崔學(xué)強張樹珍馮翠蓮

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 甘蔗研究中心 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點開放實驗室，?？?571101；2. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海口 570228）

一種簡易的甘蔗葉組織PCR模板制備方法

崔學(xué)強1，2張樹珍2馮翠蓮2

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 甘蔗研究中心 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點開放實驗室，?？?571101；2. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？?570228）

以轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片為材料，少量嫩葉經(jīng)堿并短暫高溫處理，再中和，形成裂解混合物。直接以此為模板，轉(zhuǎn)基因甘蔗外源基因bar、KP4、Cry1Ac-2A-gna融合基因及內(nèi)源基因Shactin基因為靶基因，PCR擴增結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確、重復(fù)性強，完全可以達到常規(guī)CTAB法提取的DNA擴增效果。用此方法制備的模板室溫下2周之內(nèi)，4℃、-20℃下一個月之內(nèi)結(jié)果不變。經(jīng)多種外源基因PCR反應(yīng)的反復(fù)驗證，證實了這種方法在轉(zhuǎn)基因甘蔗檢測中的廣泛適用性。該方法快速制備PCR模板，無需DNA提取過程，具有使用樣品量少，成本低、簡便、快捷等優(yōu)點。

甘蔗；堿裂解；中和；PCR模板；多重PCR

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是世界上一種重要的糖料作物和能源作物。培育高產(chǎn)、高糖、高抗的甘蔗新品種一直是甘蔗育種的主要目標(biāo)。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為甘蔗育種的重要方法。該技術(shù)通過將特定的基因?qū)敫收嶂?，不僅可以使甘蔗的產(chǎn)量和品質(zhì)性狀得以提高，還能縮短育種的年限和周期［1］。目前，對轉(zhuǎn)基因甘蔗植株的初步檢測，國內(nèi)外的實驗室及檢測部門運用最廣泛的是PCR技術(shù)，該方法簡便快捷，靈敏度高［2，3］。然而對轉(zhuǎn)基因甘蔗進行PCR鑒定的前提是必須提取甘蔗植株基因組DNA，目前提取DNA的方法有很多種，使用最多的主要有CTAB法［4］、SDS法［5］及其改良法［6］。這些方法提取DNA所需材料多，步驟繁瑣，費時費力且純化程序復(fù)雜，因此當(dāng)需要檢測的轉(zhuǎn)基因植株較多時，這些方法顯得不太適用［7，8］。本實驗擬研究出一種適用于轉(zhuǎn)基因甘蔗檢測的PCR 模板的快速制備方法。該方法快速制備PCR模板，無需DNA 提取過程，具有使用材料少，成本低、簡便、快捷等優(yōu)點。尤其適合材料比較寶貴的轉(zhuǎn)基因甘蔗的預(yù)篩選和大樣本量的PCR 檢測，以期為轉(zhuǎn)基因甘蔗分子育種的實際應(yīng)用創(chuàng)造了條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 轉(zhuǎn)KP4基因和轉(zhuǎn)CryIAc-2A-gna融合基因甘蔗植株由本課題組利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得，導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植株的骨架載體為pCAMBIA3300，篩選基因為bar基因，對照植株為非轉(zhuǎn)基因ROC-22植株。

1.1.2 主要試劑與儀器 2×Taq MasterMix購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；2000 bp DNA Ladder Maker（M1101）購自東盛生物公司；瓊脂糖購自Sigma公司；NaOH、HCl、Tris-HCl等購自廣州化學(xué)試劑廠，均為分析純；PCR擴增儀T1 Thermocycle（Biometra）；常溫離心機（HETTICHD-78532）；恒溫水浴鍋（浦光HH-4）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 利用Primer Premier V 5.0分別設(shè)計合適引物，再利用Oligo V6.22對設(shè)計的引物進行評估排除引物之間的干擾，引物設(shè)計完成由上海生工合成（表1）。

表1 PCR引物序列及產(chǎn)物長度

1.2.2 轉(zhuǎn)基因甘蔗PCR反應(yīng)模板制備 取甘蔗幼嫩葉片0.5 cm2左右剪碎，放入1.5 mL的Eppendorf管中，加入100 μL 0.25 mol/L的NaOH，將此離心管插入沸水中煮30 s，取出加入100 μL 0.25 mol/L的HCl和50 μL 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）再將該管放入沸水中孵育2 min，室溫條件下10 000 r/min離心2 min，取上清2 μL直接作為模板進行PCR反應(yīng)。

1.2.3 單PCR檢測甘蔗轉(zhuǎn)基因成分 以轉(zhuǎn)KP4、CryIAc-2A-gna基因甘蔗的葉片浸出液為模板，分別用表1中相應(yīng)引物進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：2×Taq MasterMix 10 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），模板2 μL，用ddH2O將終體積調(diào)整到20 μL。KP4和bar基因PCR擴增的退火溫度為60℃，CryIAc基因和CryIAc-2A-gna基因的退火溫度為56℃，Shactin基因退火溫度為52℃，所有基因的退火時間均為1 min，PCR結(jié)束后取10 μL PCR擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 多重PCR檢測甘蔗轉(zhuǎn)基因成分 選取6株轉(zhuǎn)基因甘蔗作為實驗材料，陰性對照為非轉(zhuǎn)基因植株ROC-22，ddH2O作為空白對照，同時擴增KP4基因和bar基因及CryIAc-2A-gna基因、CryIAc基因和bar基因驗證該方法在轉(zhuǎn)基因甘蔗多重PCR檢測上面的可靠性及適用性。（1）KP4基因、bar基因擴增體系：2×Taq MasterMix 10 μL，模板2 μL，KP4基因和bar基因上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），用ddH2O將終體積調(diào)整到20 μL。PCR擴增的退火溫度為60℃，時間1 min，PCR結(jié)束后取10 μL PCR擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。（2）CryIAc-2A-gna融合基因、CryIAc基因、bar基因擴增體系：2×Taq MasterMix 10 μL，模板2 μL，CryIAc-2A-gna融合基因、CryIAc基因及bar基因上下游引物各1 μL（10 μmol/L），用ddH2O將終體積調(diào)整到20 μL。PCR擴增的退火溫度為56℃，時間1 min，PCR結(jié)束后取10 μL PCR擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 堿處理葉片浸出液在不同溫度下保存的DNA穩(wěn)定性 將模板分別保存室溫、4℃、-20℃的環(huán)境下，分別于7、15和30 d，進行單PCR擴增CryIAc-2A-gna融合基因檢測模板DNA的穩(wěn)定性。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因甘蔗用量對PCR模板制備的影響 以轉(zhuǎn)KP4基因甘蔗幼嫩葉作為材料，嫩葉用量設(shè)置0.25、0.5、1、1.5、2和2.5 cm26個處理，用堿處理法制備PCR模板，制備方法同1.2.2，比較PCR擴增效果。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因甘蔗不同生長狀態(tài)對PCR模板制備的影響 分別選取轉(zhuǎn)KP4基因甘蔗生長初期幼嫩葉、生長中期綠色葉、生長中后期泛黃葉及生長后期枯黃老葉作為實驗材料，用堿處理法制備PCR模板，制備方法同1.2.2，比較PCR擴增效果。

2 結(jié)果

2.1 單PCR檢測甘蔗轉(zhuǎn)基因成分

如圖1所示，以堿處理的葉片浸出液為模板，不同基因引物進行單PCR反應(yīng)擴增甘蔗轉(zhuǎn)基因成分及內(nèi)源基因，均能擴增出與目的基因預(yù)期大小相符的基因片段。

圖1 單PCR檢測甘蔗轉(zhuǎn)基因成分電泳結(jié)果

2.2 多重PCR反應(yīng)檢測甘蔗轉(zhuǎn)基因成分

如圖2-A所示，以CTAB法提取的模板為陽性對照，6株轉(zhuǎn)KP4基因植株堿處理的葉片浸出液為模板，同時加入KP4基因及bar基因引物，均能擴增出與陽性對照大小相同的基因片段。如圖2-B所示，以轉(zhuǎn)CryIAc-2A-gna基因植株堿處理的葉片浸出液為模板，同時加入CryIAc基因、bar基因及CryIAc-2A-gna基因引物，均擴增出了與陽性對照大小相同的基因片段。

圖2 多重PCR反應(yīng)檢測甘蔗轉(zhuǎn)基因成分電泳結(jié)果

2.3 堿處理葉片浸出液在不同溫度下保存對實驗結(jié)果的影響

堿處理的葉片浸出液分別保存于常溫、4℃、-20℃條件下，3種條件下保存7 d的模板均能擴增出目的基因片段且擴增結(jié)果無顯著差異（圖3-A）；室溫保存15 d的模板有部分?jǐn)U增產(chǎn)生了雜帶，未能擴增出目的基因片段，而4℃、-20℃保存的模板均能擴增出特異的目的基因片段（圖3-B）；室溫保存30 d的模板均擴增出非特異條帶，未能擴增目的基因片段，4℃、-20℃保存的模板仍可擴增出特異的目的基因片段（圖3-C）。

圖3 模板DNA在不同溫度下保存7 d（A）、15 d（B）和30 d（C）的PCR擴增電泳圖

2.4 轉(zhuǎn)基因甘蔗不同生長狀態(tài)及不同用量對實驗結(jié)果的影響

如圖4所示，對樣品不同生長狀態(tài)下的葉片制備的模板進行KP4基因及bar基因的擴增結(jié)果表明，幼嫩葉擴增條帶最亮，隨著葉片的老化，擴增條帶漸暗，葉片成枯黃時雖能擴增條帶，但條帶已很模糊。對不同樣品用量制備的模板進行KP4基因（圖4-A）及bar基因（圖4-B）的擴增結(jié)果表明：取0.25 cm2左右的嫩葉剪碎制取的模板擴增條帶較不清晰，葉面積在0.50-2.5 cm2之間制備的模板擴增結(jié)果無顯著差異。

圖4 樣品不同生長狀態(tài)及不同用量所制取模板的PCR擴增圖

3 討論

本研究的出發(fā)點是為大批量的轉(zhuǎn)基因甘蔗建立一種簡便、快捷的檢測方法，為甘蔗分子育種工作奠定基礎(chǔ)。運用本實驗的方法僅需要取幼嫩葉片微量的葉尖即可進行上百次的PCR反應(yīng)，同時堿處理法制備PCR模板僅需加熱和中和兩個過程，區(qū)別于傳統(tǒng)的CTAB法和SDS法，可以省去低溫研磨、DNA抽提等繁瑣步驟，雖然此方法制備的模板可能含有蛋白質(zhì)、鹽類等雜質(zhì)，但通過實驗對單基因和多基因擴增實驗反復(fù)驗證，證明其在轉(zhuǎn)基因檢測中的可靠性。該方法在轉(zhuǎn)基因水稻［9，10］、小麥［11］檢測中已有相關(guān)文獻報道，并在檢測中得到了實際運用。針對甘蔗快速制備PCR模板的方法之前已有文獻報道，如陳忠良等［12］用于甘蔗SSR-PCR模板制備采用的改良SDS法、DNA快速提取法；陳平華等［13］快速制備大批量甘蔗模板的堿裂解葉片法等。陳忠良等采用的改良SDS法在傳統(tǒng)SDS法基礎(chǔ)上進行了操作步驟的簡化，DNA快速提取法則是直接用提取液來處理甘蔗葉片，之后在處理液中加入蛋白酶K進行水浴和冰浴處理，離心取上清并加入RNaseA，最后即可制取模板。這兩種方法與本實驗的堿裂解法相比操作步驟相對繁瑣，成本較高，但其具有制取的模板所含雜質(zhì)較少的優(yōu)點。陳平華等［13］采用的堿裂解葉片法與本實驗的方法有許多相似之處，但是采用的裂解液與中和液有明顯區(qū)別，其所用裂解液為KOH與Tween-20的混合液，中和液為Tris-HCl與EDTA的混合液，而本實驗采用的裂解液NaOH溶液，中和液為HCl和Tris-HCl。陳平華等的方法與本實驗方法相比所用試劑較多，成本較高但與本實驗擴增效果無明顯差別。

實驗在樣品不同生長狀態(tài)下制備模板擴增結(jié)果表明，幼嫩葉較宜制備模板。其原因可能是幼嫩葉所含DNA量大，加熱處理細胞易破裂，而隨著葉片的衰老，其體內(nèi)的DNA出現(xiàn)了一定程度的降解，同時DNA從細胞中釋放的難度也有所加大。對樣品用量研究表明，0.5 cm2左右嫩葉就能滿足實驗的要求，且隨著樣品用量的增加模板擴增結(jié)果并無顯著變化。其原因可能是在提取試劑一定的情況下，樣品量的加大并不能使制取的模板量增大。對模板穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明，如果模板放置于室溫條件下穩(wěn)定性較差，其主要原因可能是室溫條件，利于菌類生長，導(dǎo)致模板的降解。4℃、-20℃的條件較常溫不利于菌的生長，同時較低的溫度更有利于穩(wěn)定模板DNA的結(jié)構(gòu)，一般能保存較長時間。本實驗對條件的摸索確定將為后期的研究工作奠定基礎(chǔ)，提供參考。

4 結(jié)論

以轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片為材料，0.5 cm2左右嫩片經(jīng)堿并短暫高溫處理，再中和，形成裂解混合物。直接以此為模板，轉(zhuǎn)基因甘蔗外源基因及內(nèi)源基因基因擴增結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確、重復(fù)性強。用此方法制備的模板室溫下2周之內(nèi)，4℃、-20℃下一個月之內(nèi)結(jié)果不變。本方法制備的甘蔗葉組織模板可用于后續(xù)轉(zhuǎn)基因甘蔗檢測。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

A Simple Method for Preparing PCR Template of Sugarcane Leaf Tissue

CUI Xue-qiang1，2ZHANG Shu-zhen2FENG Cui-lian2
（1. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology of CATAS，Sugarcane Research Center，Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crops of Ministry of Agriculture，Haikou 571101；2. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228）

Using transgenic sugarcane leaves as materials，a small amount of young leaves were treated by alkali and transient heat，then neutralized，and cracking mixture was formed. The mixture was directly used as the template of PCR，and transgenic sugarcane exogenous gene of bar，KP4，CryIAc-2A-gna and endogenous gene Shactin as target genes，the amplified results were stable，accurate and reproducible，which reached the same effect of DNA amplification by conventional CTAB method. The templates by this method were still stable at room temperature for 2 weeks and at 4℃，-20℃ for 1 month. A series of exogenous gene PCR reactions were tested，which verified that this method was widely available in the detection of transgenic sugarcane. The method is fast for preparation of PCR templates without DNA extraction process，owing the advantages of requiring less material sample，low cost，simple，rapid，and efficient.

sugarcane；alkali lysis；neutralization；PCR template；multiple PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.012

2015-09-11

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（ITBB140502），現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項基金（CARS-20-2-5）

崔學(xué)強，男，碩士研究生，研究方向：植物細胞與分子生物學(xué)；E-mail：yncuixueqiang@126.com

馮翠蓮，女，博士，助理研究員，研究方向：甘蔗生物技術(shù)；E-mail：fengcuilian @126.com