胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限對(duì)蒙古綿羊胎兒肝臟細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響

何珊1劉迎春2,3李玲瑤1梁瑋1高峰1*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018；3.內(nèi)蒙古生物制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018)

本試驗(yàn)旨在研究妊娠后期胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限(IUGR)對(duì)蒙古綿羊胎兒肝臟細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響。選擇健康的、經(jīng)同期發(fā)情和受孕的蒙古綿羊18只，隨機(jī)分為3組，代謝能水平分別為0.175(R1組)、0.330(R2組)和0.670 MJ/(kg BW0.75·d)(自由采食組，C組)，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只羊。妊娠140 d時(shí)屠宰母羊，測(cè)定胎兒肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞外基質(zhì)含量。結(jié)果表明：R1組胎兒肝臟重(P<0.01)、肝細(xì)胞數(shù)(P<0.05)、肝細(xì)胞核直徑(P<0.01)以及Ⅰ型膠原(P<0.01)、Ⅲ型膠原(P<0.05)、Ⅳ型膠原(P<0.01)、層黏連蛋白(P<0.01)、透明質(zhì)酸(P<0.05)、纖連蛋白含量(P<0.01)顯著或極顯著低于C組，且內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)顯著高于C組(P<0.05)；R2組胎兒肝臟重(P<0.05)、纖連蛋白含量(P<0.01)顯著或極顯著低于C組，而內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)顯著高于C(P<0.05)。結(jié)果提示，妊娠后期營(yíng)養(yǎng)限飼蒙古綿羊嚴(yán)重限制其胎兒肝臟生長(zhǎng)發(fā)育，代謝能水平為0.175 MJ/(kg BW0.75·d)時(shí)，胎兒肝臟細(xì)胞外基質(zhì)合成受到了嚴(yán)重影響，且發(fā)生肝纖維化修復(fù)反應(yīng)；代謝能水平為0.330 MJ/(kg BW0.75·d)時(shí)，僅有胎兒肝臟纖連蛋白含量發(fā)生改變。

營(yíng)養(yǎng)限飼；胎兒肝臟；肝內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞外基質(zhì)

宮內(nèi)生長(zhǎng)受限(intrauterine growth retardation,IUGR)又稱胎兒生長(zhǎng)受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)，指胚胎期自身體重或器官未達(dá)到遺傳的生長(zhǎng)潛能而導(dǎo)致胎兒及其器官生長(zhǎng)發(fā)育遲緩[1]。IUGR綿羊胎兒的肝臟不可避免地存在先天性不足，且顯著影響肝臟后天的生長(zhǎng)發(fā)育和生理功能[2]。肝臟作為機(jī)體功能性臟器，許多功能受細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成的影響[3]。ECM在生物組織的構(gòu)建、細(xì)胞極性的維持及胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化都起到重要作用[4]。ECM主要包括Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、透明質(zhì)酸、層黏連蛋白、纖連蛋白等[5]。肝臟損傷導(dǎo)致ECM分泌減少，ECM的代謝發(fā)生紊亂是肝纖維化發(fā)生的基礎(chǔ)[6]；ECM分泌變化導(dǎo)致的并發(fā)癥常造成圍產(chǎn)期或嬰兒早期的死亡[7]。鑒于ECM對(duì)于肝臟疾病各個(gè)階段都發(fā)揮重要作用，深入研究妊娠后期IUGR對(duì)于胎兒肝臟ECM合成影響有利于早期肝病的預(yù)防，提高出生率。本試驗(yàn)旨在研究妊娠后期IUGR對(duì)蒙古綿羊胎兒肝臟ECM合成的影響，為控制妊娠期胎兒肝臟ECM合成與降解處于平衡狀態(tài)的研究和科學(xué)的母羊妊娠期飼養(yǎng)管理提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)

選擇體況中等、2～3胎次，經(jīng)同期發(fā)情和受孕(Medison-SA-600 B超儀分析確定均為單胎)的健康蒙古綿羊18只，按體重隨機(jī)分為3個(gè)組，代謝能水平分別為0.175(限飼1組，R1組)、0.330(限飼2組，R2組)和0.670 MJ/(kg BW0.75·d)(自由采食組，C組)，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只羊。采用自制人工套袋罩在各限制組母羊嘴部供青干草，適應(yīng)1周后，按照設(shè)定飼喂量供給；C組自由采食。所有試驗(yàn)羊08:30、16:00共飼喂2次；C組11:00加喂1次以保證充分采食。各組自由飲水，自由舔食鹽磚。每天采集采食飼草、剩草樣，然后混合，供營(yíng)養(yǎng)水平測(cè)定[8]。飼草及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)采食量、采食飼草及剩料的營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1　飼草及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)采食量、采食飼草及剩料的營(yíng)養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))

1.2屠宰方法

妊娠140 d將每組6只母羊屠宰，母羊屠宰前，禁飼24 h，禁水15 h，稱宰前活重。剝皮后沿腹中線開(kāi)膛，取出胎兒，隨即完整取出胎兒肝臟，稱重，-80 ℃保存待測(cè)。

1.3胎兒肝臟內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定

在肝門部切開(kāi)肝臟，取最大切面處1 cm×1 cm×1 cm肝臟組織樣本做成石蠟切塊，用切片機(jī)做成切片，采用蘇木精-伊紅(HE)染色，40×下選取11個(gè)不同視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)，利用專業(yè)圖像分析軟件Image-pro Plus 6進(jìn)行肝細(xì)胞數(shù)、肝細(xì)胞核直徑、內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)、枯否氏細(xì)胞數(shù)測(cè)定。

1.4胎兒肝臟ECM的測(cè)定

取上述各組胎兒肝臟組織0.5 g左右，于9倍體積的0.85%冷生理鹽水勻漿，3 000 r/min離心15 min后，取上清液，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定胎兒Ⅰ型膠原(H142)、Ⅲ型膠原(H144)、Ⅳ型膠原(H145)、層黏蛋白(H148)和透明質(zhì)酸(H141)含量，嚴(yán)格按照說(shuō)明書測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.5數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SAS 9.0一般線性模型統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

2　結(jié)　果

2.1妊娠后期IUGR對(duì)蒙古綿羊胎兒肝臟重的影響

妊娠后期IUGR對(duì)蒙古綿羊胎兒肝臟重影響見(jiàn)表2。妊娠140 d時(shí)，R1組胎兒體重、肝臟重極顯著低于C組(P<0.01)，且2組間肝臟重/體重差異不顯著(P>0.05)；R2組胎兒體重(P<0.01)、肝臟重(P<0.05)顯著或極顯著低于C組，且2組間肝臟重/體重差異不顯著(P>0.05)。

表2　妊娠后期IUGR對(duì)蒙古綿羊胎兒體重、肝臟重和肝臟重/體重的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)，相鄰字母表示差異顯著(P<0.05)，相間字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with adjacent letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with alternate letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

2.2妊娠后期IUGR對(duì)蒙古綿羊胎兒肝臟內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的影響

妊娠后期IUGR對(duì)蒙古綿羊胎兒肝臟內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的影響見(jiàn)表3。妊娠140 d時(shí)，R1組胎兒肝細(xì)胞數(shù)(P<0.05)、肝細(xì)胞核直徑(P<0.01)顯著或極顯著低于C組，內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)顯著高于C組(P<0.05)，且2組間枯否氏細(xì)胞數(shù)差異不顯著(P>0.05)；R2組胎兒肝臟的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)顯著高于C組(P<0.05)，且2組間肝細(xì)胞數(shù)、肝細(xì)胞核直徑、枯否氏細(xì)胞數(shù)差異均不顯著(P>0.05)。

表3　妊娠后期IUGR對(duì)蒙古綿羊胎兒肝臟內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的影響

2.3妊娠后期IUGR對(duì)蒙古綿羊胎兒肝臟ECM含量的影響

妊娠后期IUGR對(duì)蒙古綿羊胎兒肝臟ECM的影響見(jiàn)表4。妊娠140 d時(shí)，R1組胎兒肝臟Ⅰ型膠原(P<0.01)、Ⅲ型膠原(P<0.05)、Ⅳ型膠原(P<0.01)、層黏連蛋白(P<0.01)、透明質(zhì)酸(P<0.05)、纖連蛋白含量(P<0.01)均顯著或極顯著低于C組；R2組胎兒肝臟纖連蛋白含量顯著低于C組(P<0.01)，但2組間Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原，層黏連蛋白、透明質(zhì)酸含量差異均不顯著(P>0.05)。

3　討　論

機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育表現(xiàn)為細(xì)胞的正常增殖，包括細(xì)胞數(shù)量、體積的增加。肝臟作為機(jī)體重要的內(nèi)分泌器官，其基本的結(jié)構(gòu)單位是肝小葉，肝小葉主要由肝細(xì)胞構(gòu)成，占了肝小葉體積的75%。除肝細(xì)胞外，肝小葉內(nèi)的其他細(xì)胞統(tǒng)稱血竇細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞、大顆粒淋巴細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞等[9]。機(jī)體及其器官構(gòu)成的基本單位是細(xì)胞，研究表明，IUGR會(huì)嚴(yán)重影響胎兒體重和肝臟重量，導(dǎo)致細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)量顯著降低[10]；且母體營(yíng)養(yǎng)受限會(huì)導(dǎo)致胎兒供給能量不足，體重和肝臟的生長(zhǎng)、發(fā)育調(diào)節(jié)和生理功能不可避免地受到影響[2]。本試驗(yàn)條件下，嚴(yán)重限制了R1和R2組胎兒體重及肝臟重的增長(zhǎng)，肝臟發(fā)育受阻這與高峰[11]報(bào)道的結(jié)果一致。隨著營(yíng)養(yǎng)水平的降低對(duì)胎兒肝臟組織細(xì)胞增殖和體積增大的影響逐步加深，可能是IUGR胎兒體重及肝臟重降低的主要原因[10,12-13]。R1組胎兒肝細(xì)胞數(shù)、肝細(xì)胞核直徑顯著或極顯著低于C組，表明妊娠后期IUGR綿羊胎兒肝細(xì)胞增殖能力降低，阻礙了細(xì)胞體積的增大，不同程度修改了胎兒肝臟的生長(zhǎng)發(fā)育軌道[14]，可能是導(dǎo)致肝細(xì)胞數(shù)和體積降低的重要原因。另外，R1、R2組內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)顯著高于C組，肝代謝功能主要體現(xiàn)于肝細(xì)胞功能[15]，肝損傷時(shí)肝細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞分泌內(nèi)皮細(xì)胞特異性生長(zhǎng)因子，促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞增殖[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著母體受限制程度加深胎兒肝臟結(jié)構(gòu)與功能受到不同程度影響，且與張崇志[14]的研究結(jié)果一致。

表4　妊娠后期IUGR對(duì)蒙古綿羊胎兒肝臟細(xì)胞外基質(zhì)含量的影響

ECM不僅僅是支持組織,而且是供給營(yíng)養(yǎng)和免疫應(yīng)答的場(chǎng)所,適應(yīng)外界環(huán)境和維持內(nèi)部環(huán)境[17]。ECM主要由肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌[3]，包括膠原蛋白(Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原)、蛋白多糖(透明質(zhì)酸)、糖蛋白(層黏連蛋白、纖連蛋白)等[18]。膠原蛋白為生物體提供了一種機(jī)械支撐作用，維護(hù)器官與組織的完整性，保障其正常功能的行使[19]，且Ⅳ型膠原與層黏連蛋白共同構(gòu)成基膜，起到ECM與外界進(jìn)行物質(zhì)交換作用[20]。透明質(zhì)酸可以阻止細(xì)胞中一些酶的產(chǎn)生,減少自由基的形成,防止自由基破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[21]。層黏連蛋白在胚胎發(fā)育中發(fā)揮著決定性作用，其減少可能是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)[22]。且ECM成分與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化等多種細(xì)胞生命活動(dòng)密切相關(guān),對(duì)細(xì)胞的增殖與分化起著十分重要的調(diào)節(jié)作用[23]。本試驗(yàn)條件下，R1組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、層黏連蛋白、透明質(zhì)酸、纖連蛋白含量均顯著或極顯著低于C組，且R2纖連蛋白含量顯著低于C組，表明妊娠后期營(yíng)養(yǎng)限飼使胎兒肝細(xì)胞數(shù)減少，導(dǎo)致ECM合成降低[24]。層黏連蛋白在胚胎發(fā)育中起重要作用，維持細(xì)胞及器官形態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分化，且主要由上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞合成，IUGR導(dǎo)致肝臟內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)降低，可能是影響層黏連蛋白合成降低的重要原因[22]。ECM及其組分的變化可能影響動(dòng)物脂肪細(xì)胞體積、數(shù)量和形態(tài)等方面的變化[23]，表明纖連蛋白是能量限制ECM合成中早期監(jiān)控的重要指標(biāo)。肝臟損傷會(huì)使ECM分泌降低，一方面營(yíng)養(yǎng)限制導(dǎo)致ECM合成能力下降，另一方面，胎兒?jiǎn)?dòng)肝纖維化修復(fù)反應(yīng)[25]。胎兒ECM降解大于合成能力，平衡被打破，且可能導(dǎo)致進(jìn)一步纖維化[26]。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損害，通過(guò)旁分泌途徑使肝細(xì)胞活化和增殖，形成肝纖維化[27]。肝纖維化與ECM分泌密切相關(guān)，本試驗(yàn)中，重度纖維化組織中層黏連蛋白含量升高不明顯，與張崇志[14]研究結(jié)果一致，可能由于機(jī)體修復(fù)能力降低所導(dǎo)致。

4　結(jié)　論

妊娠后期營(yíng)養(yǎng)限飼蒙古綿羊嚴(yán)重限制其胎兒肝臟生長(zhǎng)發(fā)育，代謝能水平為0.175 MJ/(kg BW0.75·d)時(shí)，胎兒肝臟ECM合成受到了嚴(yán)重影響，且發(fā)生肝纖維化修復(fù)反應(yīng)；代謝能水平為0.330 MJ/(kg BW0.75·d)時(shí)，僅有纖連蛋白含量發(fā)生改變。

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*Corresponding author, professor, E-mail: gaofeng1994@sina.com

(責(zé)任編輯王智航)

Effects of Fetal Intrauterine Growth Retardation during Late Pregnancy on Extracellular Matrix Synthesis in Fetal Liver of Mongolia Sheep

HE Shan1LIU Yingchun2,3LI Lingyao1LIANG Wei1GAO Feng1*

(1. College of Animal Science, Inner Mongolian Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2. College of Life Science, Inner Mongolian Agricultural University, Hohhot 010018, China; 3. Inner Mongolia Key Laboratory of Bio-Manufacturing, Hohhot 010018, China)

This study investigated the effects of fetal intrauterine growth retardation (IUGR) during late pregnancy on extracellular matrix synthesis in fetal liver of Mongolia sheep. Eighteen healthy Mongolia sheep with synchronization of estrus and conception were allocated to three groups with 6 replicates per group and 1 sheep per replicate. Metabolizable energy (ME) level was 0.175 (R1 group), 0.330 (R2 group) and 0.670 MJ/(kg BW0.75·d) (Adlibitumgroup, C group), respectively. At day 140 of gestation, ewes were slaughtered to determine parenchyma cell number and extracellular matrix contents in liver of their fetuses. The results showed that liver weight (P<0.01), liver cell number (P<0.05), liver cell nucleus diameter (P<0.01), and the contents of collagen type Ⅰ(P<0.01), collagen type Ⅲ(P<0.05), collagen type Ⅳ (P<0.01), laminin (P<0.01), hyaluronic acid (P<0.05) and fibronectin (P<0.01) in fetal liver of R1 group were significantly lower than those of C group, and endothelial cell number in fetal liver was significantly higher than that of C group(P<0.05); significantly higher fetal liver weight (P<0.05) and fibronectin content (P<0.01) were founded in R2 group compared to C group, and endothelial cell number in fetal liver was significantly enhanced in R1 group compared to C group (P<0.05). The results indicate that nutrition restriction during late pregnancy of Mongolia sheep restricts growth and development of fetal liver, and a serious impact on the synthesis of extracellular matrix is found when ME level is 0.175 MJ/(kg BW0.75·d), and liver fibrosis repair reaction also occurs; only the change of fibronectin content in liver fetal is found when ME level is 0.330 MJ/(kg BW0.75·d).[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(9)：2749-2754]

nutrition restriction; fetal liver; liver parenchyma cell; extracellular matrix

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.09.012

2016-03-09

國(guó)家自然科學(xué)基金(31260559,31460612)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金杰出青年項(xiàng)目(2013JQ02)；內(nèi)蒙古自治區(qū)青年創(chuàng)新人才項(xiàng)目——“草原英才”工程后備人才選拔計(jì)劃

何珊(1987—)，女，黑龍江牡丹江人，碩士研究生，從事反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail: 15690992928@163.com

高峰，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: gaofeng1994@sina.com

S826

A

1006-267X(2016)09-2749-06