翟磊 蘇姣姣 劉洋 曹艷花 姚粟 程池

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015）

食醋中污染菌的分離與鑒定

翟磊 蘇姣姣 劉洋 曹艷花 姚粟 程池

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015）

首次關(guān)于耐酸乳桿菌是引起食醋變質(zhì)的報道，旨在為食醋生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行微生物污染控制提供理論依據(jù)。采用PCRDGGE技術(shù)以及純培養(yǎng)技術(shù)，對正常醋樣和污染醋樣的微生物群落結(jié)構(gòu)和種類進(jìn)行了研究，通過對比分析以及回接實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了引起食醋變質(zhì)的污染菌為耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）。

PCR-DGGE；純培養(yǎng)技術(shù)；耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）

食醋在中國擁有上千年的歷史，因其具有色澤紅棕，酸味柔和，醇香回甜，久陳不腐等特點(diǎn)，成為深受人們喜愛的一種調(diào)味品。食醋主要是以含淀粉、糖或乙醇的原料發(fā)酵釀造而得，通過微生物的代謝作用產(chǎn)生的眾多酶系催化實(shí)現(xiàn)醋酸等基本風(fēng)味物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，本質(zhì)上是一個微生物菌種混合發(fā)酵的復(fù)雜過程。目前國內(nèi)關(guān)于食醋微生物的研究主要集中在傳統(tǒng)食醋釀造過程中微生物群落的多樣性及功能性方面。食醋中醋酸的形成包括淀粉轉(zhuǎn)化為乙醇和乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸兩個過程，其中淀粉質(zhì)原料的糊化、糖化及酒化主要是通過霉菌和酵母菌以及分泌的多種水解酶系的共同催化完成的，醋酸發(fā)酵階段是在包括醋酸菌在內(nèi)的眾多細(xì)菌以及分泌的水解酶系作用下生成醋酸，形成食醋的主體風(fēng)味［1-5］。

雖然微生物在釀醋過程中發(fā)揮著重要作用，但是食醋釀造過程中的微生物污染是亟待解決的難題。微生物污染后的食醋產(chǎn)生異味、出現(xiàn)顏色變淺、醋中固形物減少等現(xiàn)象，大大降低了食醋的營養(yǎng)價值。本研究采取PCR-DGGE 技術(shù)對正常醋樣和污染醋樣的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，研究發(fā)現(xiàn)引起食醋變質(zhì)的潛在污染菌；在此基礎(chǔ)上，采用可培養(yǎng)的方法對正常醋樣和污染醋樣的微生物進(jìn)行分離純化及鑒定，結(jié)合污染菌回接試驗(yàn)以期分離得到引起食醋變質(zhì)的污染菌，旨為食醋生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行微生物污染控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

某食醋生產(chǎn)企業(yè)食醋生產(chǎn)過程中的正常醋樣和污染醋樣。

1.2 方法

1.2.1 樣品理化特征比較 從醋樣顏色、氣味、可溶性固形物、pH值和CO2含量方面對正常醋樣和污染醋樣的理化特征進(jìn)行比較。

1.2.1.1 可溶性固形物含量測定 取正常醋樣和污染醋樣各20 mL，10 000×g，離心10 min后棄掉上清，比較固形物含量。

1.2.1.2 pH值測定 取正常醋樣和污染醋樣各20 mL至于滅菌的燒杯中，使用pH計(jì)直接測定。

1.2.1.3 CO2含量測定 取正常醋樣和污染醋樣瓶中的氣體，使用氣相色譜法測定。檢測條件為：柱溫箱170℃，進(jìn)樣器溫度120℃，檢測器溫度120℃，分析柱為TDX-01，載氣為He。

1.2.2 樣品微生物群落結(jié)構(gòu)分析 利用PCR-DGGE對正常醋樣和污染醋樣的微生物群落進(jìn)行比較分析［6-8］。

1.2.2.1 樣品中微生物總DNA提取 微生物總DNA提取采用試劑盒方法進(jìn)行，試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。提取獲得的總DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增 用通用引物341f-GC和534r進(jìn)行16S rRNA基因V3可變區(qū)片段的擴(kuò)增。341f-GC：5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCC CGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'（40個堿基GC夾）；534r：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。PCR反應(yīng)50 μL體系包括10×PCR buffer（不含Mg2+）5.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，Taq酶（2.5 U/μL）1.2 μL，模板各1 μL，上下游引物10 mmol/L各1 μL，無菌雙蒸水補(bǔ)齊至25 μL。PCR反應(yīng)程序如下94℃預(yù)變性5 min 后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)，72℃再次延伸10 min。

1.2.2.3 變性梯度凝膠電泳（DGGE） 16S rRNA基因V3可變區(qū)片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過DGGE系統(tǒng)進(jìn)行分離。丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性梯度為40%-60%。60℃恒溫，80 V下電泳16 h，電泳完畢后用SYBR green I（1×TAE，1∶10 000）染色45 min，電泳結(jié)果通過凝膠成像系統(tǒng)（英國UVI）及Quantity one分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.2.4 DGGE條帶的回收、重新擴(kuò)增、克隆、轉(zhuǎn)化、序列測定及分析 在波長為 354 nm 紫外線下，切取DGGE 凝膠上的主要條帶，溶于 50 μL 無菌去離子水中，4℃過夜溶解。重?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到載體pEASY-T1（TRANS），轉(zhuǎn)入 E. coli 感受態(tài)細(xì)胞，在LB 固體培養(yǎng)基上 37℃ 篩選培養(yǎng) 16 h，挑取白色轉(zhuǎn)化子用含有氨芐青霉素抗性的 LB液體培養(yǎng)基 37℃震蕩培養(yǎng) 8 h。T-載體通用引物進(jìn)行菌液 PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，每個樣品3個陽性克隆交由生工生物工程（上海）有限公司完成測序。所測得的16S rRNA基因V3可變區(qū)序列用DNASTAR軟件去除載體序列和GC夾后，將有效序列在NCBI上進(jìn)行比對，以其中同源性最高的序列為參考序列，相似性≥97%的序列歸為同一操作分類單元（OTU）。

1.2.3 樣品中可培養(yǎng)微生物的分離純化與鑒定

1.2.3.1 樣品中微生物的分離純化 在限菌條件下量取25 mL正常醋樣，放入盛有225 mL無菌水帶玻璃珠的三角瓶中，充分振蕩20 min，之后靜置5 min。采用梯度稀釋法制備10-2到10-6的系列稀釋液，分別涂布到NA和MRS培養(yǎng)基中在37℃下培養(yǎng)2-7 d。挑單菌落轉(zhuǎn)接到新鮮的上述培養(yǎng)基斜面上于4℃保藏。采取同樣的方法對污染醋樣中微生物進(jìn)行分離純化［9］。

1.2.3.2 樣品中微生物的鑒定 以基因組DNA為模板，利用通用引物對16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為：正向引物799f（5'-AACAGGATTAGATACCCTG-3'），反向引物1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）［10］。50 μL PCR反應(yīng)體系：50 ng DNA模板，1×Taq reaction buffer，引物各20 pmol，20 μmol dNTP，1.5單位Taq酶（Ferments）。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，52℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖進(jìn)行檢測。純化后的PCR產(chǎn)物用ABI3700基因測序儀測序。測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。測序結(jié)果用Chromas軟件參照正反序列圖譜人工校對。將測序得到的結(jié)果在EzTaxon server 2.1進(jìn)行比對［11］，確定與已知序列的同源關(guān)系。

1.2.4 食醋中污染菌的回接實(shí)驗(yàn) 將分離得到的食醋污染菌接種到正常醋樣中，37℃厭氧培養(yǎng)7 d，觀察醋樣變化。

2 結(jié)果

2.1 正常醋樣和污染醋樣理化特征

正常醋樣和污染醋樣的理化特征對比結(jié)果如表1所示。

表1 正常醋樣和污染醋樣特征對比

2.2 正常醋樣和污染醋樣PCR-DGGE圖譜分析

將正常醋樣和污染醋樣的總DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得大小約為200 bp的16S rRNA基因V3可變區(qū)的序列。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE檢測，獲得正常醋樣和污染醋樣中微生物群落結(jié)構(gòu)的DGGE指紋圖譜（圖1），每條泳帶代表一種樣品中微生物DGGE指紋圖譜，不同位置的條帶理論上應(yīng)代表不同種類的細(xì)菌，條帶的熒光強(qiáng)度則反應(yīng)了該細(xì)菌的含量，條帶信號越亮，表示該種細(xì)菌的相對數(shù)量越多。如圖1表明，正常醋樣和污染醋樣中之間微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異，但優(yōu)勢菌條帶相對比較穩(wěn)定。

圖1 正常醋樣和污染醋樣中微生物DGGE分離圖譜及分析示意圖

表2 優(yōu)勢條帶測序比對分析結(jié)果

2.3 正常醋樣和污染醋樣微生物群落結(jié)構(gòu)比較分析

為進(jìn)一步研究正常醋樣和污染醋樣中微生物群落結(jié)構(gòu)組成成分，經(jīng)DGGE電泳后，對其中6個優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠、回收、克隆、測序（表2）。測序結(jié)果經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫比對后，序列相似性均大于97%，比對結(jié)果顯示正常醋樣中出現(xiàn)的條帶1和4均鑒定為木葡糖酸醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus），葡糖酸醋桿菌是制醋過程中產(chǎn)生醋酸的功能微生物之一，能夠?qū)⒔湍妇纸猱a(chǎn)生的葡萄糖和果糖轉(zhuǎn)化為醋酸、葡萄糖酸等產(chǎn)物，同時分解醋酸酶，將乙醇氧化為醋酸。而污染醋樣中出現(xiàn)的條帶2，3和5，6盡管電泳的位置有所差別，但是均鑒定為耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans），這可能是由于少數(shù)堿基變異造成的。在生產(chǎn)過程中，耐酸乳桿菌能夠?qū)⑵咸烟堑鹊孜镛D(zhuǎn)化為醋酸和乳酸，豐富醋的風(fēng)味。一旦其出現(xiàn)在成品醋中就會引起醋的變質(zhì)和腐敗。通過PCR-DGGE分析發(fā)現(xiàn)，污染醋樣中存在的耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）是引起食醋的潛在污染菌。

2.4 正常醋樣和污染醋樣可培養(yǎng)微生物的分離純化與鑒定

采用PCR-DGGE技術(shù)分析微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）是潛在的引起食醋變質(zhì)的污染菌，為了進(jìn)一步確認(rèn)，需要采用稀釋梯度平板法對正常醋樣和污染醋樣中的微生物進(jìn)行純培養(yǎng)。通過平板劃線純化和分子生物學(xué)鑒定，從正常醋樣中分離得到了葡糖酸醋桿菌屬（Gluconacetobacter sp.）菌株，蠟樣芽孢桿菌群（Bacillus cereus group）菌株以及纖維微菌屬（Cellulosimicrobium sp.）菌株；而污染的樣品中分離得到了耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans），短桿菌屬（Brevibacterium sp.）菌株以及賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus sp.）菌株（表3）。樣品中可培養(yǎng)微生物的分離純化與鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，污染醋樣中含有引起醋樣變質(zhì)的潛在污染菌-耐酸乳桿菌，這也與非培養(yǎng)研究的結(jié)果一致。目前耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）已經(jīng)保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號為CICC 10774。

表3 正常醋樣和污染醋樣中可培養(yǎng)微生物

2.5 回接實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步確認(rèn)耐酸乳桿菌就是引起食醋變質(zhì)的污染菌，將耐酸乳桿菌接種到正常醋樣中進(jìn)行回接試驗(yàn)?；亟訉?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，耐酸乳桿菌的接入會引起正常醋樣出現(xiàn)產(chǎn)氣，淡腐，臭味顏色變淺，可溶性固形物減少以及pH值升高等變質(zhì)現(xiàn)象。因此我們確定耐酸乳桿菌就是引起食醋變質(zhì)的污染菌。

3 討論

非培養(yǎng)技術(shù)是指借助于分子生物學(xué)方法，直接對樣品的微生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其中變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)是最為常見的研究微生物群落結(jié)構(gòu)組成的非培養(yǎng)分析方法，其基本原理為在含有濃度線形遞增的變性劑的聚丙烯酰胺凝膠電泳中對PCR產(chǎn)物分離，部分解鏈的雙鏈DNA分子的電泳遷移率降低，而序列不同的DNA 分子有著不同的解鏈行為，它們在凝膠的不同位置停止遷移從而使長度相同而序列不同的DNA 片段分離。廣泛應(yīng)用于研究湖泊、海洋、活性污泥、發(fā)酵食品及各種土壤等生態(tài)環(huán)境的微生態(tài)研究中［6-8］。可培養(yǎng)技術(shù)是根據(jù)樣品特征，設(shè)計(jì)一系列合適的培養(yǎng)基從樣品中分離得到微生物菌種的研究方法，包括微生物菌種的分離、純化、鑒定等多種方法，是研究微生物菌種最為常用的分析方法。

本研究結(jié)合微生物的非培養(yǎng)技術(shù)和可培養(yǎng)技術(shù)，比較分析了正常醋樣和污染醋樣的微生物結(jié)構(gòu)和種類，通過回接試驗(yàn)確定了耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）就是引起食醋變質(zhì)的污染菌。Entan［12］在1986年首次從食醋發(fā)酵液中分離得到了耐酸乳桿菌。該菌革蘭氏染色呈陽性，兼性厭氧，最適生長為37℃，這也是食醋生產(chǎn)企業(yè)夏季易發(fā)生微生物污染的原因。耐酸乳桿菌能夠代謝產(chǎn)生醋酸并且適應(yīng)高酸環(huán)境，在醋酸發(fā)酵生產(chǎn)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，能夠產(chǎn)生醋酸和乳酸等風(fēng)味物質(zhì)，是主要生產(chǎn)菌之一。然而，成品醋都需要經(jīng)過高溫滅菌工藝，如果滅菌不徹底耐酸乳桿菌出現(xiàn)在成品醋中，會使正常醋樣出現(xiàn)產(chǎn)氣、淡腐、臭味顏色變淺、可溶性固形物減少，以及pH值升高等變質(zhì)現(xiàn)象，降低食醋的營養(yǎng)價值。此外，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)耐酸乳桿菌還是引起啤酒變質(zhì)的主要污染菌，該菌能夠引起啤酒失光、異味、變酸、形成渾濁和沉淀［13］。

4 結(jié)論

本研究采用PCR-DGGE技術(shù)以及純培養(yǎng)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致食醋變質(zhì)污染菌。通過分子生物學(xué)將污染菌鑒定為耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Isolation and Identification of Microorganisms from Spoilage Vinegar

ZHAI Lei SU Jiao-jiao LIU Yang CAO Yan-hua YAO Su CHENG Chi
（China Center of Industrial Culture Collection，China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015）

The structure and diversity of microbial community in normal and spoilage vinegar samples were studied by PCR-DGGE technology combined with pure culture technology. By comparative analysis and tie-back test，we found that Lactobacillus acetotolerans was the polluting strain causing vinegar spoilage. This is the first domestic reports regarding that L. acetotolerans was the cause of the vinegar spoilage and provided theoretical basis for the enterprises of vinegar production to control the microbial pollution.

PCR-DGGE；pure culture technology；Lactobacillus acetotolerans

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.031

2015-05-15

國家微生物資源平臺專項(xiàng)（NIMR2015-4），中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院科技發(fā)展基金（博士基金）項(xiàng)目（2015KJFZ-BS-04）

翟磊，男，博士，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：zhailei@china-cicc.org

程池，男，教授級高工，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：cheng100027@163.com