張文美丁妍郭興榮李東升趙萬紅王小莉

（1.湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院 胚胎干細胞研究湖北省重點實驗室，十堰 442000；2. 湖北醫(yī)藥學院生物醫(yī)學工程學院，十堰 442000）

TALEN介導的CXCR4敲除肝癌細胞株的建立

張文美1，2丁妍1郭興榮1李東升1趙萬紅2王小莉1

（1.湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院 胚胎干細胞研究湖北省重點實驗室，十堰 442000；2. 湖北醫(yī)藥學院生物醫(yī)學工程學院，十堰 442000）

通過TALEN打靶建立CXCR4的細胞株，旨在研究CXCR4對肝癌的影響。選用肝癌細胞株HepG2，采用轉(zhuǎn)錄激活樣效應物核酸酶（TALEN）干擾細胞中CXCR4的表達。構(gòu)建的CXCR4 TALEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HepG2細胞，通過T7E1酶切確定打靶效率為40%，并通過測序篩選出了CXCR4敲除的單克隆細胞，免疫熒光和Western blot進一步證實CXCR4基因表達顯著下調(diào)。

TALEN；CXCR4；肝癌；基因打靶

趨化因子受體4（Chemokine receptor 4，CXCR4）屬于高度保守的7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR），主要參與信號轉(zhuǎn)導［1］。趨化因子可影響腫瘤的生長、誘導血管生成、使腫瘤逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2］。研究表明，CXCR4與肝癌細胞生長、遷移和侵襲密切相關(guān)［3］。轉(zhuǎn)錄激活樣效應物核酸酶（TALEN）可對細胞的基因組進行改造影響蛋白的表達，目前運用此技術(shù)介導的靶位點的基因敲除已經(jīng)成為一種新型基因打靶工具［4］。此技術(shù)操作簡單、對細胞使用要求不高，適用于大多數(shù)物種及各種體外培養(yǎng)細胞的基因改造［5］。本研究將應用TALEN 技術(shù)建立CXCR4基因敲除的HepG2細胞系，以期研究CXCR4對肝癌的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

TALEN試劑盒（斯丹塞生物技術(shù)有限公司）；DMEM，Opti-MEM（Gibco）；胎牛血清（四季青）；T7E1酶（NEB公司）；CXCR4抗體（Abcam）；DAPI，堿性磷酸酶標記的鼠抗兔二抗（碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞系HepG2在含10%胎牛血清，100 U/mL的青霉素、鏈霉素的高糖細胞培養(yǎng)基DMEM中37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，保持細胞生長狀態(tài)良好，每次實驗使用處于對數(shù)生長期的細胞。

1.2.2 TALEN質(zhì)粒的構(gòu)建及打靶 根據(jù)CXCR4基因序列設(shè)計打靶位點，TALEN試劑盒說明書構(gòu)建CXCR4 TALEN質(zhì)粒。將10 μg CXCR4 TALEN質(zhì)粒（左右臂質(zhì)粒各5 μg）與90 μL含1×106HepG2細胞的Opti-MEM混合，150 V電擊5 s后將細胞轉(zhuǎn)移至六孔板中37℃培養(yǎng)，并以3 μg/mL嘌呤霉素篩選3 d，按同樣的方法進行二次打靶。

1.2.3 T7E1酶切 根據(jù)CXCR4缺失型兩端的序列設(shè)計PCR引物，CXCR4上游引：5'-GCCCTTAGCCCACTACTTC-3'，下游引物：5'-GCGGTCCAGACTGATGAA-3'。PCR反應條件為：95℃ 5 min；95℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)，72℃延長10 min。PCR產(chǎn)物37℃ T7E1酶切30 min后瓊脂糖凝膠電泳。檢測打靶效率時打靶細胞基因組PCR產(chǎn)物直接T7E1酶切，挑選陽性克隆時野生型與打靶細胞PCR產(chǎn)物經(jīng)變性退火后再進行T7E1酶切。

1.2.4 挑細胞單克隆測序 在96孔板內(nèi)加入200 μL含10% FBS的DMEM，在顯微鏡下用移液槍吸取單個細胞接種在96孔板內(nèi)。每孔接種1個細胞，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察克隆生長情況并標記單細胞的孔。細胞長滿后傳入24孔板繼續(xù)培養(yǎng)，提取基因組PCR擴增T7E1酶切鑒定，陽性克隆目的片段PCR產(chǎn)物連入T載體并測序。

1.2.5 細胞免疫熒光 細胞經(jīng)固定液固定30 min后，PBS洗3遍加入1%牛血清白蛋白封閉1 h，再加入按1∶100稀釋的兔抗人CXCR4，混勻后37℃ 孵育1 h，孵育結(jié)束后PBS洗3次，加入按1∶100稀釋的Cyc3標記的山羊抗兔IgG，混勻后37℃孵育1 h，PBS洗3次，用5 μg/mL DAPI染色2 min，加入抗淬滅封片劑封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 Western blot 細胞提取總蛋白，SDS-PAGE蛋白電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。后用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，37℃孵育兔抗人CXCR4一抗1 h。用TBST洗3次后，加入堿性磷酸酶標記的鼠抗兔二抗孵育1 h，TBST洗3次后用AP底物顯色。通過凝膠成像系統(tǒng)成像（Bio-Rad）照像。

1.2.7 統(tǒng)計學分析 實驗計量數(shù)據(jù)以x-±s表示，兩組間差異采用t檢驗，多組間均數(shù)差異采用單因素方差分析，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TALEN載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI中CXCR4的基因序列和TALEN試劑盒設(shè)計要求，設(shè)計TALEN打靶左右臂的序列如圖1所示。按試劑盒的說明經(jīng)測序證明，成功構(gòu)建了CXCR4打靶的TALEN質(zhì)粒。

圖1 CXCR4基因TALENs打靶位點示意圖

2.2 T7E1酶切確定打靶效率

TALEN打靶后的細胞和野生型的細胞提取基因組，經(jīng)PCR擴增電泳檢測，結(jié)果（圖2-A）顯示，理論PCR產(chǎn)物大小為526 bp，電泳結(jié)果與理論相符。打靶細胞提取基因組的PCR產(chǎn)物經(jīng)T7E1酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖2-B）顯示，理論打靶酶切后得到的產(chǎn)物大小為150 bp和370 bp左右的兩條帶，電泳結(jié)果與理論相符，并經(jīng)灰度分析打靶效率約為40%。結(jié)果表明構(gòu)建的打靶CXCR4的TALEN質(zhì)?？沙晒Υ虬蠧XCR4基因。

2.3 測序篩選CXCR4基因敲除克隆

單克隆細胞提取基因組后PCR的產(chǎn)物與野生型PCR產(chǎn)物混合變性退火，T7E1酶切。經(jīng)鑒定為陽性的克隆PCR產(chǎn)物連入T載體，每個單克隆細胞挑取10個進行測序。測序結(jié)果（圖3-A）顯示，與野生型CXCR4基因序列通過NCBI Blast比對，不同克隆堿基缺失和插入情況均不相同。一共挑取了24個單克隆，通過分析發(fā)現(xiàn)21號單克隆有3條鏈突變，如圖3-B所示。

圖2 T7E1酶切檢測打靶效率

圖3 打靶單克隆細胞提基因組測序結(jié)果

2.4 CXCR4敲除細胞株的鑒定

免疫熒光檢測細胞中CXCR4基因的表達，結(jié)果（圖4-A）顯示，CXCR4敲除的細胞株熒光強度明顯比野生型弱。Western blot檢測的結(jié)果（圖4-B）顯示，敲除細胞CXCR4蛋白表達量與野生型相比有顯著差異（P＜0.01）。

圖4 CXCR4敲除細胞株中CXCR4蛋白的表達情況

3 討論

肝癌是最常見的原發(fā)性肝臟腫瘤，也是全球最常見的惡性腫瘤之一［6］。肝癌的早期癥狀通常不明顯，許多患者在晚期才被確診，因此治療效果不理想。為了尋找有效的治療途徑闡明肝癌發(fā)展的機制和識別早期疾病生物標志物是非常必要的。趨化因子CXCR4在正常組織中表達基本一致，但在許多實體腫瘤中表達異常［7，8］。對CXCR4基因的異常表達可以作為部分疾病預后指標，如結(jié)直腸癌［9，10］、神經(jīng)膠質(zhì)瘤［11］、乳腺癌［12，13］、胃癌［14］、肺癌［15］以及白血?。?6］等。研究證明，CXCR4與其受體參與肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，但其具體的作用機制仍不太清楚［17］。目前已有報道采用干擾RNA使CXCR4基因沉默來研究其對腫瘤增殖，遷移等方面的影響［18］。然而，干擾RNA只能短時間內(nèi)使基因沉默，限制了其對腫瘤的長期發(fā)生發(fā)展方面的研究。TALEN基因打靶技術(shù)可快速敲除基因，并建立穩(wěn)定的基因敲除細胞系，有利于深入研究基因的功能。目前，很少有報道研究TALEN介導的CXCR4基因敲除對肝癌細胞的影響。為了進一步深入研究CXCR4對肝癌細胞的影響，本研究利用TALEN打靶CXCR4，通過挑取單克隆測序最終成功獲得了穩(wěn)定下調(diào)CXCR4基因表達的細胞株，并通過免疫熒光和Western blot 進一步證實了敲除后CXCR4蛋白表達顯著低于野生型，為進一步研究CXCR4對肝癌增殖、集落形成和遷移等方面的影響奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用TALEN打靶技術(shù)成功建立了穩(wěn)定下調(diào)CXCR4基因表達的HepG2細胞株。

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（責任編輯 馬鑫）

The Establishment of HepG2 Cell Line with TALEN-mediated Knockout of CXCR4

ZHANG Wen-mei1，2DING Yan1GUO Xing-rong1LI Dong-sheng1ZHAO Wan-hong2WANG Xiao-li1
（1. Hubei Key Laboratory of Embryonic Stem Cell Research，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000；2. College of Biomedical Engineering，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000）

It was to research on the effect of CXCR4 on HepG2 cells， we established one cell line which could down-regulate CXCR4 expression stably by transcription activaor-like effector nuclease （TALEN） gene targeting. The hepatocellular carcinoma cell line HepG2 was chosen for this study， and the expression of CXCR4 was interfered by transcription activator-like effector nuclease （TALEN）. The constructed CXCR4 TALEN plasmids were transfected into HepG2 cells， and the targeting efficiency was determined as 40% by enzyme digestion of T7E1. The single clone cell of CXCR4 knockout was screened by gene sequencing， and the significant decrease of gene CXCR4 expression was confirmed by immunofluorescence and Western blot. The hepatocellular carcinoma cell line with stably down-regulating CXCR4 expression was established successfully by TALEN gene targeting.

TALEN；CXCR4；hepatocellular carcinoma cell；gene target

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.031

2015-05-12

湖北醫(yī)藥學院自然科學研究啟動金（2011QDZR-26），國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201410929004）

張文美，女，研究方向：腫瘤的基因治療；E-mail：1436271046@qq.com

王小莉，女，碩士，研究方向：腫瘤的基因治療；E-mail：xiaolitina@126.com