楊林，華棟，姜儀，郝瀧，司佳寧，劉曉風（蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州，730050）

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二色補血草內生真菌發(fā)酵產物抑菌活性研究

楊林，華棟，姜儀，郝瀧，司佳寧，劉曉風
（蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州，730050）

采用組織塊分離法分離二色補血草內生真菌，PDA液體培養(yǎng)基發(fā)酵，發(fā)酵液固液分離，發(fā)酵液（水相）依次以乙酸乙酯、正丁醇萃取，菌絲體（固相）干燥后甲醇提取，分別得到發(fā)酵液乙酸乙酯、正丁醇萃取物以及菌絲體甲醇提取物；濾紙片法進行抗菌活性篩選。結果從二色補血草不同部位共分離得到32株內生真菌，其中根中15株，莖中11株，葉中6株；二色補血草內生真菌發(fā)酵產物對各指示菌均有有不同程度的抑制作用，10株內生真菌的不同部位對2種或多種指示菌有不同程度的抑制作用，占分離菌株總數(shù)的31.25%。其中BL404乙酸乙酯、BR408正丁醇部位分別對肺炎克雷伯菌、綠膿桿菌最小抑制濃度達到0.313mg/mL。研究結果表明，二色補血草內生真菌具有較強的抑菌活性，對指示細菌的抑制范圍較寬，有一定的研究開發(fā)價值。

二色補血草；內生真菌；抑菌活性

二色補血草（Limonium bicolor）系白花丹科（P1umbaginaceae）補血草屬（Limonium Mill）的多年生草本植物，別名蒼蠅花、繩子草。主產于陜西、甘肅、寧夏、江蘇、河南等地，其性微溫，昧甘，具補血益氣，止血散瘀，活血調經，益脾健胃之功效［1］。本實驗對二色補血草內生真菌進行了分離并對其代謝產物抑菌活性進行了初步研究，旨在篩選出能產生抑菌活性物質的內生真菌，為發(fā)酵生產抑菌活性物質及二色補血草資源的綜合開發(fā)奠定基礎。

1 、材料與方法

1.1 植物材料

二色補血草（Limonium bicolor），于2014年9月采集于甘肅隴西縣，由蘭州理工大學生命學院楊林老師副教授鑒定。

1.2 實驗方法

1.2.1 內生菌的分離及純化

取新鮮的二色補血草植株，表面清洗干凈，在無菌條件下，進行如下表面消毒：75%酒精浸泡5min→無菌水沖洗3次→0.01%升汞浸泡30s→無菌水沖洗3次，晾干。將植物材料剪切成0.5cm×0.5cm大小的片段，接種于加有100U/mL青霉素鈉和硫酸鏈霉素的PDA平板上，置28℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3 10d，待組織周圍長出菌落后，采用菌絲尖端挑取法，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、長出時間的不同，及時挑取材料周圍菌絲轉接于新鮮培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，反復純化后轉于PDA斜面上，編號，4℃保存?zhèn)溆?。同時將經表面消毒后而不做切割的材料在培養(yǎng)基上做組織印跡，作為對照以檢驗消毒效果［2-4］。

1.2.2 內生菌發(fā)酵液的制備

將純化后的內生真菌接種到新鮮的PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7d活化菌株，活化后的菌種接種于500mLPD培養(yǎng)基，28℃，160r/min恒溫震蕩培養(yǎng)7-10d。發(fā)酵結束后，發(fā)酵液進行抽濾，將菌液和菌絲體分開，菌液先用等體積的乙酸乙酯萃取3次，然后用等體積的正丁醇萃取3次，分別合并有機相，回收溶劑，得到乙酸乙酯和正丁醇部位；菌絲體干燥，破碎，30-50倍體積的甲醇回流提取，提取液回收溶劑得到菌體甲醇部位，提取物置4℃冰箱，備用。

1.2.4 發(fā)酵產物抑菌活性檢測

濾紙片法測定各樣品抑菌活性，以G+性菌金黃色葡萄球菌、地衣芽孢桿菌和G－性菌大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯菌為指示菌，以上五種指示菌經37℃培養(yǎng)24h，活化后用無菌水洗滌制成菌懸液，調節(jié)菌體濃度至106CFU/mL，吸取1mL均勻涂布于事先倒好的牛肉膏蛋白胨平板上；取直徑為6mm的無菌濾紙片，在無菌條件下用鑷子放置于上述帶菌平板上，每皿3片，輕壓使其與培養(yǎng)基表面接觸，然后用微量移液器吸取備好的各測試樣品溶液（以甲醇稀釋至10mg/mL）15μL分別滴加于紙片上，以溶劑甲醇為陰性對照，以100U/mL的硫酸鏈霉素或青霉素鈉為陽性對照，每個樣品設三個平行。加樣后于37℃培養(yǎng)24h，十字交叉法測定各樣品抑菌圈的大小。

最小抑菌濃度（MIC）的測定：選擇對樣品溶解度好且無抑菌作用的甲醇作為溶媒，采用二倍稀釋法將樣品配制為2.5、1.25、0.625、0.313、0.156mg/mL系列濃度溶液，用濾紙片法測定抑菌圈直徑，以實驗組中出現(xiàn)抑菌圈的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

2 、結果與分析

從二色補血草植株中共分離到內生真菌32株，其中根部15株（46.87%）、莖部11（34.38%）、葉部6株（18.75%）。從分離部位可以看出，分離的菌株數(shù)量根部最多，其次為莖部和葉部。

2.1 二色補血草內生菌發(fā)酵產物抑菌活性測定結果

抑菌實驗結果表明，二色補血草內生真菌發(fā)酵產物對各指示菌均有有不同程度的抑制作用，其中對大腸桿菌有抑制作用的樣品占總數(shù)的80.8%，對金黃色葡萄球菌有抑制作用的占71.21%，對肺炎鏈球菌抑制作用的占87.27%，對地衣芽孢桿菌有抑制的占82.42%，對綠膿桿菌有抑制作用的占75.15%。其中有10株菌的不同部位對2種或多種指示菌有不同程度的抑制作用，占分離菌株總數(shù)的31.25%；4株菌分別對4種或多種指示菌具有明顯的抑制作用，占菌株總數(shù)的12.50%。根據(jù)抑菌活性篩選結果，對每組指示菌有最強的抑菌作用的菌株進行最小抑菌濃度的測定，結果見表1。3株菌的最小抑菌濃度達到0.156mg/mL，2株菌的最小抑菌濃度達到0.313mg/mL。從以上結果可以看出，二色補血草內生真菌具有較強的抑菌活性，對指示細菌的抑制范圍較寬，對抑菌作用具有一定的選擇性。

表1 二色補血草內生真菌發(fā)酵產物抑菌活性測定結果

3 、結論

抑菌試驗結果表明，二色補血草內生真菌抗菌活性菌株數(shù)占分離菌株數(shù)的85.26%，高活性菌株數(shù)占分離菌株數(shù)的12.50%，且內生菌發(fā)酵產物各提取物溶液濃度為10mg/mL時，菌株乙酸乙酯萃取部位的抑菌效果明顯高于甲醇部位及正丁醇部位。表明二色補血草內生菌發(fā)酵產物中存在著豐富的抗菌活性物質資源，這為二色補血草內生菌資源及發(fā)酵抑菌活性物質資源的開發(fā)利用奠定了基礎。

［1］ 許毅宏，張繼，哈飛，等.人工栽培二色補血草前景［J］.植物雜志，2004，1：12

［2］ 王永忠，肖亞中.植物內生菌及其代謝產物［J］.生物醫(yī)學雜志，2004，21（4）：1-5

［3］ 王瑤瑤，韓烈保，曾會明.禾本科植物內生菌研究進展［J］.生物技術通報，2008，（ 3）：34-37

［4］ 程麗娟，薛泉宏.微生物學實驗技術［M］.西安：世界圖書出版公司，2000：104 105.