趙榮，李聞濤，董彬廠，陳萍

(1.陜西海天制藥有限公司，陜西 咸陽(yáng)　712000；2.陜西省醫(yī)療器械檢測(cè)中心，陜西 西安　710075 ；3.陜西省中醫(yī)研究院，陜西 西安　710045)

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◇藥物分析◇

藥用沙棘籽油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

趙榮1，李聞濤2，董彬廠1，陳萍3

(1.陜西海天制藥有限公司，陜西 咸陽(yáng)712000；2.陜西省醫(yī)療器械檢測(cè)中心，陜西 西安710075 ；3.陜西省中醫(yī)研究院，陜西 西安710045)

目的研究藥用沙棘籽油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制方法。方法(1)采用系列薄層色譜法(TLC)對(duì)藥用沙棘籽油進(jìn)行鑒別。(2)采用HPLC法測(cè)定藥用沙棘籽油中的維生素E。色譜柱：Kromasil-C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈(78∶22)；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：1.0 mL·min-1。結(jié)果(1)采用系列TLC 法對(duì)藥用沙棘籽油進(jìn)行鑒別具有較好的專屬性。(2)維生素E在0.197 2～1.972 mg·L-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 7)，平均回收率為99.6%(RSD=0.92%，n=6)。結(jié)論所建立的標(biāo)準(zhǔn)科學(xué)合理，可用于藥用沙棘籽油的質(zhì)量控制。

沙棘/標(biāo)準(zhǔn);色譜法,薄層;維生素E

沙棘具有悠久的藥用歷史，古代中國(guó)藏醫(yī)、蒙醫(yī)都將沙棘列為重要的藥用植物。1977年收載進(jìn)入《中國(guó)藥典》，是國(guó)家醫(yī)藥局和衛(wèi)生部聯(lián)合公布的藥食同源植物。沙棘籽油是從沙棘種籽提取分離得到的脂肪油，沙棘籽油中除含不飽和脂肪酸外，還含維生素E、熊果酸等多種生物活性成分，現(xiàn)在廣泛的用于藥品、保健品及化妝品等領(lǐng)域[1]。其中維生素E具有組織修復(fù)，抗氧化，能增強(qiáng)皮膚毛細(xì)血管抵抗力，并維持正常通透性，改善血液循環(huán)及調(diào)整生育功能、抗衰老等藥理作用，因此可用于治療燒傷、凍傷、毛細(xì)血管出血，預(yù)防流產(chǎn)、更年期綜合癥、美容等。國(guó)外的沙棘保健食品種類很多，而國(guó)內(nèi)的沙棘保健食品寥寥無(wú)幾，其中缺乏沙棘籽油行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致沙棘籽油的品質(zhì)良莠不齊[2]，是制約了沙棘類產(chǎn)品的深度開(kāi)發(fā)的原因之一。為了更好的適應(yīng)沙棘的醫(yī)藥和保健用途，本文進(jìn)行了沙棘籽油控制方法的研究，建立了沙棘籽油鑒別和含量控制方法。

1　儀器與試藥

1.1儀器METTLER AE240型電子天平，電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)，紫外燈(上海康樂(lè)光電儀器有限公司)，硅膠G薄層板(青島海浪硅膠干燥劑有限公司)，美國(guó)Waters 2695型高效液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣器，2487型紫外檢測(cè)器，Waters 2414柱溫箱，Empower2色譜工作站)；QTSXR型超聲清洗器(天津市瑞普電子儀器公司)，Millipore超純水機(jī)。

1.2試藥沙棘對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院121519-200912)；沙棘油對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院111627-200301)；熊果酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院110742-200516)；維生素E對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所100062-201110)；甲醇(色譜純，美國(guó)Merck公司)；液溴、四氯化碳、石油醚、無(wú)水乙醇等試劑均為分析純。

1.3樣品沙棘籽油陜西海天制藥有限公司提供，批號(hào)：140507、140801、141001。

2　定性鑒別

取液溴0.1 mL加四氯化碳至10 mL，搖勻，量取2.0 mL置于試管中，滴入本品0.2 mL，振搖0.5 min，液體顏色由紅棕色變成無(wú)色或淡黃色。

取含量項(xiàng)下供試品濾液蒸干后的殘?jiān)?，加無(wú)水乙醇5 mL溶解，作為供試品溶液。另取沙棘對(duì)照藥材4 g，同供試品溶液制備方法，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇2 mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部0502)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯(8∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%的磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，供試品色譜中在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的藍(lán)色斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

注：1.沙棘對(duì)照藥材;2.供試品溶液(批號(hào)：140507);3.供試品溶液(批號(hào)：140801);4.供試品溶液(批號(hào)：141001);5.沙棘對(duì)照藥材。

圖1沙棘藥材薄層鑒別圖譜

取本品0.2 mL，加石油醚(60～90 ℃)5 mL溶解，作為供試品溶液。另取沙棘油對(duì)照品0.2 mL，同法制成對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶2∶4∶0.2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%的磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，供試品色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的藍(lán)色斑點(diǎn)。 見(jiàn)圖2。

取本品2.0 mL，加水-丙酮-石油醚(60～90 ℃)-甲醇-甲酸(1∶2.5∶4.5∶1∶0.2)9.2 mL，振搖，分層，取下層溶液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取熊果酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20∶4∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%的硫酸乙醇溶液，在80 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，供試品色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的紫紅色斑點(diǎn)；置紫外光燈下(365 nm)檢視，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

注：1.供試品溶液(批號(hào)：140507);2.供試品溶液(批號(hào)：140801);3.供試品溶液(批號(hào)：141001);4.沙棘油對(duì)照品。

圖2沙棘油薄層鑒別圖譜

注：1.供試品溶液(批號(hào)：140507);2.供試品溶液(批號(hào)：140801);3.供試品溶液(批號(hào)：141001);4.熊果酸;5.沙棘對(duì)照藥材。

圖3熊果酸的薄層鑒別圖譜

3　維生素E的含量測(cè)定

3.1色譜條件色譜柱 Kromasil-C18不銹鋼柱 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈(78∶22)；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃。

3.2對(duì)照品溶液的制備精密稱定維生素E對(duì)照品98.60 mg，置100 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，即得維生素E對(duì)照品濃溶液。再精密吸取濃溶液10 mL置于50 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，即得每1 mL中含維生素E 0.197 2 mg的對(duì)照品溶液。

3.3供試品溶液的制備取本品5 g，精密稱定，置50 mL圓底燒瓶中，加無(wú)水乙醇20 mL，抗壞血酸2 g，沸水浴加熱使沸騰，加氫氧化鉀試液(40→50)10 mL，回流30 min，冷卻后將溶液移入分液漏斗中，加水50 mL，用乙醚200 mL提取3次(100、50、50 mL)。合并乙醚液，用水洗滌乙醚至中性，加無(wú)水硫酸鈉約3 g，濾過(guò)，濾液在水浴微熱蒸干，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇溶解并定溶至10 mL量瓶中，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

3.4系統(tǒng)適用性試驗(yàn)分別精密取無(wú)水乙醇試劑空白、供試品溶液、對(duì)照品溶液(0.098 6 g·L-1)各10 μL，注入液相色譜儀，依法測(cè)定。結(jié)果表明，維生素E的保留時(shí)間約為22 min，樣品中維生素E與其他組分分離完全，試劑對(duì)維生素E測(cè)定無(wú)干擾，理論板數(shù)按維生素E計(jì)算不低于5 000。見(jiàn)圖4。

A.試劑空白

B.對(duì)照品

C.供試品

3.5線性關(guān)系考察分別精密吸取“3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各1、2、4、6、8、10 μL ，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程：Y=257 655X-3 937.7，r=0.999 7。維生素E在0.197 2～1.972 μg的范圍與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.6精密度試驗(yàn)取“3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄維生素E的峰面積，并計(jì)算RSD值，結(jié)果RSD為0.97%。

3.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批供試品溶液(批號(hào)：140507)，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、16 h進(jìn)樣10 μL，依法測(cè)定。記錄維生素E的峰面積并計(jì)算RSD值，結(jié)果RSD為1.33%，表明樣品溶液在室溫放置16 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.8重復(fù)性試驗(yàn)分別精密稱取同一批號(hào)(批號(hào)：140507)樣品6份，按照“3.3”項(xiàng)下的方法制備，依法測(cè)定峰面積值并用回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果維生素E的平均含量為0.013 7 mg·g-1，RSD值為0.91%。

3.9回收率試驗(yàn)加樣回收法，取已知含量的供試品(批號(hào)：140507)5 g共6份，精密稱定，置50 mL圓底燒瓶中，分別精密加入維生素E對(duì)照品溶液(濃度為0.197 2 g·L-1)1.0、0.6 mL，按“3.3”項(xiàng)下方法制備，依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。維生素E的平均回收率為99.6%，RSD為0.92%。

表1　維生素E加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3.10樣品測(cè)定取沙棘籽油樣品3批次，分別按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中維生素E的含量，結(jié)果3批樣品中維生素E的含量依次為：0.013 5、0.010 9、0.012 9 mg·g-1。

4　討論

沙棘籽油是以不飽和脂肪酸為主的植物油，與液溴的四氯化碳溶液顯色反應(yīng)是不飽和脂肪酸的鑒別反應(yīng)之一，此方法操作簡(jiǎn)便易行、檢驗(yàn)速度快、結(jié)果明顯，故作為沙棘籽油的質(zhì)量控制手段。

在采用對(duì)照藥材的鑒別試驗(yàn)中，我們選取了(1)甲苯；(2)甲苯-乙酸乙酯(8∶2)；(3)石油醚(60～90 ℃)-甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶2∶0.2)三種展開(kāi)劑進(jìn)行試驗(yàn)，其中展開(kāi)劑甲苯-乙酸乙酯(8∶2)試驗(yàn)所得斑點(diǎn)更清晰、色譜信息豐富，故該鑒別試驗(yàn)采用甲苯-乙酸乙酯(8∶2)為展開(kāi)劑。

熊果酸、齊墩果酸作為醫(yī)藥、保健的原料，也是沙棘果的活性成分之一。在熊果酸薄層色譜預(yù)試試驗(yàn)，由于熊果酸和齊墩果酸斑點(diǎn)幾乎無(wú)法分離，為確定合理的薄層鑒別指標(biāo)成分，我們通過(guò)HPLC分析法考察了沙棘籽油中熊果酸和齊墩果酸的含量，結(jié)果檢出熊果酸和齊墩果酸含量極低；通過(guò)文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，果皮中熊果酸是齊墩果酸2～4倍[3]，沙棘葉、果實(shí)、枝條中熊果酸是齊墩果酸2～3倍[4]，因此選擇熊果酸做為沙棘籽油的質(zhì)量控制手段。

針對(duì)沙棘油的主要活性成分維生素E的測(cè)定方法，已報(bào)道的有比色法、重量法、極譜法、薄層色譜法、高效液相色譜法[5-10]等。其中高效液相色譜法具有專屬、可靠、靈敏度高、干擾小等優(yōu)點(diǎn)，故選用高效液相色譜法測(cè)定維生素E含量來(lái)控制藥用沙棘籽油原料的質(zhì)量。本研究通過(guò)反相高效液相色譜法建立測(cè)定藥用沙棘籽油中維生素E含量的方法，該法簡(jiǎn)單、快速，將其列入藥用沙棘籽油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可以很好地控制其質(zhì)量。

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Quality standard for seeds oil of Hippophae rhamnaides L.

ZHAO Rong1,LI Wentao2,DONG Bingchang1,et al

(1.ShaanxiHaitianPharmaceuticalCo.,Ltd,Xianyang,Shaanxi712000,China;2.ShaanxiMedicalDevicesTestingCenter,Xi′an,Shaanxi710075,China)

ObjectiveTo establish the quality standard for Seeds Oil ofHippophaerhamnaidesL.MethodsThe Seeds Oil ofHippophaerhamnaidesL.was identified by a series of TLC methods.HPLC was adopted to determine the content of Vitamin E in the seeds oil ofHippophaerhamnaidesL.Kromasil-C18column(250 mm× 4.6 mm，5 μm) was used with methanol-acetonitrile(78∶22) as the mobile phase.The column temperature was set at 30 ℃ with a detection wavelength of 280 nm and a flow rate at 1.0 mL·min-1.ResultsA series of TLC methods for the identification of the seeds oil ofHippophaerhamnaidesL.showed good specificity.For Vitamin E,there was a good linear relationship within the range of 0.197 2～1.972 mg·L-1(r=0.999 5).The average recovery was 99.6% (RSD=0.92%,n=6).ConclusionsThe standard can be use for the quality control of Seeds Oil ofHippophaerhamnaidesL.

Hippophae rhamnoides/standards;Chromatography,thin layer;Vitamin E

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.016

2016-04-21，

2016-07-07)