項(xiàng)　云，章嘯君，屠平光，樓芳芳，肖英平

(1.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧所，浙江金華 321017；2.浙江省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所)

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試驗(yàn)研究

仔豬腸道微生物宏基因組的研究分析

項(xiàng)云1，章嘯君1，屠平光1，樓芳芳1，肖英平2

(1.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧所，浙江金華 321017；2.浙江省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所)

試驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)分析仔豬在不同生長(zhǎng)階段腸道微生物菌群的動(dòng)態(tài)變化。從同窩仔豬中隨機(jī)選擇健康仔豬3頭，于出生當(dāng)天(0 d)、出生后5 d、7 d、15 d、23 d(21日齡斷奶，即斷奶后2 d)和60 d收集仔豬糞便樣品進(jìn)行16SDNA V3-V4段測(cè)序，對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行聚類分析和物種分類學(xué)分析，以綱分類進(jìn)行仔豬糞便微生物宏基因分析。結(jié)果表明，仔豬出生當(dāng)天(0 d)的優(yōu)勢(shì)菌主要為γ-變形菌、桿菌、β變形菌、梭狀芽胞桿菌、黃桿菌、擬桿菌；出生后5 d的優(yōu)勢(shì)菌主要為梭狀芽胞桿菌、擬桿菌、桿菌、γ-變形菌；出生后7 d的優(yōu)勢(shì)菌主要為梭狀芽胞桿菌、桿菌、擬桿菌、γ-變形菌、黃桿菌、β變形菌、ε變形菌；出生后15 d的優(yōu)勢(shì)菌主要為梭狀芽胞桿菌、桿菌、γ-變形菌、擬桿菌；出生后23 d的優(yōu)勢(shì)菌主要為梭狀芽胞桿菌、擬桿菌、革蘭氏陰性厚壁菌；出生后60 d的優(yōu)勢(shì)菌主要為梭狀芽胞桿菌、擬桿菌、桿菌、革蘭氏陰性厚壁菌。研究表明，仔豬在剛出生階段腸道微生物菌群與其他階段顯著不同，且21日齡斷奶對(duì)菌群分布影響較大。

腸道微生物；宏基因組；仔豬

仔豬腸道中生存著大量微生物，主要包括細(xì)菌和真核微生物等，其中細(xì)菌數(shù)量達(dá)1 000～1 150種，主要是厭氧細(xì)菌[1]。Leser TD等(2004)[2]研究發(fā)現(xiàn)，豬腸道中低G+C革蘭氏陽(yáng)性菌(硬壁菌門(mén)，真桿菌類及親屬、梭菌屬及親屬、芽胞桿菌屬、乳酸桿菌屬、鏈球菌屬等)占腸道細(xì)菌的81%；革蘭氏陰性菌(主要為擬桿菌門(mén)，噬纖維菌屬、擬桿菌屬、屈撓桿菌屬、普雷沃氏菌屬等)占11.2%，即擬桿菌門(mén)和硬壁菌門(mén)占豬腸道細(xì)菌的90%以上。

豬腸道微生物的動(dòng)態(tài)平衡是豬腸道健康的標(biāo)志，腸道健康則是豬只健康生長(zhǎng)的基礎(chǔ)。眾多研究表明，腸道微生物優(yōu)勢(shì)菌群的組成明顯影響著豬體的健康，豬腸道中有益菌含量越高，豬只越健康[3]。目前豬日糧中普遍使用抗生素，特別是仔豬日糧中大多采用添加抗生素方法來(lái)預(yù)防仔豬腹瀉，抗生素的使用則增加了病原菌的耐藥性，導(dǎo)致了生態(tài)環(huán)境污染和食品安全問(wèn)題。因此，仔豬哺乳和保育生長(zhǎng)階段，利用高通量測(cè)序技術(shù)開(kāi)展其腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)分析，對(duì)干預(yù)豬體腸道疾病和減少抗生素使用具有重要意義，可為益生菌在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料試驗(yàn)在金華市某生態(tài)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行，從同窩仔豬中選擇健康仔豬3頭，按出生當(dāng)天(0 d)、5 d、7 d、15 d、23 d、60 d分為6組采集仔豬新鮮糞便。

采集糞便時(shí)手載無(wú)菌手套防止污染，采集糞便置于50 mL無(wú)菌離心管中，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)方法委托上海某生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行微生物宏基因組測(cè)序。

MiSeq測(cè)序試驗(yàn)流程為基因組DNA提取、設(shè)計(jì)合作引物、接頭 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純 PCR定量和均一化、MiSeq PE 文庫(kù)制備MiSeq高通量測(cè)序。

生物信息分析流程為Miseq測(cè)序得到PE reads，首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾。

1.3統(tǒng)計(jì)分析區(qū)分樣本后進(jìn)行聚類分析(OTU)和物種分類學(xué)分析。

基于OTU可以進(jìn)行多種分析；物種分類學(xué)分析，可在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)分析。所以，本試驗(yàn)主要采用綱分類水平分析。

2　結(jié)果與分析

2.1仔豬糞便微生物宏基因組綱水平上測(cè)定的OTU值與物種分類詳見(jiàn)表1、圖1。

表1　不同日齡仔豬糞便微生物宏基因組的OTU測(cè)定均值

圖1　各日齡仔豬糞便微生物宏基因組以綱水平測(cè)定的OUT均值

由表1、圖1可見(jiàn)，γ-變形菌綱在仔豬剛出生時(shí)豐度最高，達(dá)到19876。5日齡后梭狀芽胞桿菌豐度最高。仔豬21日齡斷奶，23日齡時(shí)以擬桿菌豐度最高，桿菌豐度則較低，60日齡時(shí)則桿菌豐度回升。2.2仔豬糞便優(yōu)勢(shì)菌群分析詳見(jiàn)表2。

如以某菌豐度高于平均數(shù)以上為優(yōu)勢(shì)菌群。由表1、表2及圖1可見(jiàn)，其測(cè)定結(jié)果如下。

0 d：仔豬出生時(shí)腸道優(yōu)勢(shì)菌群綱水平依次為γ-變形菌、桿菌、β變形菌、梭狀芽胞桿菌、黃桿菌、擬桿菌。

5 d：仔豬腸道優(yōu)勢(shì)菌群綱水平依次為梭狀芽胞桿菌、擬桿菌、桿菌、γ-變形菌。

表2　不同日齡仔豬糞便微生物宏基因組測(cè)定的OTU值所占比例

7 d：仔豬腸道優(yōu)勢(shì)菌群綱水平依次為梭狀芽胞桿菌、桿菌、擬桿菌、γ-變形菌、黃桿菌、β變形菌、ε變形菌、

15 d：仔豬腸道優(yōu)勢(shì)菌群綱水平依次為梭狀芽胞桿菌、桿菌、γ-變形菌、擬桿菌。

23 d：仔豬腸道優(yōu)勢(shì)菌群綱水平依次為梭狀芽胞桿菌、擬桿菌、革蘭氏陰性厚壁菌。

60 d：仔豬腸道優(yōu)勢(shì)菌群綱水平依次為梭狀芽胞桿菌、擬桿菌、桿菌、革蘭氏陰性厚壁菌。

3　小結(jié)與討論

3.1從仔豬腸道微生物宏基因組分析可知，以微生物核糖體16SrDAN可變區(qū)V3和V4進(jìn)行測(cè)序的宏基因組分析方法與傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)鑒別方法相比，可快速鑒別出從門(mén)綱目科屬種各層次的微生物，為后續(xù)分析提供基礎(chǔ)[4]。

3.2由表2、圖1可見(jiàn)，仔豬出生時(shí)γ-變形菌占19.19%，而γ-變形菌主要為腸桿菌科、弧菌科、假單胞菌科、沙門(mén)氏菌屬、綠膿桿菌等病原菌，表明仔豬一出生，外界環(huán)境中的微生物就可能通過(guò)口腔、食道進(jìn)入胃腸道中。充分反映了仔豬在出生后3 d哺足初乳的重要性。因?yàn)椴缸愠跞橛兄谔岣邫C(jī)體的免疫力，降低因外界環(huán)境中存在的病原微生物而引起疾病。在仔豬5日齡階段，γ-變形菌含量下降，僅為1.17%，而梭狀芽胞桿菌變成主要的優(yōu)勢(shì)菌群，占18.89%。

3.3據(jù)本次試驗(yàn)，5日齡仔豬的腸道菌群分布與60日齡類似，其中梭狀芽胞桿菌、桿菌為優(yōu)勢(shì)菌群，且均為健康仔豬，表明仔豬出生后就快速建立了腸道微生物生態(tài)菌群。

3.4據(jù)試驗(yàn)可知，23日齡仔豬的腸道桿菌豐度下降，擬桿菌豐度增加，與5 d、7 d、15 d和60日齡階段腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)均有一定差異，原因可能是仔豬21日齡斷奶，斷奶應(yīng)激對(duì)腸道菌群分布影響較大所致[5]。

本次分析僅從綱分類層次進(jìn)行了比較，因腸道微生物種類眾多，按何種分類層次分析及微生物是否有更為理想的比例模式表達(dá)，則有待進(jìn)一步研究探討。

[1]Gill SR, Pop M, DeBoy RT, et a1. Metagenomic analysis of the Human distal gut microbiome[J]. Science, 2006,312:1355-1359.

[2]Leser TD, Amemuvor JZ, Jensen TK, et a1. Culture-independent analysis of gut bacteria: the pig gastrointestinal tract microbiatarevisited[J]. Appl Environ Microbiol, 2004,68:673-690.

[3]肖文萍. 藏豬腸道微生物多樣性的研究[D]. 西北農(nóng)林科技大學(xué),2012.

[4]王雪，趙龍玉，趙鳳春，等. 應(yīng)用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)探究長(zhǎng)根菇多糖對(duì)小鼠腸道菌群的影響[J].食品科學(xué)，2015,36(19):222-226.

[5]朱偉云, 余凱凡, 慕春龍,等. 豬的腸道微生物與宿主營(yíng)養(yǎng)代謝[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2014,10:3046-3051.

2016-05-20

國(guó)家自然科學(xué)基金(31402083)

項(xiàng)云(1963-)，男，浙江金華人，研究員，主要研究方向?yàn)榻鹑A豬選育等。E-mail：xyjhzj@aliyun.com

肖英平，博士，主要研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)調(diào)控與腸道微生物。E-mail：ypxiaozju@126.com

S828.4+5

A

1005-7307(2016)05-0001-004