陳亮 王莉

（安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院，合肥 230601）

一株新的染料甲基紅降解菌株P(guān)aracoccus sp. L-4的分離、鑒定及其脫色特性研究

陳亮 王莉

（安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院，合肥 230601）

從副球菌屬首次分離到一株有較強(qiáng)甲基紅降解能力的菌株P(guān)aracoccus sp. L-4，在LB培養(yǎng)基中，16 h內(nèi)使100 mg/L培養(yǎng)液甲基紅降解掉91.74%，2 d 內(nèi)可使甲基紅降解率近達(dá)100%。該菌株降解甲基紅適宜的溫度和pH值范圍分別為25-30℃、pH6.0-7.0，Zn2+、Co2+、Cu2+、Ag+、Al3+、Fe3+、Fe2+對(duì)甲基紅的降解有明顯抑制作用。菌株L-4在好氧和缺氧條件均能較好降解甲基紅，裝液量≤100 mL時(shí)脫色率隨裝液量增加而減少，裝液量≥125 mL時(shí)，12 h時(shí)降解率仍大于40%。菌株L-4在染料廢水的生物處理方面有一定的應(yīng)用價(jià)值。

甲基紅；Paracoccus sp. L-4；分離；鑒定；降解特性

偶氮染料是目前使用量最大的一類合成染料，因其成本低廉和染色性能突出等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于紡織、皮革、食品和化妝品等行業(yè)。偶氮染料具抗光、抗氧化能力，故能穩(wěn)定存在于水體，造成水體色度增加，并影響水生生物的生存［1，2］。據(jù)報(bào)道，多數(shù)偶氮染料及其代謝的中間產(chǎn)物具致癌、致畸和致突變等毒害作用［3，4］。因此，偶氮染料引起的水污染問題一直是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)。

廢水的生物處理法具有高效、安全、低能耗以及環(huán)境友好等特點(diǎn)［5，6］。迄今為止，已分離篩選出許多可使偶氮染料降解脫色的微生物，其中一些成功應(yīng)用于染料廢水的生物修復(fù)［7-9］。而有關(guān)偶氮染料甲基紅的降解脫色菌株的研究一直較少有人涉及。本研究報(bào)道一株對(duì)甲基紅有較好降解能力的菌株副球菌屬Paracoccus sp. L-4，詳細(xì)摸索菌株L-4的生理生化和降解特性，以期為該菌株應(yīng)用偶氮染料廢水的處理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

污泥取自江蘇常熟某染料化工廠排污口。

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：10.0 g蛋白胨，5.0 g酵母浸粉，10.0 g NaCl，1 000 mL水，pH 7.0-7.2。1/10 LB培養(yǎng)基：1.0 g蛋白胨，0.5 g酵母浸粉，1.5g NaCl，1.0 g NH4NO3，1.5 g K2HPO4·H2O，0.5 g KH2PO4，0.2 g MgSO4·7H2O，1 000 mL水，pH 7.0-7.2。無機(jī)鹽培養(yǎng)基（Mineral salt medium，MSM）：1.0 g NH4NO3，1.5 g K2HPO4·H2O，0.5 g KH2PO4，0.5 g NaCl，0.2 g MgSO4·7H2O，1 000 mL水，pH 7.0-7.2。甲基紅為分析純，購(gòu)自天津市化學(xué)試劑三廠。二氯甲烷為分析純，購(gòu)自上海中試化工總公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集與分離 將5.0 g污泥置于50 mL含20 mg/L甲基紅的1/10 LB培養(yǎng)基中，30℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔1周轉(zhuǎn)接1次，甲基紅逐漸提高的濃度至100 mg/L。經(jīng)測(cè)定，連續(xù)3代能降解甲基紅達(dá)85%以上的即為穩(wěn)定富集液。將富集液梯度稀釋后涂布于含100 mg/L甲基紅的LB平板。挑取有無色透明圈的單菌落接種到液體LB，采用紫外可見分光光度法檢測(cè)其甲基紅的降解脫色能力。

1.2.2 菌株的鑒定 降解菌株的形態(tài)和生理生化特性參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行。菌株總DNA的提取采用高鹽法，并以此作為模板進(jìn)行16S rDNA基因的擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過在線分析，與GenBank中的其他16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 菌株 L-4 對(duì)甲基紅的降解 在50 mL LB、MSM中分別添加100 mg/L甲基紅，接種0.5 mL預(yù)培養(yǎng)的L-4種子液（OD600nm=1.0），觀察L-4對(duì)甲基紅的降解。30℃、170 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，間隔時(shí)間取樣，測(cè)定培養(yǎng)液中甲基紅的殘留量。菌株的生長(zhǎng)用OD600nm表示。

1.2.4 環(huán)境條件對(duì)菌株 L-4 降解甲基紅的影響在50 mL LB中添加100 mg/L甲基紅，接種L-4后，分別在不同條件下170 r/min振蕩培養(yǎng)后測(cè)定甲基紅的降解脫色情況，觀察溫度、初始pH值、通氣量和金屬離子對(duì)菌株L-4甲基紅脫色的影響。12 h后取樣，測(cè)定培養(yǎng)液中甲基紅的殘留量。所有處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 染料濃度對(duì)菌株 L-4 降解甲基紅的影響 在50 mL LB中添加甲基紅至終濃度分別為50、100、150、200、250、300、350和400 mg/L，30℃、170 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)。接種菌株2 d后，測(cè)定培養(yǎng)液中甲基紅的殘留量。所有處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 甲基紅含量的測(cè)定 培養(yǎng)液以12 000 r/min離心5 min，收集上清液。加入3倍體積的二氯甲烷，劇烈振蕩5 min，靜置10 min分層。用尖嘴吸管吸取下層有機(jī)相，加入少量無水硫酸鈉。取1.0 mL置1.5 mL離心管，室溫氮?dú)獯蹈?。加? mL二氯甲烷溶解，于島津 UV-1800 紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)培養(yǎng)液中的甲紅紅殘留量。甲基紅檢測(cè)波長(zhǎng)分別為420 nm。

2 結(jié)果

2.1 降解菌株L-4的分離和鑒定

采用富集培養(yǎng)的方式，從長(zhǎng)期受染料污染的污泥中分離到一株能夠較好對(duì)甲基紅降解脫色的細(xì)菌菌株，命名為L(zhǎng)-4。該菌株在含有100 mg/L甲基紅的50 mL 1/10 LB中，2 d對(duì)甲基紅的降解率近達(dá)100%。

菌株L-4在LB平板上生長(zhǎng)2 d后，菌落呈乳白色、圓形、光滑、黏稠。菌株L-4為革蘭氏陰性菌，不運(yùn)動(dòng)，不能形成芽孢，呈短桿狀（0.8-0.9 μm×0.9-1.1 μm）。菌株L-4氧化酶、過氧化氫酶、α-葡糖苷酶、硝酸鹽還原反應(yīng)陽性，α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶和脲酶陰性。能利用L-阿拉伯糖、L-巖藻糖、D-葡萄糖、D-甘露糖醇、D-核糖和D-蔗糖作為唯一碳源生長(zhǎng)。菌株L-4能耐4%的NaCl。

提取降解菌基因組DNA，用16S rDNA 通用引物對(duì)降解菌的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為1 329 bp的片段。將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得登錄號(hào)。根據(jù)L-4與相關(guān)屬種16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹（圖 1），比較發(fā)現(xiàn)，菌株L-4與Paracoccus limosus同源性達(dá)97.8%，與該屬Paracoccus denitrificans、Paracoccus marinus和 Paracoccus aminophilus也分別有 97.7%、97.7% 和97.4% 的相似性。因此，結(jié)合菌株形態(tài)和生理生化特征，將L-4歸屬到副球菌屬（Paracoccus sp.）。

圖1 降解菌株 L-4 的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株L-4對(duì)甲基紅的降解脫色

由圖2可知，菌株L-4不能以甲基紅為唯一的碳源生長(zhǎng)和降解甲基紅，36 h時(shí)MSM培養(yǎng)基中L-4的OD600nm值未見明顯增加，甲基紅質(zhì)量濃度也未見明顯減少。但在LB培養(yǎng)基中，L-4 表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解能力，16 h時(shí)培養(yǎng)液甲基紅質(zhì)量濃度已從97.11 mg/L下降至8.02 mg/L，降解率達(dá)91.74%，相應(yīng)菌液的OD600nm值也從0.02上升至1.24。

圖2 L-4以甲基紅為碳源的生長(zhǎng)和降解

2.3 溫度對(duì)菌株L-4降解甲基紅的影響

菌株L-4在不同溫度降解甲基紅結(jié)果（圖3）顯示，當(dāng)溫度為25、30℃時(shí)，菌株對(duì)甲基紅有較好的脫色能力，12 h時(shí)培養(yǎng)液甲基紅的降解率分別為65.84%、78.89%，30℃為最適溫度。在20℃及以下和35℃及以上，脫色效果較差，脫色率小于37%。

圖3 溫度對(duì)L-4降解甲基紅的影響

2.4 初始pH值對(duì)菌株L-4降解甲基紅的影響

菌株L-4在不同pH下降解甲基紅結(jié)果（圖4）顯示，該菌在過酸（pH4-5）或過堿（pH8-9）條件下都不能很好地降解甲基紅，12 h時(shí)甲基紅降解脫色率小于21%。菌株L-4降解甲基紅適宜pH值范圍為6.0-7.0，12 h時(shí)甲基紅降解率超過80%，pH6.0的降解效果最佳，脫色率達(dá)88.08%。

圖4 pH值對(duì)L-4降解甲基紅的影響

2.5 通氣量對(duì)菌株L-4降解甲基紅的影響

本實(shí)驗(yàn)以不同的裝液量來反映通氣量對(duì)菌株L-4降解甲基紅的影響，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)裝液量≤125 mL時(shí)，脫色率隨著裝液量的增加而減少，且裝液量對(duì)L-4降解甲基紅影響較大；裝液量為25 mL時(shí)，降解率達(dá)到88.2%，而在125 mL處僅達(dá)到47.14%。但裝液量繼續(xù)增大時(shí)，培養(yǎng)液甲基紅殘留量未見明顯增加，12 h時(shí)幾組的甲基紅降解率仍大于40%。

圖5 通氣量對(duì)L-4降解甲基紅的影響

2.6 金屬離子對(duì)菌株L-4降解甲基紅的影響

菌株L-4在不同pH下降解甲基紅的結(jié)果如圖6所示。本實(shí)驗(yàn)觀察Zn2+、Co2+、Cu2+、Ag+、Al3+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Ca2+和Mn2+幾種離子對(duì)菌株L-4降解脫色效果的影響，金屬離子濃度為1 mmol/L。結(jié)果表明，Zn2+、Co2+、Cu2+、Ag+、Al3+、Fe3+、Fe2+7種金屬離子對(duì)甲基紅的降解有較強(qiáng)地抑制作用，幾種金屬離子下的甲基紅降解率小于40%。而Mg2+、Ca2+和Mn2+對(duì)甲基紅的降解無明顯抑制作用，脫色率分別為78.92%、79.46%和78.79%。

圖6 金屬離子對(duì)L-4降解甲基紅的影響

2.7 初始濃度對(duì)菌株L-4降解甲基紅的影響

不同初始濃度對(duì)菌株L-4降解甲基紅的影響如圖7所示。菌株L-4對(duì)甲基紅的脫色率隨甲基紅的初始濃度的升高而降低。當(dāng)初始質(zhì)量濃度≤200 mg/L，24 h時(shí)，甲基紅脫色率達(dá)到90%以上，50 mg/L時(shí)脫色率最高，達(dá)到98.53%，300 mg/L時(shí)，脫色率仍能達(dá)到43.35%。與其他偶氮染料降解微生物相比［11-13］，菌株L-4對(duì)于高質(zhì)量濃度甲基紅，具有良好的脫色能力。但當(dāng)濃度為400 mg/L時(shí)，脫色效果不佳，脫色率僅為12.51%，說明此時(shí)染料質(zhì)量濃度可能已經(jīng)超過了該菌株的耐受能力，降解酶活性受到了較強(qiáng)的抑制作用。

3 討論

隨著印染、紡織等行業(yè)的迅速發(fā)展，染料廢水逐年增加，其中偶氮染料廢水產(chǎn)量最大。生物法被認(rèn)為是目前最有前途的一種廢水處理法［5，6］，而生物處理法的關(guān)鍵是高效的降解微生物的篩選。到目前為止有大量的偶氮染料脫色微生物從各種環(huán)境中被分離出來，而甲基紅降解脫色菌株卻較少見到報(bào)道［14-16］。本實(shí)驗(yàn)在長(zhǎng)期受染料污染的污泥中分離獲得一株高效降解甲基紅的菌株L-4，該菌株能在16 h內(nèi)使培養(yǎng)液100 mg/L甲基紅降解率達(dá)91.74%，2 d內(nèi)可使甲基紅的降解率近達(dá)100%。

圖7 甲基紅初始質(zhì)量濃度對(duì)L-4降解甲基紅的影響

根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化特性實(shí)驗(yàn)，將菌株L-4初步歸屬到副球菌屬（Paracoccus sp.），這是首次從副球菌屬分離到有甲基紅降解能力的菌株，因此該菌株的分離豐富了甲基紅降解的菌種資源。已報(bào)道的偶氮脫色細(xì)菌有好氧菌也有厭氧菌，但即便是好氧菌，脫色仍需厭氧環(huán)境［17，18］。本實(shí)驗(yàn)中，菌株L-4的生長(zhǎng)和對(duì)甲基紅的降解脫色都是在好氧條件下，這可能是因?yàn)榫闘-4的細(xì)胞存在好氧性的偶氮染料降解脫色酶的緣故，因此，菌株L-4的分離將有助于進(jìn)一步揭示偶氮染料的好氧脫色機(jī)制。

環(huán)境條件對(duì)菌株降解甲基紅的影響實(shí)驗(yàn)表明，該菌株降解甲基紅的適宜溫度25-30℃，適宜pH值為6.0-7.0，Zn2+、Co2+、Cu2+、Ag+、Al3+、Fe3+、Fe2+對(duì)甲基紅的降解有較強(qiáng)地抑制作用。但通氣量對(duì)菌株L-4 影響較小，缺氧條件也可較好地降解甲基紅，12 h時(shí)裝液量≥125 mL實(shí)驗(yàn)組降解率仍大于40%，提示菌株L-4在缺氧條件也可較好的對(duì)甲基紅降解脫色。

4 結(jié)論

分離篩選得到一株能夠有效降解甲基紅的菌株L-4，初步鑒定該菌株為副球菌屬（Paracoccus sp.）。該菌株不能以甲基紅為唯一碳源生長(zhǎng)和降解甲基紅，在LB培養(yǎng)基中，16 h內(nèi)使100 mg/L培養(yǎng)液甲基紅降解掉91.74%，降解甲基紅的適宜溫度為25-30℃，適宜pH值為6.0-7.0，裝液量≤100 mL時(shí)，脫色率能達(dá)到60%，裝液量＞100 mL，也在40%以上，L-4對(duì)高質(zhì)量濃度甲基紅具有良好的脫色能力，24 h，50 mg/L時(shí)，脫色率最高，達(dá)到98.53%。部分金屬離子對(duì)該菌株降解甲基紅有抑制作用，其中其中Cu2+抑制最明顯，12 h，甲基紅的降解率僅為30.07%。

［1］Chen G， Hang M， Chen L， et al. A batch decolorization and kinetic study of Reactive Black 5 by a bacterial strain Enterobacter sp. GY-1［J］. International Biodeterioration & Biodegradation， 2011， 65（6）：790-796.

［2］Patel Y， Mehta C， Gupte A. Assessment of biological decolorization and degradation of sulfonated di-azo dye Acid Maroon V by isolated bacterial consortium EDPA［J］. International Biodeterioration & Biodegradation， 2012， 75：187-193

［3］Azeem K， Muhammad A， Crowley DE. Accelerated decolorization of structurally different azo dyes by newly isolated bacterial strains［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2008， 78（2）：361-369

［4］Cui D， Li G， Zhao M， et al. Decolourization of azo dyes by a newly isolated Klebsiella sp. strain Y3， and effects of various factors on biodegradation［J］. Biotechnology & Biotechnological Equipment，2014， 28（3）：478-486

［5］許玫英， 郭俊， 岑英華， 等. 染料的生物降解研究［J］. 微生物學(xué)通報(bào)， 2006， 33（1）：138-143.

［6］廖歡， 嚴(yán)濱， 黃國(guó)和， 等. 一株酸性大紅3R脫色菌的分離鑒定及其脫色性能研究［J］. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 33（3）：691-699.

［7］武春媛， 李勤奮， 周順桂， 等. 一株嗜水氣單胞菌HS01的偶氮還原脫色特性［J］. 微生物學(xué)通報(bào)， 2013， 40（6）：959-967.

［8］陳曄， 陳剛， 陳亮， 等. 菌株Enterobactor sp. S8對(duì)不同結(jié)構(gòu)偶氮染料脫色性能的影響［J］. 環(huán)境化學(xué)， 2011， 30（4）：838-842.

［9］王慧， 周月霞， 柏仕杰， 等. 染料廢水生物法處理技術(shù)的研究進(jìn)展［J］. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2008， 47（S2）：286-290.

［10］東秀珠， 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］. 北京：科學(xué)出版社， 2001.

［11］劉生浩， 史玉英， 婁無忌， 邵勁松. 偶氮染料降解菌L-6和L-D的分離及其降解特性的研究［J］. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1996，19（2）：45-49.

［12］ 楊東虎， 闞振榮. 偶氮染料直接大紅GBE脫色細(xì)菌的篩選及研究［J］. 環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備， 2002， 3（12）：51-53.

［13］ 阮曉東， 張惠文， 王振宇， 等. 紅酵母YR-1對(duì)偶氮染料酸性紅B的脫色研究［J］. 水處理技術(shù)， 2009， 35（12）：38-43.

［14］ 盧婧， 余志晟， 張洪勛. 微生物降解偶氮染料的研究進(jìn)展［J］.工業(yè)水處理， 2013， 33（1）：15-19.

［15］Zhao M， Sun PF， Du LN， et al. Biodegradation of methyl red by Bacillus sp. strain UN2：decolorization capacity， metabolites characterization， and enzyme analysis［J］. Environmental Science and Pollution Research， 2014， 21（9）：6136-6145.

［16］ Jadhav SU， Kalme SD， Govindwar SP. Biodegradation of Methyl red by Galactomyces geotrichum MTCC 1360［J］. International Biodeterioration & Biodegradation， 2008， 62（2）：135-142.

［17］ 鄭力文， 李彥春， 吳渝玉， 等. 皮革染料的生物降解研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)皮革， 2012， 41（11）：54-58.

［18］ 楊清香， 賈振杰， 楊敏. 微生物染料脫色研究進(jìn)展［J］. 微生物學(xué)通報(bào)， 2006， 33（4）：144-148.

（責(zé)任編輯 李楠）

Isolation，Identification and Decolonization Characteristics of a New Methyl Red Degrading Bacterial Strain Paracoccus sp. L-4

CHEN Liang WANG Li
（College of Environment and Energy Engineering，Anhui University of Architecture，Hefei 230601）

The strain Paracoccus sp. L-4 was isolated from Paracoccus sp. at first time， and it had the strong ability to degrade methyl red. In LB medium， methyl red in the concentration of 100 mg/L was degraded 91.74% in 16 h， and approximately 100% in 2 d. Furthermore，the optimal conditions for degrading methyl red were 25-30℃ and pH6.0-7.0， respectively. And Zn2+， Co2+， Cu2+， Ag+， Al3+， Fe3+and Fe2+had an significant inhibitory effects on the degradation of methyl red. The degradation and decolorization of methyl red by strain L-4 was performed well in both aerobic and anoxic conditions. When the volume of liquid was ≤ 100 mL， the ratio of decolorization decreased with the increase of volume of liquid. However， when the amount of liquid was ≥ 125 mL， the degradation rate of methyl red was still over 40% at 12 h， indicating that strain L-4 has a potential application value in biological treatment of dye wastewater.

methyl red；Paracoccus sp. L-4；isolation；identification；degradation characteristics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.019

2015-04-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21107002）

陳亮，男，碩士研究生，研究方向：偶氮類染料的微生物降解；E-mail：1028383665@qq.com

王莉，女，副教授，研究方向：染料的微生物降解；E-mail：642012688@qq.com