陳亮 王莉
(安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院,合肥 230601)
一株新的染料甲基紅降解菌株P(guān)aracoccus sp. L-4的分離、鑒定及其脫色特性研究
陳亮 王莉
(安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院,合肥 230601)
從副球菌屬首次分離到一株有較強(qiáng)甲基紅降解能力的菌株P(guān)aracoccus sp. L-4,在LB培養(yǎng)基中,16 h內(nèi)使100 mg/L培養(yǎng)液甲基紅降解掉91.74%,2 d 內(nèi)可使甲基紅降解率近達(dá)100%。該菌株降解甲基紅適宜的溫度和pH值范圍分別為25-30℃、pH6.0-7.0,Zn2+、Co2+、Cu2+、Ag+、Al3+、Fe3+、Fe2+對(duì)甲基紅的降解有明顯抑制作用。菌株L-4在好氧和缺氧條件均能較好降解甲基紅,裝液量≤100 mL時(shí)脫色率隨裝液量增加而減少,裝液量≥125 mL時(shí),12 h時(shí)降解率仍大于40%。菌株L-4在染料廢水的生物處理方面有一定的應(yīng)用價(jià)值。
甲基紅;Paracoccus sp. L-4;分離;鑒定;降解特性
偶氮染料是目前使用量最大的一類合成染料,因其成本低廉和染色性能突出等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于紡織、皮革、食品和化妝品等行業(yè)。偶氮染料具抗光、抗氧化能力,故能穩(wěn)定存在于水體,造成水體色度增加,并影響水生生物的生存[1,2]。據(jù)報(bào)道,多數(shù)偶氮染料及其代謝的中間產(chǎn)物具致癌、致畸和致突變等毒害作用[3,4]。因此,偶氮染料引起的水污染問題一直是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)。
廢水的生物處理法具有高效、安全、低能耗以及環(huán)境友好等特點(diǎn)[5,6]。迄今為止,已分離篩選出許多可使偶氮染料降解脫色的微生物,其中一些成功應(yīng)用于染料廢水的生物修復(fù)[7-9]。而有關(guān)偶氮染料甲基紅的降解脫色菌株的研究一直較少有人涉及。本研究報(bào)道一株對(duì)甲基紅有較好降解能力的菌株副球菌屬Paracoccus sp. L-4,詳細(xì)摸索菌株L-4的生理生化和降解特性,以期為該菌株應(yīng)用偶氮染料廢水的處理提供一定的理論依據(jù)。
1.1 材料
污泥取自江蘇常熟某染料化工廠排污口。
LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基:10.0 g蛋白胨,5.0 g酵母浸粉,10.0 g NaCl,1 000 mL水,pH 7.0-7.2。1/10 LB培養(yǎng)基:1.0 g蛋白胨,0.5 g酵母浸粉,1.5g NaCl,1.0 g NH4NO3,1.5 g K2HPO4·H2O,0.5 g KH2PO4,0.2 g MgSO4·7H2O,1 000 mL水,pH 7.0-7.2。無機(jī)鹽培養(yǎng)基(Mineral salt medium,MSM):1.0 g NH4NO3,1.5 g K2HPO4·H2O,0.5 g KH2PO4,0.5 g NaCl,0.2 g MgSO4·7H2O,1 000 mL水,pH 7.0-7.2。甲基紅為分析純,購(gòu)自天津市化學(xué)試劑三廠。二氯甲烷為分析純,購(gòu)自上海中試化工總公司。
1.2 方法
1.2.1 菌株的富集與分離 將5.0 g污泥置于50 mL含20 mg/L甲基紅的1/10 LB培養(yǎng)基中,30℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔1周轉(zhuǎn)接1次,甲基紅逐漸提高的濃度至100 mg/L。經(jīng)測(cè)定,連續(xù)3代能降解甲基紅達(dá)85%以上的即為穩(wěn)定富集液。將富集液梯度稀釋后涂布于含100 mg/L甲基紅的LB平板。挑取有無色透明圈的單菌落接種到液體LB,采用紫外可見分光光度法檢測(cè)其甲基紅的降解脫色能力。
1.2.2 菌株的鑒定 降解菌株的形態(tài)和生理生化特性參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。菌株總DNA的提取采用高鹽法,并以此作為模板進(jìn)行16S rDNA基因的擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)上海生工生物工程有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果通過在線分析,與GenBank中的其他16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比較,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
1.2.3 菌株 L-4 對(duì)甲基紅的降解 在50 mL LB、MSM中分別添加100 mg/L甲基紅,接種0.5 mL預(yù)培養(yǎng)的L-4種子液(OD600nm=1.0),觀察L-4對(duì)甲基紅的降解。30℃、170 r/min搖床振蕩培養(yǎng),間隔時(shí)間取樣,測(cè)定培養(yǎng)液中甲基紅的殘留量。菌株的生長(zhǎng)用OD600nm表示。
1.2.4 環(huán)境條件對(duì)菌株 L-4 降解甲基紅的影響在50 mL LB中添加100 mg/L甲基紅,接種L-4后,分別在不同條件下170 r/min振蕩培養(yǎng)后測(cè)定甲基紅的降解脫色情況,觀察溫度、初始pH值、通氣量和金屬離子對(duì)菌株L-4甲基紅脫色的影響。12 h后取樣,測(cè)定培養(yǎng)液中甲基紅的殘留量。所有處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
1.2.5 染料濃度對(duì)菌株 L-4 降解甲基紅的影響 在50 mL LB中添加甲基紅至終濃度分別為50、100、150、200、250、300、350和400 mg/L,30℃、170 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)。接種菌株2 d后,測(cè)定培養(yǎng)液中甲基紅的殘留量。所有處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
1.2.6 甲基紅含量的測(cè)定 培養(yǎng)液以12 000 r/min離心5 min,收集上清液。加入3倍體積的二氯甲烷,劇烈振蕩5 min,靜置10 min分層。用尖嘴吸管吸取下層有機(jī)相,加入少量無水硫酸鈉。取1.0 mL置1.5 mL離心管,室溫氮?dú)獯蹈?。加? mL二氯甲烷溶解,于島津 UV-1800 紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)培養(yǎng)液中的甲紅紅殘留量。甲基紅檢測(cè)波長(zhǎng)分別為420 nm。
2.1 降解菌株L-4的分離和鑒定
采用富集培養(yǎng)的方式,從長(zhǎng)期受染料污染的污泥中分離到一株能夠較好對(duì)甲基紅降解脫色的細(xì)菌菌株,命名為L(zhǎng)-4。該菌株在含有100 mg/L甲基紅的50 mL 1/10 LB中,2 d對(duì)甲基紅的降解率近達(dá)100%。
菌株L-4在LB平板上生長(zhǎng)2 d后,菌落呈乳白色、圓形、光滑、黏稠。菌株L-4為革蘭氏陰性菌,不運(yùn)動(dòng),不能形成芽孢,呈短桿狀(0.8-0.9 μm×0.9-1.1 μm)。菌株L-4氧化酶、過氧化氫酶、α-葡糖苷酶、硝酸鹽還原反應(yīng)陽性,α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶和脲酶陰性。能利用L-阿拉伯糖、L-巖藻糖、D-葡萄糖、D-甘露糖醇、D-核糖和D-蔗糖作為唯一碳源生長(zhǎng)。菌株L-4能耐4%的NaCl。
提取降解菌基因組DNA,用16S rDNA 通用引物對(duì)降解菌的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增,得到長(zhǎng)度約為1 329 bp的片段。將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得登錄號(hào)。根據(jù)L-4與相關(guān)屬種16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(圖 1),比較發(fā)現(xiàn),菌株L-4與Paracoccus limosus同源性達(dá)97.8%,與該屬Paracoccus denitrificans、Paracoccus marinus和 Paracoccus aminophilus也分別有 97.7%、97.7% 和97.4% 的相似性。因此,結(jié)合菌株形態(tài)和生理生化特征,將L-4歸屬到副球菌屬(Paracoccus sp.)。
圖1 降解菌株 L-4 的系統(tǒng)發(fā)育樹
2.2 菌株L-4對(duì)甲基紅的降解脫色
由圖2可知,菌株L-4不能以甲基紅為唯一的碳源生長(zhǎng)和降解甲基紅,36 h時(shí)MSM培養(yǎng)基中L-4的OD600nm值未見明顯增加,甲基紅質(zhì)量濃度也未見明顯減少。但在LB培養(yǎng)基中,L-4 表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解能力,16 h時(shí)培養(yǎng)液甲基紅質(zhì)量濃度已從97.11 mg/L下降至8.02 mg/L,降解率達(dá)91.74%,相應(yīng)菌液的OD600nm值也從0.02上升至1.24。
圖2 L-4以甲基紅為碳源的生長(zhǎng)和降解
2.3 溫度對(duì)菌株L-4降解甲基紅的影響
菌株L-4在不同溫度降解甲基紅結(jié)果(圖3)顯示,當(dāng)溫度為25、30℃時(shí),菌株對(duì)甲基紅有較好的脫色能力,12 h時(shí)培養(yǎng)液甲基紅的降解率分別為65.84%、78.89%,30℃為最適溫度。在20℃及以下和35℃及以上,脫色效果較差,脫色率小于37%。
圖3 溫度對(duì)L-4降解甲基紅的影響
2.4 初始pH值對(duì)菌株L-4降解甲基紅的影響
菌株L-4在不同pH下降解甲基紅結(jié)果(圖4)顯示,該菌在過酸(pH4-5)或過堿(pH8-9)條件下都不能很好地降解甲基紅,12 h時(shí)甲基紅降解脫色率小于21%。菌株L-4降解甲基紅適宜pH值范圍為6.0-7.0,12 h時(shí)甲基紅降解率超過80%,pH6.0的降解效果最佳,脫色率達(dá)88.08%。
圖4 pH值對(duì)L-4降解甲基紅的影響
2.5 通氣量對(duì)菌株L-4降解甲基紅的影響
本實(shí)驗(yàn)以不同的裝液量來反映通氣量對(duì)菌株L-4降解甲基紅的影響,結(jié)果如圖5所示。當(dāng)裝液量≤125 mL時(shí),脫色率隨著裝液量的增加而減少,且裝液量對(duì)L-4降解甲基紅影響較大;裝液量為25 mL時(shí),降解率達(dá)到88.2%,而在125 mL處僅達(dá)到47.14%。但裝液量繼續(xù)增大時(shí),培養(yǎng)液甲基紅殘留量未見明顯增加,12 h時(shí)幾組的甲基紅降解率仍大于40%。
圖5 通氣量對(duì)L-4降解甲基紅的影響
2.6 金屬離子對(duì)菌株L-4降解甲基紅的影響
菌株L-4在不同pH下降解甲基紅的結(jié)果如圖6所示。本實(shí)驗(yàn)觀察Zn2+、Co2+、Cu2+、Ag+、Al3+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Ca2+和Mn2+幾種離子對(duì)菌株L-4降解脫色效果的影響,金屬離子濃度為1 mmol/L。結(jié)果表明,Zn2+、Co2+、Cu2+、Ag+、Al3+、Fe3+、Fe2+7種金屬離子對(duì)甲基紅的降解有較強(qiáng)地抑制作用,幾種金屬離子下的甲基紅降解率小于40%。而Mg2+、Ca2+和Mn2+對(duì)甲基紅的降解無明顯抑制作用,脫色率分別為78.92%、79.46%和78.79%。
圖6 金屬離子對(duì)L-4降解甲基紅的影響
2.7 初始濃度對(duì)菌株L-4降解甲基紅的影響
不同初始濃度對(duì)菌株L-4降解甲基紅的影響如圖7所示。菌株L-4對(duì)甲基紅的脫色率隨甲基紅的初始濃度的升高而降低。當(dāng)初始質(zhì)量濃度≤200 mg/L,24 h時(shí),甲基紅脫色率達(dá)到90%以上,50 mg/L時(shí)脫色率最高,達(dá)到98.53%,300 mg/L時(shí),脫色率仍能達(dá)到43.35%。與其他偶氮染料降解微生物相比[11-13],菌株L-4對(duì)于高質(zhì)量濃度甲基紅,具有良好的脫色能力。但當(dāng)濃度為400 mg/L時(shí),脫色效果不佳,脫色率僅為12.51%,說明此時(shí)染料質(zhì)量濃度可能已經(jīng)超過了該菌株的耐受能力,降解酶活性受到了較強(qiáng)的抑制作用。
隨著印染、紡織等行業(yè)的迅速發(fā)展,染料廢水逐年增加,其中偶氮染料廢水產(chǎn)量最大。生物法被認(rèn)為是目前最有前途的一種廢水處理法[5,6],而生物處理法的關(guān)鍵是高效的降解微生物的篩選。到目前為止有大量的偶氮染料脫色微生物從各種環(huán)境中被分離出來,而甲基紅降解脫色菌株卻較少見到報(bào)道[14-16]。本實(shí)驗(yàn)在長(zhǎng)期受染料污染的污泥中分離獲得一株高效降解甲基紅的菌株L-4,該菌株能在16 h內(nèi)使培養(yǎng)液100 mg/L甲基紅降解率達(dá)91.74%,2 d內(nèi)可使甲基紅的降解率近達(dá)100%。
圖7 甲基紅初始質(zhì)量濃度對(duì)L-4降解甲基紅的影響
根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化特性實(shí)驗(yàn),將菌株L-4初步歸屬到副球菌屬(Paracoccus sp.),這是首次從副球菌屬分離到有甲基紅降解能力的菌株,因此該菌株的分離豐富了甲基紅降解的菌種資源。已報(bào)道的偶氮脫色細(xì)菌有好氧菌也有厭氧菌,但即便是好氧菌,脫色仍需厭氧環(huán)境[17,18]。本實(shí)驗(yàn)中,菌株L-4的生長(zhǎng)和對(duì)甲基紅的降解脫色都是在好氧條件下,這可能是因?yàn)榫闘-4的細(xì)胞存在好氧性的偶氮染料降解脫色酶的緣故,因此,菌株L-4的分離將有助于進(jìn)一步揭示偶氮染料的好氧脫色機(jī)制。
環(huán)境條件對(duì)菌株降解甲基紅的影響實(shí)驗(yàn)表明,該菌株降解甲基紅的適宜溫度25-30℃,適宜pH值為6.0-7.0,Zn2+、Co2+、Cu2+、Ag+、Al3+、Fe3+、Fe2+對(duì)甲基紅的降解有較強(qiáng)地抑制作用。但通氣量對(duì)菌株L-4 影響較小,缺氧條件也可較好地降解甲基紅,12 h時(shí)裝液量≥125 mL實(shí)驗(yàn)組降解率仍大于40%,提示菌株L-4在缺氧條件也可較好的對(duì)甲基紅降解脫色。
分離篩選得到一株能夠有效降解甲基紅的菌株L-4,初步鑒定該菌株為副球菌屬(Paracoccus sp.)。該菌株不能以甲基紅為唯一碳源生長(zhǎng)和降解甲基紅,在LB培養(yǎng)基中,16 h內(nèi)使100 mg/L培養(yǎng)液甲基紅降解掉91.74%,降解甲基紅的適宜溫度為25-30℃,適宜pH值為6.0-7.0,裝液量≤100 mL時(shí),脫色率能達(dá)到60%,裝液量>100 mL,也在40%以上,L-4對(duì)高質(zhì)量濃度甲基紅具有良好的脫色能力,24 h,50 mg/L時(shí),脫色率最高,達(dá)到98.53%。部分金屬離子對(duì)該菌株降解甲基紅有抑制作用,其中其中Cu2+抑制最明顯,12 h,甲基紅的降解率僅為30.07%。
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(責(zé)任編輯 李楠)
Isolation,Identification and Decolonization Characteristics of a New Methyl Red Degrading Bacterial Strain Paracoccus sp. L-4
CHEN Liang WANG Li
(College of Environment and Energy Engineering,Anhui University of Architecture,Hefei 230601)
The strain Paracoccus sp. L-4 was isolated from Paracoccus sp. at first time, and it had the strong ability to degrade methyl red. In LB medium, methyl red in the concentration of 100 mg/L was degraded 91.74% in 16 h, and approximately 100% in 2 d. Furthermore,the optimal conditions for degrading methyl red were 25-30℃ and pH6.0-7.0, respectively. And Zn2+, Co2+, Cu2+, Ag+, Al3+, Fe3+and Fe2+had an significant inhibitory effects on the degradation of methyl red. The degradation and decolorization of methyl red by strain L-4 was performed well in both aerobic and anoxic conditions. When the volume of liquid was ≤ 100 mL, the ratio of decolorization decreased with the increase of volume of liquid. However, when the amount of liquid was ≥ 125 mL, the degradation rate of methyl red was still over 40% at 12 h, indicating that strain L-4 has a potential application value in biological treatment of dye wastewater.
methyl red;Paracoccus sp. L-4;isolation;identification;degradation characteristics
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.019
2015-04-09
國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21107002)
陳亮,男,碩士研究生,研究方向:偶氮類染料的微生物降解;E-mail:1028383665@qq.com
王莉,女,副教授,研究方向:染料的微生物降解;E-mail:642012688@qq.com