沈豐，王艷，鄒明暢，盛玉青

(鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 鎮(zhèn)江　212002)

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棘豆素對人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細胞的作用研究

沈豐，王艷，鄒明暢，盛玉青

(鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 鎮(zhèn)江212002)

目的研究棘豆素(2′,4′-dihydroxychalcone,TFC)對人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細胞的作用，并探討其作用機制。方法CCK-8法檢測藥物對細胞增殖的影響；Hoechst 33258染色、熒光顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學變化；流式細胞術分析細胞凋亡率和細胞周期的變化；Western blot檢測藥物對腫瘤細胞中P27kip1和PTEN蛋白表達的影響。結果TFC能顯著抑制PC-3細胞的增殖，細胞呈現(xiàn)凋亡形態(tài)學改變，凋亡率明顯增加，細胞周期阻滯于G0/G1期。此外，P27kip1和PTEN蛋白表達量明顯增加。結論TFC通過誘導PC-3細胞凋亡抑制腫瘤細胞增殖，可能與其G0/G1細胞周期阻滯，以及PTEN 和P27Kip1蛋白表達上調有關。

前列腺腫瘤;黃酮類;棘豆屬;周期素依賴激酶抑制劑p27;基因,腫瘤抑制;細胞凋亡

前列腺癌是危害男性健康最常見的腫瘤之一，其發(fā)病率在美國居男性惡性腫瘤之首，占男性死亡原因的第二位[1]。在中國前列腺癌的發(fā)病率雖遠低于西方國家，然而近20年來，隨著居民生活方式的改變、平均壽命的延長及醫(yī)學診療水平的提高，我國前列腺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升趨勢，并且發(fā)病年齡也日趨年輕化[2]。局限性前列腺癌可以采用觀察隨訪、前列腺全切術和放療等治療手段，但我國大部分患者在確診時已伴有遠處轉移。對于晚期前列腺癌患者，內分泌治療是最主要的治療方法。但大部分前列腺癌患者在進行18～24個月持續(xù)內分泌治療后，會進展為雄激素非依賴性前列腺癌(androgen independent prostate cancer,AIPC)[3]。對于AIPC目前尚無有效的治療手段,化療作為二線治療方法被應用，但存在著選擇性差、毒副反應大及腫瘤細胞耐藥等問題。目前臨床迫切需要針對AIPC有效且毒副作用小的治療藥物。本研究考察了棘豆素(2′,4′-dihydroxychalcone,TFC)對人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細胞的作用，并初步探討其作用機制。

1　材料與儀器

TFC (純度大于 95%) 按照呂芳等[4]的方法提取，其結構如圖1所示。TFC以二甲亞砜(DMSO)助溶，DMSO最終濃度為1.0% (v/v)，并經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存待用。F-12培養(yǎng)基購自Life technologies (美國)；胎牛血清購自Invitrogen (美國)；CCK-8試劑盒和Hoechst 33258試劑盒均購自碧云天 (江蘇南通)； Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒和Cycletest plus DNA Reagent kit均購自BD Pharmingen (美國)；antiP27kip1 (D69C12,#3686)、antiPTEN (D4.3,#9188)和antiβ-actin (13E5,#4970)均購自Cell Signaling Technology (美國)；鼠抗兔二抗購自Abcam公司(英國)。Becton Dickinson流式細胞儀 (美國)； CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；酶標分光光度讀板儀(Bio-Rad 680，美國)；超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；Nikon倒置顯微鏡(日本)，ECL 發(fā)光試劑盒(上海普飛)。

圖1　TFC結構圖

2　方法

2.1細胞培養(yǎng)人前列腺癌細胞株PC-3購自中國科學院上海細胞庫，選用含10%胎牛血清的F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)液中青霉素、鏈霉素的濃度為100 U·mL-1，于37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，待細胞滿至80%左右時，用0.25%胰酶消化、傳代。

2.2TFC對PC-3細胞增殖的影響取處于對數(shù)生長期的PC-3細胞，消化、吹打成單細胞懸液，每孔98 μL接種于96孔板中(細胞密度約每孔5×103個細胞)，次日每孔加入2 μL的TFC，最終濃度分別為12.5、25、50、 100、200 μmol·L-1，每組3個復孔，同時設立對照組(1%二甲基亞砜DMSO)，TFC作用24 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，混勻后，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，然后置于酶標分光光度讀板儀下測定各孔中的吸光值(測定波長450 nm，參比波長650 nm)。按下面公式計算細胞抑制率：細胞抑制率(%)=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。

2.3TFC對PC-3細胞形態(tài)的影響取對數(shù)生長期的細胞以每孔5×105個細胞接種于六孔細胞培養(yǎng)板，孔中預先放入經高溫滅菌處理的小蓋玻片，待細胞爬片后，加TFC處理,使其終濃度分別為25、50、100 μmol·L-1，對照組用1% DMSO處理。加藥處理24 h后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 mL固定液固定10 min。去固定液，用PBS洗2遍，加入0.5 mL Hoechst 33258染色液染色5 min，用搖床晃動 2～3 min。去染色液，用PBS洗2遍。滴1滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片液，盡量避免氣泡。置熒光顯微鏡下觀察拍照，激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm。

2.4TFC對PC-3細胞凋亡率的影響將細胞以每孔1.0×106個細胞的密度接種于六孔板中，待細胞貼壁后去培養(yǎng)液，加入980 μL的培養(yǎng)液和20 μL不同濃度的TFC，使其終濃度分別為50、100、200 μmol·L-1，同時設立對照組(1% DMSO)。藥物作用24 h后將細胞培養(yǎng)液吸出至離心管內，PBS洗滌貼壁細胞1次，用胰酶消化細胞，合并收集的細胞液，1 000 g離心5 min，棄上清，用PBS洗滌細胞2次，Annexin V-FITC結合液(1×)輕輕重懸細胞，使細胞濃度達到每毫升1.0×106個細胞，取100 μL 的細胞懸液至5 mL的離心管中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，避光放置15 min，再加入400 μL Annexin V-FITC結合液(1×)，在1 h內使用流式細胞儀檢測細胞凋亡百分率。

2.5TFC對PC-3細胞周期的影響細胞準備和藥物處理同細胞凋亡率實驗，待TFC作用24 h后將細胞收集，用70%乙醇固定過夜，然后按照Cycletest plus DNA Reagent kit說明書的要求處理細胞，用流式細胞儀檢測細胞周期的變化。

2.6Western blot檢測P27kip1和PTEN蛋白的表達細胞準備和藥物處理同細胞凋亡率實驗，待TFC作用24 h后收集細胞，離心，PBS洗2次，加入一定量的細胞裂解液，置冰上裂解30 min。將裂解液移入eppendorf管中，12 000 g離心2 min，吸上清。取2～5 μL考馬斯亮藍G-250進行蛋白定量，其余樣品按比例加入3×SDS凝膠上樣緩沖液中溶解，煮沸5 min。取20 μg蛋白樣品進行15%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。恒壓條件下，積層膠內電泳電壓為80 V，分離膠電壓為100 V。在50 V恒壓的條件下、將凝膠置于轉移體系中轉膜4 h，將蛋白轉至PVDF膜上；將膜置于封閉液中封閉2 h；用PBST簡單清洗后將膜置于一抗稀釋液中4 ℃過夜；之后用PBST清洗6次，每次10 min；將膜置于二抗稀釋液中，室溫孵育2 h；再用PBST清洗6次，每次10 min；ECL發(fā)光3～5 min，暗室內X光片感光、顯影、定影、觀察。

3　結果

3.1TFC對PC-3細胞增殖的影響實驗結果表明TFC對PC-3細胞具有明顯的抑制作用，TFC濃度為25、50、100、200 μmol·L-1時，對PC-3細胞的抑制率分別為9.19%,57.49%,73.48% 和98.49%，呈明顯的劑量效應關系。其中50、100、200 μmol·L-1組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

表1　TFC對PC-3細胞增殖的影響(n=9)

注：與對照組相比，aP<0.01。

3.2TFC對PC-3細胞形態(tài)的影響Hoechst 33258為可通過細胞膜的特異性的 DNA 染料，在熒光顯微鏡下，活細胞核呈彌散狀的均勻熒光，而凋亡細胞的細胞核或細胞質內可出現(xiàn)濃染致密的顆粒塊狀熒光。對照組PC-3 細胞的細胞核大多呈彌散均勻熒光，且熒光較弱，隨著TFC給藥濃度的增加，細胞核出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學改變，細胞核出現(xiàn)固縮,呈致密強熒光，并向核膜靠攏,部分細胞核呈新月狀或碎裂成小塊狀。見圖2。

圖2　TFC對PC-3細胞形態(tài)的影響(×400)

3.3TFC對PC-3細胞凋亡率的影響對照組的凋亡率為(6.25±1.47)%，50、100、200 μmol·L-1的TFC作用PC-3細胞24 h后凋亡率分別為(44.58±7.19)%、(85.05±2.14)%和(93.62±3.08)%，具有明顯的量效關系，其中50、100、200 μmol·L-1組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

表2　TFC對PC-3細胞凋亡率的影響(n=3)

注：與對照組相比，aP<0.01。

3.4TFC對PC-3細胞周期的影響對照組G0/G1期細胞比例為(44.88±1.45)%，50、100、200 μmol·L-1的TFC作用PC-3細胞24 h后細胞周期分布發(fā)生明顯的變化，其中G0/G1期細胞比例分別達到(81.77±5.53)%、(88.05±2.79)%和(90.27±1.26)%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)，TFC導致PC-3細胞發(fā)生了明顯的G0/G1期阻滯，見表3。

表3　TFC對PC-3細胞周期的影響

注：與對照組相比，aP<0.01。

3.5TFC對P27kip1和PTEN蛋白表達的影響β-actin在對照組和TFC 50、100、200 μmol·L-1組的表達均較穩(wěn)定，P27kip1和PTEN在TFC的作用下蛋白表達量均顯著增加，且有明顯的量效關系，見圖3。

圖3　TFC對P27kip1和PTEN蛋白表達的影響

4　討論

TFC是從豆科棘豆屬(Oxytropis D.C.)植物鐮形棘豆的干燥全草中提取的單體黃酮類化合物。黃酮類化合物是鐮形棘豆的主要有效成分，除了具有抑菌[5]、抗炎鎮(zhèn)痛[6]、抗氧化[7]等藥理活性，還對多種腫瘤細胞具有抑制作用。顧青等[8]報道2′，4′-二羥基查耳酮對人肝癌細胞HepG2、小鼠黑色素瘤細胞B16F10、人肝癌細胞SMMC-7721、人肝癌細胞HuH7以及人乳腺癌細胞MDA-MB-23l五種腫瘤細胞的增殖均有明顯的抑制作用。楊光明等[9-11]研究發(fā)現(xiàn)鐮形棘豆黃酮類成分能抑制SMMC-7721細胞的增殖，可能與其下調MMP-2的轉錄水平、下調Bcl-2基因表達和降低Bcl-2/Bax的比值有關，并對H22荷瘤小鼠也有抑制腫瘤生長的作用。陳醒等[12]研究發(fā)現(xiàn)鐮形棘豆總黃酮抑制 SMMC-7721細胞的增殖與其誘導細胞周期阻滯和使細胞形態(tài)發(fā)生變化而引起細胞凋亡有關。Lou等[13]報道了棘豆素具有誘導人胃癌細胞MGC-803凋亡的作用，與其下調survivin mRNA表達有關。雖然鐮形棘豆黃酮類化合物對多種腫瘤細胞具有較好的抗腫瘤活性，但其對人前列腺癌細胞未見相關的研究報道。本研究考察了TFC對人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細胞的作用，研究發(fā)現(xiàn)TFC對PC-3細胞具有明顯抑制增殖的作用，通過Hoechst 33258染色觀察TFC對PC-3細胞形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著TFC給藥濃度的增加，細胞核出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學改變。進一步使用流式細胞儀觀察TFC對PC-3細胞凋亡率和細胞周期的影響，結果顯示TFC能明顯誘導PC-3細胞凋亡并引起G0/G1期阻滯，且有明顯的劑量效應關系。

P27Kip1基因是一種非特異性細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑 (cyclin dependent kinases inhibitors,CDKI)，通過抑制細胞周期素-細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-CDK)復合物的生物活性參與細胞周期調控，使細胞不能通過G1期。P27kipl蛋白水平與前列腺癌的惡性程度、臨床分期、淋巴結轉移以及預后均存在明顯的負相關。PTEN基因是1997年美國3個研究小組分別發(fā)現(xiàn)并命名的第1個具有磷酸酯酶活性的抑癌基因，由于其對磷酸化的絲/蘇氨酸和酪氨酸殘基具有去磷酸化作用而對細胞增殖起負調節(jié)效應。腫瘤細胞中PTEN的過表達可使細胞周期發(fā)生G1期阻滯，還有增加細胞凋亡率的作用。PTEN基因的失活或突變與前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關。已有研究證實，P27Kip1可能是PTEN所調控的重要的下游分子，是PTEN發(fā)揮抑癌作用的關鍵調節(jié)因子[14]。

為了進一步研究TFC誘導PC-3細胞凋亡的分子機制，本研究通過Western blot檢測了前列腺癌相關P27kip1和PTEN蛋白的表達，結果發(fā)現(xiàn)在TFC的作用下PC-3細胞的P27kip1和PTEN蛋白表達均呈現(xiàn)上調趨勢，推測TFC可能是通過上調PTEN表達從而引起P27Kip1表達的增加，導致PC-3細胞發(fā)生G0/G1期阻滯，誘導細胞凋亡的發(fā)生。本研究提示TFC可能是人雄激素非依賴性前列腺癌潛在的治療藥物，其作用機制還需進一步深入研究。

[1]Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2012,62(1):10-29.

[2]那彥群,葉章群,孫光.中國泌尿外科疾病診斷治療指南[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:49-66.

[3]Klotz L.Maximal androgen blockade for advanced prostate cancer[J].Best Pract Res Clin Endocrinol Metab,2008,22(2):331-340.

[4]呂芳,徐筱杰.藏藥鐮形棘豆中黃酮類化學成分研究[J].中國中藥雜志,2007,32(4):318-320.

[5]姜華,胡君茹,程曉華,等.藏藥鐮形棘豆總黃酮苷元抑菌活性的研究[J].天然產物研究與開發(fā),2014,26(3):407-409,383.

[6]瞿敏明,陳志鵬,蔡寶昌.鐮形棘豆經皮給藥后抗炎鎮(zhèn)痛活性有效部位的篩選[J].安徽醫(yī)藥,2011,15(1):14-16.

[7]王棟,唐煒,楊光明,等.藏藥鐮形棘豆黃酮類成分的抗炎、抗氧化及細胞毒性研究[J].中國天然藥物,2010,8(6):461-465.

[8]顧青,蔡銀娜,楊光明,等.藏藥鐮形棘豆的化學成分及其抗腫瘤活性研究[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(11):72-75.

[9]Yang GM,Yan R,Wang ZX,et al.Antitumor effects of two extracts from Oxytropis falcata on hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo [J].Chinese Journal of Natural Medicines,2013,11(5): 519-524.

[10] 楊光明,張芳芳,王棟,等.鐮形棘豆對SMMC-7721 肝癌細胞增殖及MMP-2 表達的影響[J].中國中藥雜志,2011,36(9):1227-1230.

[11] 楊光明,燕珂,顧青,等.藏藥鐮形棘豆總黃酮對SMMC-7721肝癌細胞凋亡及Bcl-2，Bax蛋白表達的影響[J].中國藥學雜志,2013,48(24):2113-2116.

[12] 陳醒,楊光明,張芳芳,等.鐮形棘豆誘導人肝癌細胞 SMMC-7721凋亡及初步的機制研究[J].中國中藥雜志,2011,36(10):1362-1365.

[13] Lou C,Yang G,Cai H,et al.2′,4′-Dihydroxychalcone-induced apoptosis of human gastric cancer MGC-803 cells via down-regulation of survivin mRNA[J].Toxicology in Vitro,2010,24:1333-1337.

[14] Gottschalk AR,Basila D,Wong M,et al.p27Kip1 is required for PTEN-induced G1 growth arrest [J].Cancer Res,2001,61:2105-2111.

2′,4′-dihydroxychalcone-induced apoptosis of PC-3 human prostate cancer cells via up-regulation of P27kip1 and PTEN

SHEN Feng,WANG Yan,ZOU Mingchang,et al

(DepartmentofPharmacy,FirstRenminHospital,Zhenjiang,Jiangsu212002,China)

ObjectiveTo explore the effect of 2′,4′-dihydroxychalcone (TFC) on androgen-independent prostate cancer PC-3 cells and its possible anti-cancer mechanism.MethodsThe CCK-8 assay was employed for cellular proliferation measurement,Hoechst 33258 dye and fluorescent microscope for morphological observation,flow cytometry (FCM) for detection of apoptosis and cell cycles,Western blot for analyzing the expression of P27kip1 and PTEN proteins in PC-3 cells treated with TFC of different concentration.ResultsTFC significantly inhibited the proliferation of PC-3 cells,induced apoptotic morphological features,increased the percentage of apoptosis,arrested cell cycle in G0/G1 phase,up-regulated the expression of P27kip1 and PTEN proteins in a concentration dependent manner.ConclusionsTFC could inhibit the proliferation and induce the apoptosis in PC-3 cells by up-regulating P27kip1 and PTEN protein and arresting cell cycle in G0/G1 phase.

Prostatic neoplasms;Flavones;Oxytropis;Cyclin-dependent kinase inhibitor p27;Genes,tumor suppre;Apoptosis

盛玉青，女，副主任中藥師，研究方向：中藥藥理，E-mail：syq770330@163.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.011

2016-03-16,

2016-06-14)