胡　昱，陳　飚，闞　劼，張青巖，黃通旺*

（1.汕頭市金山中學(xué)，廣東汕頭　515063；　2.汕頭大學(xué)生物系，廣東汕頭　515063）

來源于電子垃圾污染地區(qū)的重金屬抗性菌株研究

胡昱1,a，陳飚2,a，闞劼2，張青巖1，黃通旺2*

（1.汕頭市金山中學(xué)，廣東汕頭515063；2.汕頭大學(xué)生物系，廣東汕頭515063）

通過對電子垃圾污染環(huán)境來源的樣品利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行微生物培養(yǎng)與純化，分離、篩選出12株對重金屬銅（Cu2+）具有較高抗性的菌株；其中，菌株HZB同時對鉻（Cr2+）和鎘（Cd2+）也具有較高的抗性.通過對菌株HZB的生理生化特性及16S rDNA序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明菌株HZB屬于蠟狀芽孢桿菌，它在中性環(huán)境中生長良好.利用重金屬最低抑制濃度的檢測，發(fā)現(xiàn)菌株HZB能單抗4.2 mmol/L的Cr2+、2.5 mmol/L的Cu2+和0.7 mmol/ L的Cd2+.在Cu2+的環(huán)境中，菌株HZB對Cu2+具有明顯的吸附作用；并且在應(yīng)激和適應(yīng)的狀態(tài)下，菌株HZB顯示出相似的吸附曲線.曲線擬合結(jié)果表明，在適應(yīng)的狀態(tài)下，HZB菌體對Cu2+的吸附更符合Langmuir吸附理論.

重金屬；抗性菌株；銅離子；電子垃圾

當(dāng)今世界環(huán)境問題日益突出，被淘汰及廢棄的電器、電子產(chǎn)品所形成的電子垃圾造成的環(huán)境污染問題也越來越引起人們的重視.據(jù)統(tǒng)計，全世界每年約有4 000萬噸廢舊電子產(chǎn)品被丟棄，其中約70%在中國拆解與遺棄［1］.汕頭貴嶼、清遠(yuǎn)龍?zhí)恋入娮永鸾鈪^(qū)每年處理電子垃圾近百萬噸，主要采用手工拆解、焚燒、填埋等粗放式的處理方式［2］.電子垃圾電器元件含有砷、鉛、鉻、銅、汞等重金屬和其它多種有害物質(zhì)，很容易對土壤和水體造成嚴(yán)重污染［3］.

自然界中存在種類繁多的微生物，其中有許多對重金屬具有抗性，在含有重金屬的環(huán)境中能良好的生長，同時在形態(tài)、生理、遺傳上顯示出某些特定的生物學(xué)反應(yīng)［4］；而且微生物在修復(fù)被重金屬污染的環(huán)境方面具有獨特的作用.本課題組［5］前期研究了貴嶼受電子垃圾污染地區(qū)的土壤和沉積物樣品的重金屬污染狀況，發(fā)現(xiàn)其中Cu和Pb超標(biāo)嚴(yán)重，Zn的含量也處于較高水平；同時，利用變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析、構(gòu)建16S rRNA文庫，證實污染地區(qū)樣品中存在豐富的微生物類群，其中變形菌門和未定義的門類含量最高，分別為40%和28%.本研究進(jìn)一步從受電子垃圾污染地區(qū)的土壤中分離純化了對重金屬具有抗性的微生物菌株，并對其中的典型菌株特性以及對重金屬抗性進(jìn)行了研究，為微生物修復(fù)受重金屬污染環(huán)境積累資料.

1　材料與方法

1.1重金屬抗性菌株的分離、篩選

采集汕頭貴嶼的污染土壤和河流沉積物樣品，裝于無菌采樣瓶中，4℃儲存送回實驗室，24 h內(nèi)進(jìn)行實驗.將樣品10 g溶于含90 mL無菌蒸餾水和玻璃珠的三角瓶中，在25℃搖床于220 r/min振蕩1 h；靜置30 min后取上清，做梯度稀釋并涂布在牛肉膏瓊脂平板上，25℃溫箱避光培養(yǎng)2天.挑取平板中的單菌落，在牛肉膏瓊脂平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，挑取單菌落劃線培養(yǎng)，連續(xù)三次培養(yǎng)出單菌落，且其性狀沒有發(fā)生改變，即得到純的菌株.

為了進(jìn)行抗重金屬銅的菌株初選，設(shè)置含較高銅濃度2.0 mmol/L牛肉膏液體培養(yǎng)基對所純化得到的株進(jìn)行25℃搖床于220 r/min振蕩培養(yǎng)，觀察其生長情況，得到重金屬抗性菌株.

1.2菌株生理生化特性研究

準(zhǔn)備250 mL液體牛肉膏培養(yǎng)基，以1%接種量接種后混勻，25℃下震蕩培養(yǎng)，每1.5 h取5 mL于一支試管中在4℃冰箱里凍存，最后一起測定其OD600的值，以測定菌株的生長曲線.

設(shè)計pH梯度5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0培養(yǎng)24 h，測量其OD600的值，以測定不同pH對菌株生長的影響.

1.3菌株16S rRNA基因序列分析

依照細(xì)菌16S rDNA基因中最保守的序列，采用正向引物F26：5-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3；反向引物R1492：5-CGG CTA CCT TGT TAC GAC TTC-3對菌株進(jìn)行菌落PCR，挑取單菌落于20 μL無菌水中，100℃水浴7 min，12 000 rpm離心5 min，取1 μL上清液作為PCR模板.30 μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer（with Mg2+）3 μL，dNTP（2.5 mmol/L each）2 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，模板1 μL，加MilliQ水至30 μL.反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸30 s，33個循環(huán)，72℃最終延伸9 min.PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆于pUCm-T載體，并轉(zhuǎn)化入DH5α.經(jīng)過抽提質(zhì)粒和PCR驗證正確后，送基因測序公司測定其DNA序列，最后將測定的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，與數(shù)據(jù)庫中已有的16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比較分析.用ClustalX進(jìn)行序列比對后采用MEGA4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析.

1.4菌株重金屬最低抑制濃度（MIC）的測定

挑取抗性菌株的單菌落于新鮮的牛肉膏液體培養(yǎng)基中，25℃振蕩培養(yǎng)，待菌液比較渾濁時，移取1%的接種量至含有新鮮定量的牛肉膏液體培養(yǎng)基中，25℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，待OD600值達(dá)到0.2左右，在其中加入相應(yīng)的重金屬濃度，24 h后取出，檢測菌體生長狀況.

1.5菌株重金屬吸附能力測定及反應(yīng)動力學(xué)研究

將斜面保藏的菌株活化后制成菌懸液，25℃振蕩培養(yǎng)，待菌液比較渾濁時，移取1%的接種量至含有新鮮定量的牛肉膏液體培養(yǎng)基中，25℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)；待OD600值達(dá)到0.2左右，在其中加入相應(yīng)的重金屬濃度，每3 h后取出一定菌液；10 000 r/min離心5 min收集上清液，用原子吸收分光光度計測定上清液中金屬的濃度并計算吸附率.以加有等量去離子水的液體培養(yǎng)基為對照，以對菌株對重金屬吸附的反應(yīng)動力學(xué)進(jìn)行測定［6］.

2　結(jié)果與討論

2.1電子垃圾污染地區(qū)來源重金屬抗性菌株的分離

從汕頭貴嶼受電子垃圾污染地區(qū)的樣品中，初步分離到12株具有抗Cu2+能力的菌株，其菌落形態(tài)差異明顯（如表1所示）；與本課題組前期研究獲得的結(jié)果一致［5］.

選取其中抗Cu2+能力強的菌株HZB，鑒定其菌種，并進(jìn)一步研究其生理生化特性和抗重金屬能力.

2.2菌株HZB的生理生化特性及鑒定

2.2.1生理生化特性

從菌落形態(tài)上觀察，菌株HZB為圓形、凸起菌落，其邊緣整齊，呈乳白色，表面光滑；顯微鏡觀察為短桿菌，經(jīng)革蘭氏染色為陽性菌.通過對其生理生化特性分析，結(jié)果顯示該菌株為氧化酶陽性，甲基紅陽性，V-P試驗陽性，吲哚試驗陰性.

表1　具重金屬銅抗性菌株初步篩選結(jié)果統(tǒng)計

對菌株HZB進(jìn)行培養(yǎng)，測定其OD600以確定其生長曲線，結(jié)果如圖1所示.菌株在25℃振蕩培養(yǎng)，于4 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，在20 h后達(dá)到生長后期，24 h后進(jìn)入衰減期.

為了測定不同pH值對菌株生長的影響，設(shè)計pH梯度5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0培養(yǎng)24 h，測量OD600的值，其生長狀況如圖2.菌株在不同的pH值的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)都能達(dá)到OD600為0.6左右的最高菌體濃度，因為所用的pH值偏于酸，說明菌株對不同的pH值具有較強的適應(yīng)能力.

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，菌株在較低pH值（如5.5、6.0、6.5）達(dá)到生長最高峰所需的時間要比在較高pH（如7.0、7.5、8.0）的要長，說明不同的pH值對菌株的生長速率有一定的影響.為了研究菌株的抗重金屬能力，后續(xù)的實驗都選擇在pH值7.0的條件下進(jìn)行.

圖1　菌株HZB的生長曲線

圖2　不同pH值培養(yǎng)下菌株HZB的生長曲線

2.2.2菌株16S rRNA基因序列分析

取菌株HZB單菌落，對其16S rRNA基因中最保守的序列進(jìn)行測序.對測定后的16S rRNA基因序列進(jìn)行BLAST比對分析（如圖3），發(fā)現(xiàn)菌株HZB與Bacillus cereus的菌株相似性達(dá)99%，因此初步將其歸于Bacillus屬，并命名為Bacillus sp.HZB，同時將其序列提交到Genbank（基因序列號為FJ790330）.

早在1977年就有人發(fā)現(xiàn)了Cu2+能刺激B.cereus菌產(chǎn)生重金屬結(jié)合能力的銅蛋白糞卟啉Ⅲ［7］.對B. cereus菌株抗重金屬汞的研究有多篇報道，在一株能在50 mM HgCl2條件下生長的B.cereus中，研究者發(fā)現(xiàn)Hg2+能增加細(xì)菌還原性NADPH的產(chǎn)量［8］；從受汞嚴(yán)重污染的帕麗卡湖底沉積物中分離出一些具有汞抗性的B.cereus菌，實驗表明這些菌的汞抗性是由染色體基因決定的，其中有5個菌株具有merA和merB3基因，而其它不具備這些基因的B.cereus菌可能具有其它抗汞的機制［9］.

圖3　菌株HZB的16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3菌株對重金屬的最低抑制濃度（MIC）

最低抑菌濃度（MIC）是指在體外試驗中，各種重金屬能抑制培養(yǎng)液中細(xì)菌生長的最低濃度，MIC值越大，重金屬對菌體的毒性越??；相反，其對菌體的毒性就越大.本實驗通過測定Cr2+、Cu2+和Cd2+三重金屬離子對菌株的毒性，獲得結(jié)果如圖4所示.菌株HZB具有單抗4.2 mmol/L Cr2+、2.5 mmol/L Cu2+和0.7 mmol/L Cd2+的能力.

Maiti等［10］發(fā)現(xiàn)B.cereus菌對Cd2+、Zn2+、Cu2+和Pb2+等都具有較強的抗性，說明B.cereus菌的重金屬抗性的獨特性質(zhì).曾奇玉等［11］研究發(fā)現(xiàn)腸桿菌ZM-12具有較強的Cu2+、Pb2+、Mn2+、Ni2+耐受性，在不同種類的重金屬培養(yǎng)基中，其MIC值各不相同，菌株ZM-12對Cu2+、Pb2+、Mn2+、Ni2+的MIC值分別為22.33 mmol/L、14.48 mmol/L、＞200 mmol/L和58.69 mmol/L.

2.4菌株HZB對Cu2+的吸附能力及反應(yīng)動力學(xué)

將斜面保藏的菌株活化后制成菌懸液，25℃振蕩培養(yǎng)，待菌液比較渾濁時，移取1%的接種量至含有新鮮定量的牛肉膏液體培養(yǎng)基中，25℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，待OD600值達(dá)到0.2左右，在其中加入Cu2+，每3 h后取出一定菌液，10 000 r/min離心5 min收集上清液，用原子吸收分光光度計測定上清液中金屬的濃度并計算吸附率，并把這種情況設(shè)定為應(yīng)激抗性的情況.

另設(shè)一個適應(yīng)的情況，在含重金屬的培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株，使其達(dá)到適應(yīng)重金屬濃度的狀態(tài)，移取1%的接種量至含有新鮮定量含重金屬Cu2+的牛肉膏液體培養(yǎng)基中，25℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每3 h后取出一定菌液，10 000 r/min離心5 min收集上清液，用原子吸收分光光度計測定上清液中金屬的濃度并計算吸附率.

圖4　不同重金屬對菌株HZB的最低抑制濃度

圖5　菌株HZB對重金屬銅在不同時間長度下的吸附量

菌株HZB吸附Cu2+過程如圖5、6所示，表明在生長周期中菌株對Cu2+的吸附量隨時間的增長而增加，以1%接種量在24 h后，吸附量達(dá)到了2.1 g/mL.但單位菌株Cu2+吸附量有一個先減后增的過程，在15 h菌密度達(dá)到最高時，單位菌株Cu2+吸附量最少；而且在不同培養(yǎng)時間段加入重金屬對菌體的生長和吸附也有影響.

通過研究B.cereus、B.subtilis、E.coli和Pseudomonas aeruginosa四種菌株對Ag+、Cd2+、Cu2+、La3+的吸附特性，Mullen等［12］發(fā)現(xiàn)P.aeruginosa和B.cereus在1 mM濃度下對Cd2+和Cu2+具有很高的吸附效率；電子顯微鏡檢測顯示La3+的吸附主要集中在細(xì)菌的表面，在表面形成針形的簇狀結(jié)構(gòu)，但Cd2+、Cu2+由于不能提供更強的電子，而未能確定其在細(xì)菌上的吸附位置.

圖6　在應(yīng)激和適應(yīng)生長條件下的單位菌株的重金屬吸附量及菌株生長曲線

Langmuir吸附理論認(rèn)為固體吸附劑表面均勻地分布著具有吸附能力的位點，每個位點只能吸附一個分子，吸附熱不隨吸附而產(chǎn)生變化.Freundlich吸附理論認(rèn)為吸附熱隨著吸附量的增加呈對數(shù)形式的降低［13］.Lu等［14］用腸桿菌屬的菌株J1開展吸附Pb2+、Cu2+和Cd2+的研究，結(jié)果表明菌株J1對Cu2+和Cd2+的吸附能很好的符合Langmuir和Freundlich等溫吸附理論，但對Pb2+的吸附則表現(xiàn)為一種不同的模型；他們認(rèn)為這可能與細(xì)胞內(nèi)的重金屬積累有關(guān).Maiti等［10］利用固定的B.cereus菌株M1對六價的Cr進(jìn)行吸附，他們分別檢測了在不同流速、濃度、固定床高度條件下的細(xì)菌表面吸附速率和胞內(nèi)吸附速率，結(jié)果表明細(xì)菌表面的重金屬吸附起到了決定性的作用.

通過曲線擬合，如圖7～8所示，菌株HZB在適應(yīng)條件下菌體對Cu2+的吸附更加符合Langmuir吸附理論，其擬合方程R=0.962 0；而Freundlich吸附方程擬合R=0.894 6；說明HZB菌體吸附Cu2+接近于單分子層吸附的理想狀態(tài).

圖7　Langmuir吸附方程擬合（R=0.962 0）

圖8　Freundlich吸附方程擬合（R=0.894 6）

黃志鈞等［15］從四川紅原地區(qū)土壤中分離純化得到對Cu2+具有良好抗性的菌株YS-22；利用該菌進(jìn)行生物吸附研究，結(jié)果顯示其對水體中的Cu2+具有良好的吸附性能，吸附行為能很好地符合Pseudo二級動力學(xué)模型和Langmuir等溫吸附模型.李蘭松等［16］發(fā)現(xiàn)銅抗性細(xì)菌BX在優(yōu)化的條件下，Cu2+吸附率達(dá)85.84%，吸附量為128.74 mg/g，其對Cu2+的吸附符合準(zhǔn)二級動力學(xué)方程和Freundlich等溫吸附模型.

本文從電子垃圾污染地區(qū)樣品中獲得了多株具有較高抗重金屬（銅、鉛、鎘）能力的菌株，其中蠟狀芽孢桿菌HZB對銅、鉛、鎘的抗性明顯；并初步研究了菌株HZB的相關(guān)特性.進(jìn)一步深入研究這些菌株的重金屬抗性機制、修復(fù)電子垃圾污染地區(qū)能力，具有重要的理論意義和應(yīng)用價值.

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A Study on a Heavy Metal Resistant Strain Isolated from Electronic Waste Pollution Region

HU Yu1，CHEN Biao2，KAN Jie2，ZHANG Qing-yan1，HUANG Tong-wang2
（1.Jinshan Middle School of Shantou，Shantou，Guangdong，515063；2.Biology Department of Shantou University，Shantou，Guangdong，515063）

Twelve strains with a high resistance to heavy metal（Cu2+）were isolated from the electronic-waste sample by selective mediums.Strain HZB，one of the 12 bacteria，exhibited a high resistance to Cr2+and Cd2+，too.It performed the resistance against 4.2 mmol/L of Cr2+，2.5 mmol/L of Cu2+and 0.7 mmol/L of Cd2+，respectively.The results from physiological-biochemical characteristics and 16S rDNA sequence indicated that strain HZB belonged to Bacillus cereus.Under the pressure of copper，strain HZB had an obvious capacity of copper adsorption，and showed similar adsorption curve under the condition of stress and adaptation.The biosorption of HZB toward Cu2+at adaptation of state was in accordance with the Langmuir model.

heavy metal；resistant strain；Cu2+；electronic-waste

X 172

A

1007-6883（2016）03-0078-06

責(zé)任編輯朱本華

2016-01-22

廣東省科技計劃項目（項目編號：2012B060400016）.

胡昱（1999-），女，湖南攸縣人，汕頭市金山中學(xué)在讀學(xué)生.a：并列第一作者，*：通訊作者twhuang@stu.edu.cn.