董巍，郝修潔，王超眾，郭麗娜，潘虹，林宇，李曉明

(1.齊齊哈爾醫(yī)學院藥學院，黑龍江 齊齊哈爾　161006；2.齊齊哈爾市食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江 齊齊哈爾　161006)

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高效液相色譜法測定對葉百部根蜜炙后對葉百部堿的含量

董巍1，郝修潔2，王超眾2，郭麗娜1，潘虹1，林宇1，李曉明1

(1.齊齊哈爾醫(yī)學院藥學院，黑龍江 齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾市食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江 齊齊哈爾161006)

目的采用高效液相色譜法(HPLC)測定對葉百部根蜜炙前后對葉百部堿的含量。方法采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)，使用迪馬Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈-0.2%氨水流動相，流速1.0 mL·min-1，柱溫35 ℃，檢測波長254 nm，進樣量20 μL。結果對葉百部堿線性范圍為31.25～500.0 mg·L-1，r= 0.999 5，平均加樣回收率(n=9)為99.88%，RSD為0.26%。不同產地對葉百部根中對葉百部堿含量差異較大，其中河北對葉百部根中對葉百部堿含量較高為1514.80 μg·g-1，廣西產對葉百部堿含量較低為197.40 μg·g-1。蜜炙后河北、廣西產對葉百部根中對葉百部堿含量分別為919.60、129.76 μg·g-1。結論該文建立的含量測定方法符合要求。對葉百部根經蜜炙后對葉百部堿的含量下降，表明蜜炙對葉百部根中生物堿類成分的含量產生了一定影響。

百部/化學;蜜炙;色譜法,高壓液相

百部為百部科植物直立百部Stemonasessilifolia(Miq.) Miq.、蔓生百部Stemonajaponica(BL.) Miq.、對葉百部StemonatuberosaLour.的干燥根[1]，具有止咳、殺蟲的功效。目前百部炮制工藝以蜜炙為主[2]，百部生品有小毒，對胃的刺激性通過蜂蜜炮制后可緩解，其蜜炙品常用于治療久咳?，F代研究表明蜜炙百部止咳效果優(yōu)于生品[3]，但是蜜炙后該作用增強的物質基礎尚不明確，相關研究已報道百部中生物堿類成分的含量測定方法，但百部通過蜂蜜炮制前后發(fā)揮鎮(zhèn)咳作用主要成分的含量差異尚未見報道[4-7]。

百部的不同品種中以對葉百部鎮(zhèn)咳效果最好[8]，因此本研究以對葉百部為研究對象。百部屬生物堿主要發(fā)揮鎮(zhèn)咳、止咳作用[9-10]，其中對葉百部堿是具有代表性的活性成分[11]，本研究采用HPLC方法建立對葉百部根中對葉百部堿的含量測定方法，通過該方法比較蜜炙前后對葉百部根中對葉百部堿的含量差異，分析蜜炙對百部生物堿類成分含量的影響，為生、炙對葉百部飲片的質量評價及對葉百部臨床應用提供實驗依據。

1　儀器與試藥

1.1儀器Waters 2695 型高效液相色譜儀，Waters 2996 DAD 檢測器(美國Waters公司)。Empower 工作站(美國Waters公司)；FA2004N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；AL 204 電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ-500 DB超聲波清洗機(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；WTL-10K離心機(湖南湘儀有限公司)；微量取樣器(法國吉爾森10～100 μL，100～1000 μL)。

1.2試藥對葉百部藥材購自廣西省藥材玉林中藥港，河北省安國市昌達中藥材飲片有限公司，由齊齊哈爾醫(yī)學院郭麗娜教授鑒定為百部科植物對葉百部StemonatuberosaLour.的干燥根；對葉百部堿對照品(購自成都維克科技有限公司，含量98%，批號：6879-1-2)；甲醇、乙腈(色譜純，美國 Merck 公司)；氨水(天津市凱通化學試劑有限公司)；乙醇(分析純，天津市福晨化學試劑廠)；純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；楊槐蜂蜜(北京百花蜂業(yè)科技發(fā)展股份公司)。

2　方法與結果

2.1對照品溶液的制備取對葉百部堿對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成每1 mL 含1.0 mg的對照品儲備液，冷藏備用。

2.2蜜炙對葉百部的制備取煉蜜25 g，加入適量沸水稀釋后，與對葉百部藥材200 g拌勻，悶透后用文火炒至對葉百部藥材表面棕黃色時，取出，放涼備用[12]。

2.3供試品溶液的配制稱取對葉百部生品及蜜炙品粉碎成粉末，取藥材粉末(過3號篩)各10 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入75%乙醇100 mL，稱定重量，回流提取2h，放冷，再稱定重量，用75%乙醇補足失重，搖勻。重復回流提取一次，合并兩次濾液。取濾液于10 000 r·min-1離心10 min，濾液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.4色譜條件色譜柱為迪馬Diamonsil-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.2%氨水溶液，梯度洗脫：0～5 min，45%～50% 乙腈；5～20 min，50%～50% 乙腈；20～30 min，50%～65%乙腈；流速1.0 mL·min-1；柱溫35 ℃；檢測波長254 nm；進樣量20 μL。理論板數按對葉百部堿色譜峰計算高于5 000。對葉百部堿色譜峰與其他峰達到基線分離，峰形對稱，色譜峰見圖 1。

2.5線性關系的考察取對照品溶液，依次用甲醇稀釋成0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·L-1的標準品溶液，精密吸取20 μL進樣。記錄色譜圖，測定峰面積，以對葉百部堿的峰面積對濃度(mg·L-1)進行線性回歸，得對葉百部堿的回歸方程為Y=5.63×106X+1.54×105(r=0.9995)。結果表明對葉百部堿在31.25～500.0 mg·L-1范圍內線性關系良好。

2.6精密度試驗精密吸取0.125 g·L-1對照品溶液20 μL，按照“2.4”項下色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積，對葉百部堿峰面積的RSD為0.65%。結果表明該方法精密度良好。

A.對照品

B.河北生品

C.河北蜜炙品

D.廣西生品

E.廣西蜜炙品

2.7重復性試驗精密稱取對葉百部生品10 g，共6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件進行測定，對葉百部堿含量的RSD為1.08%。結果表明該方法重復性良好。

2.8穩(wěn)定性試驗精密吸取同一供試品溶液20 μL，分別于 0、2、4、8、12、24 h進樣測定，考察其穩(wěn)定性，結果峰面積的RSD為0.78%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.9加樣回收率試驗精密稱取已測定的廣西產對葉百部生品5.0 g，共9份，平均分為 3 組，每組分別精密加入低、中、高3個濃度的對葉百部堿對照品，按“2.3”項下方法制備樣品，按“2.4”項下色譜條件進行測定，按外標法計算含量，結果見表1。

表1　加樣回收率試驗結果(n=9)

2.10樣品含量測定精密稱取不同產地對葉百部生品及蜜炙品10.0 g，平行3份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，采用外標法計算含量，取3份平均值，結果見表2。

表2　對葉百部中對葉百部堿含量測定結果(n=3)

3　討論

3.1藥材產地的選取本研究所用藥材購自廣西省及河北省，一方面是由于廣西省是對葉百部藥材的主產區(qū)；另一方面，課題組曾選取對葉百部在全國的主要產區(qū)，如河北、安徽、廣西等，以最低抑菌濃度為指標，進行體外抗肺炎支原體細胞實驗，結果表明，河北產對葉百部抗肺炎支原體活性較強。因此，本研究選取廣西省及河北省產對葉百部。

3.2提取條件的確定分別對對葉百部樣品采取超聲、加熱回流方法進行提取，提取溶劑考察了100%乙醇、75%乙醇水溶液、100%甲醇、75%甲醇水溶液，提取用量分別考察了20、50、100 mL和提取時間30、60、100 min等因素。結果顯示，用75%乙醇水溶液加熱回流提取，方法簡便且峰形較好。

3.3流動相的確定由于測定主要成分呈堿性，在甲醇-水或乙腈-水系統(tǒng)系統(tǒng)中色譜峰峰形較差，考察向洗脫系統(tǒng)中加入不同濃度氨水，最終發(fā)現以乙腈-0.2%氨水溶液作為流動相峰形最佳，分離較好。

3.4檢測波長的確定對對葉百部樣品進行全波長掃描(波長190～400 nm)，發(fā)現在254 nm處時對葉百部堿吸收較好，可用于含量測定，因此選擇254 nm作為本研究含量測定最終檢測波長。

4　結論

本研究通過對廣西、河北兩個產地對葉百部飲片中對葉百部堿成分的含量測定，發(fā)現對葉百部堿的含量存在差異，河北產的含量較高。經過蜜炙炮制后，廣西產對葉百部中對葉百部堿含量為129.76 μg·g-1，較蜜炙前下降；河北產對葉百部蜜炙后對葉百部堿含量為919.60 μg·g-1，較蜜炙前下降，可見兩個產地的對葉百部生品經蜜炙后對葉百部堿含量均降低。傳統(tǒng)認為，百部生品有小毒，經蜜炙后可降低刺激性，本研究表明，對葉百部經蜜炙炮制后，發(fā)揮鎮(zhèn)咳活性的主要生物堿類成分含量降低，蜂蜜是否發(fā)揮協(xié)同增效作用從而保證蜜炙品鎮(zhèn)咳活性，還需進一步藥效實驗證明。

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Changes of tuberostemonine in root of Stemona tuberosa before and after stir-frying with honey by HPLC

DONG Wei1,HAO Xiujie2,WANG Chaozhong2,et al

(1.CollegeofPharmacy,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar,Heilongjiang161006,China;2.QiqihaerInstituteforFoodandDrugControl,Qiqihar,Heilongjiang161006,China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of tuberostemonine in root ofStemonatuberosaLour.during stir-frying with honey.MethodsHPLC and Diamonsil-C18column (250 mm×4.6 mm,5 μm) were adopted,with acetonitrile-0.2% ammonia as the mobile phase at the flow rate of 1.0 mL·min-1.The column temperature was set at 35 ℃,and the UV detection wavelength was 254 nm.Sample quantity was 20 μL.ResultsTuberostemonine showed a good linear relationship within the range of 31.25～500.0 mg·L-1(r=0.999 5),with the average recovery of 99.88% (n=9),RSD being 0.26%.Tuberostemonine contents ofStemonatuberosaLour.in different areas had great difference.The content ofStemonatuberosaLour.purchased from Hebei was the highest,1514.80 μg·g-1,and the lowest was purchased from Guangxi,197.40 μg·g-1.After stir-frying with honey,the content of tuberostemonine were decreased to 919.60,129.76 μg·g-1,respectively.ConclusionsThe method was simple and reliable,which met the requirements.The content of tuberostemonine is decreased by stir-frying with honey,indicating that honey-processed approach had an effect on the content of alkaloids inStemonatuberosaLour.

Stemona japonica/chemistry;Honey processing;Chromatography,high pressure liquid

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12541925)

董巍,女,博士,研究方向:中藥藥效物質基礎研究,E-mail:pingguoweiweiwei@126.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.017

2016-05-01，

2016-06-10)