張驚宇， 張力娜， 舒永偉， 鄭永慧， 初婷婷， 趙　虹， 楊子超

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，哈爾濱　150081

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·論著·

腦膠質(zhì)瘤組織β-連環(huán)蛋白、血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)與微血管密度及其相關(guān)性研究

張驚宇， 張力娜， 舒永偉， 鄭永慧， 初婷婷， 趙虹*， 楊子超

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，哈爾濱150081

目的： 探討腦膠質(zhì)瘤組織β-連環(huán)蛋白、血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)與微血管密度以及三者的相關(guān)性。方法： 50例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和40例健康對照標(biāo)本，其中腦膠質(zhì)瘤組包含低級別腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本29例和高級別腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本21例。采用免疫組織化學(xué)法檢測各組織標(biāo)本中β-連環(huán)蛋白的表達(dá)；采用Western印跡法檢測血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)水平；應(yīng)用抗CD105抗體檢測新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白CD105的表達(dá)水平，計算微血管密度。結(jié)果： 腦膠質(zhì)瘤組β-連環(huán)蛋白表達(dá)陽性率、血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平和微血管密度均較對照組明顯升高(P<0.05)。與低級別腦膠質(zhì)瘤組相比，高級別腦膠質(zhì)瘤組的β-連環(huán)蛋白表達(dá)陽性率、血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平和微血管密度均明顯升高(P<0.05)。β-連環(huán)蛋白表達(dá)陽性率、血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平、微血管密度三者間均呈正相關(guān)性(P<0.01)。結(jié)論： 腦膠質(zhì)瘤患者中β-連環(huán)蛋白表達(dá)陽性率、血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平及微血管密度均明顯升高，其中高級別腦膠質(zhì)瘤中升高更明顯。

腦膠質(zhì)瘤；β-連環(huán)蛋白；血管內(nèi)皮生長因子；微血管密度

腦膠質(zhì)瘤是臨床上備受關(guān)注的腦腫瘤之一，其發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤的45.0%以上。大多數(shù)腦膠質(zhì)瘤患者確診時，腫瘤已經(jīng)高度異質(zhì)性。腦膠質(zhì)瘤相對其他腫瘤預(yù)后更差，致死率更高[1-2]。腦膠質(zhì)瘤的侵襲和復(fù)發(fā)受多種基因、蛋白以及細(xì)胞因子等信號通路的共同調(diào)控[3]，但其發(fā)生機制目前仍未闡明。

β-連環(huán)蛋白的功能廣泛，其中最重要的功能之一是參與腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，因此目前成為人們研究惡性腫瘤發(fā)生機制的一個熱點[4]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌，是一類促進(jìn)血管生成的關(guān)鍵因子，能刺激腫瘤新生血管的形成，并參與介導(dǎo)肝癌、肺癌、腎癌和顱內(nèi)腫瘤等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[5]。因此，抑制腫瘤血管生成已成為治療顱內(nèi)惡性腫瘤(如腦膠質(zhì)瘤等)的新策略[6]。本研究通過檢測腦膠質(zhì)瘤組織中β-連環(huán)蛋白、VEGF的表達(dá)水平和微血管密度，探討其與腦膠質(zhì)瘤血管生成的相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本50例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本及40例健康對照標(biāo)本購自上海銳賽生物技術(shù)有限公司。根據(jù)WHO腦膠質(zhì)瘤分類和分級標(biāo)準(zhǔn)[7]，50例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，Ⅰ級17例、Ⅱ級12例、Ⅲ級13例、Ⅳ級8例。Ⅰ級和Ⅱ級為低級別腦膠質(zhì)瘤，共29例；Ⅲ級和Ⅳ級為高級別腦膠質(zhì)瘤，共21例。

1.2免疫組織化學(xué)法檢測β-連環(huán)蛋白表達(dá)陽性率羊抗人β-連環(huán)蛋白單克隆抗體、S-P試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm切片，然后應(yīng)用免疫組織化學(xué)S-P法檢測β-連環(huán)蛋白的表達(dá)(具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行)。以試劑公司提供的陽性切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)作為陰性對照。光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色、棕褐色顆?；蚓|(zhì)染色時，判定為β-連環(huán)蛋白陽性表達(dá)。400倍顯微鏡下觀察，每張切片觀察10個視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，取平均值。結(jié)果判定：根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)進(jìn)行分級，<5%為陰性(-)，5%～25%為弱陽性(+)，26%～50%為中度陽性()，>50%為強陽性()。1.3Western印跡法檢測VEGF表達(dá)水平裂解新鮮膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織后，提取總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。每例樣本各取15 μg蛋白，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，再分別加入VEGF一抗(1∶500)和β-actin一抗(1∶200；兩種一抗均由美國Santa Cruz公司提供)，4℃反應(yīng)過夜；PBS洗滌后，加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗VEGF一抗和抗β-actin一抗抗體(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；ECL法染色后，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)顯像。采用Image J軟件進(jìn)行目的蛋白的定量分析。

1.4檢測腫瘤微血管密度以CD105蛋白作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，用抗CD105抗體檢測新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的CD105表達(dá)水平。CD105蛋白染色可呈棕色或棕黃色，以10%細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色者判定為表達(dá)陽性。參照Eichten等[8]報道的方法計數(shù)微血管，將與相鄰微血管、腫瘤細(xì)胞或其他結(jié)締組織不相連的任何棕黃色區(qū)域作為一條獨立的微血管。先在100倍光學(xué)顯微鏡下全面觀察切片，確定腫瘤組織內(nèi)血管密度最高的區(qū)域；再在200倍鏡下，將與周圍腫瘤細(xì)胞和結(jié)締組織明顯區(qū)別的棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞叢作為一個血管，若不相連，分支結(jié)構(gòu)即可作為一個血管。分別記錄5個視野內(nèi)的微血管數(shù)，取平均數(shù)作為微血管密度值。

2　結(jié)　果

2.1腦膠質(zhì)瘤組與健康對照組的β-連環(huán)蛋白表達(dá)陽性率、VEGF表達(dá)水平、微血管密度的比較腦膠質(zhì)瘤組的β-連環(huán)蛋白表達(dá)陽性率、VEGF表達(dá)水平和微血管密度均較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.2高級別腦膠質(zhì)瘤組與低級別腦膠質(zhì)瘤組的β-連環(huán)蛋白表達(dá)陽性率、VEGF表達(dá)水平、微血管密度比較高級別腦膠質(zhì)瘤組的β-連環(huán)蛋白表達(dá)陽性率、VEGF表達(dá)水平和微血管密度均較低級別腦膠質(zhì)瘤組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。2.3β-連環(huán)蛋白表達(dá)陽性率、VEGF表達(dá)水平、微血管密度的相關(guān)性研究β-連環(huán)蛋白表達(dá)陽性率與VEGF因子表達(dá)水平顯著正相關(guān)(rs=0.833,P<0.01)；β-連環(huán)蛋白表達(dá)陽性率與微血管密度呈顯著正相關(guān)(rs=0.786,P<0.01)；血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平和微血管密度呈顯著正相關(guān)(rs=0.770,P<0.01)。

表1　腦膠質(zhì)瘤組與對照組β-連環(huán)蛋白表達(dá)陽性率、血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平、微血管密度比較

表2　高級別腦膠質(zhì)瘤組與低級別腦膠質(zhì)瘤組β-連環(huán)蛋白表達(dá)陽性率、血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平、微血管密度比較

3　討　論

腦膠質(zhì)瘤源自神經(jīng)上皮層，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的預(yù)后較差的原發(fā)性腫瘤。腦膠質(zhì)瘤的年發(fā)病率約為5/10萬，發(fā)病年齡高峰30～40歲[9]。腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生是一個涉及多基因的多步驟、多階段的復(fù)雜過程。

細(xì)胞內(nèi)的許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。細(xì)胞外分子信號結(jié)合細(xì)胞表面的特異性受體，并將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，再通過細(xì)胞內(nèi)各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相互作用，將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核，最終活化相應(yīng)的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)相應(yīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)，使該細(xì)胞完成轉(zhuǎn)分化[10]。多項研究表明，Wnt信號通路為重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與調(diào)控細(xì)胞多種生命過程，如細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖與凋亡、細(xì)胞免疫與應(yīng)激，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生等[11]。在腦膠質(zhì)瘤中，Wnt信號通路尤其是Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[12]。

研究[13]表明，Wnt信號通路嚴(yán)重影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育(尤其是胚胎階段)；Wnt信號通路還參與細(xì)胞的成熟(包括細(xì)胞增殖、分化，以及細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和定位過程)。Wnt信號通路的特異性在于其發(fā)揮作用的時間僅局限于胚胎期，在嬰幼兒時期作用減弱，隨著機體的成熟，Wnt信號通路的作用逐漸消失。但在特殊的生理病理刺激信號作用下，Wnt信號被激活，其中以腦組織缺血的刺激作用最為明顯。β-連環(huán)蛋白是Wnt信號通路的關(guān)鍵蛋白。抑制β-連環(huán)蛋白的去磷酸化、抑制β-連環(huán)蛋白向核內(nèi)轉(zhuǎn)移、在β-連環(huán)蛋白水平抑制Wnt信號通路的激活是目前人們廣泛關(guān)注的靶向治療方案。抑制Wnt信號通路是腦膠質(zhì)瘤等腫瘤的基因治療策略之一。本研究結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤組β-連環(huán)蛋白陽性表達(dá)率較對照組升高，高級別腦膠質(zhì)瘤組的β-連環(huán)蛋白陽性表達(dá)率較低級別腦膠質(zhì)瘤升高，說明β-連環(huán)蛋白表達(dá)增加與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。

腫瘤血管生成是一個復(fù)雜的病理生理過程。充足的血供才能支持腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。VEGF是促進(jìn)腫瘤血管生成的關(guān)鍵刺激因子，幾乎參與腫瘤血管生成的每個環(huán)節(jié)[14]。VEGF可以通過旁分泌等方式，加快血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，重構(gòu)血管，促進(jìn)新生血管的形成。VEGF可能通過促進(jìn)原有血管網(wǎng)的擴(kuò)張和過度生長，以及刺激血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化，從而促進(jìn)新生血管形成。微血管密度可用來判定腫瘤血管的生成情況[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤組的VEGF表達(dá)水平及微血管密度較對照組升高(P<0.05)，高級別腦膠質(zhì)瘤組的VEGF表達(dá)水平及微血管密度較低級別腦膠質(zhì)瘤顯著升高(P<0.05)，說明VEGF參與腫瘤血管的形成，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞過度增殖。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，β-連環(huán)蛋白表達(dá)陽性率、VEGF表達(dá)水平、微血管密度三者之間均呈正相關(guān)性，提示W(wǎng)nt信號通路與腦膠質(zhì)瘤的血管生成明顯相關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤中β-連環(huán)蛋白表達(dá)、VEGF表達(dá)及微血管密度均顯著增加，在高級別腦膠質(zhì)瘤中增加更明顯，提示β-連環(huán)蛋白表達(dá)陽性可反映腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展。但本研究入組例數(shù)較少，且為單中心研究，故結(jié)論尚須多中心、大樣本的研究來進(jìn)一步證實。

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[本文編輯]葉婷， 張藝鳴

The β-catenin and vascular endothelial growth factor expressions and microvessel density in glioma and their correlations

ZHANG Jing-yu, ZHANG Li-na, SHU Yong-wei, ZHENG Yong-hui, CHU Ting-ting, ZHAO Hong*, YANG Zi-chao

Department of Neurology, Fourth Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150081, Heilongjiang, China

Objective： To investigate the expressions of β-catenin, vascular endothelial growth factor (VEGF), and microvessel density in glioma and their correlations. Methods： 50 glioma specimens and 40 health control specimens were collected. The gliomas were divided into low grade gliomas (n=29) and high grade gliomas (n=21).The expression of β-catenin in all specimens was detected by immunohistochemistry . The level of VEGF was detected by Western blotting. The expression of CD105(a surface marker of neovascular endothelial cell) was examined by anti-CD105 antibody, and the microvessel density was calculated. Results： The positive expression rate of β-catenin, the level of VEGF and microvessel density in glioma group were significantly higher than that in control group (P<0.05). Compared with the low grade gliomas, the three indexes were obviously higher in high grade gliomas (P<0.05). There was a positive correlations between the positive expression rate of β-catenin, the level of VEGF, and microvessel density (P<0.05). Conclusions： The positive expression rate of β-catenin, the level of VEGF, and microvessel density in glioma patients increase obviously, and those are more significant in the patients with high-grade glioma.

glioma; β-catenin; vascular endothelial growth factor; microvessel density

2016-03-02[接受日期]2016-05-15

黑龍江省自然科學(xué)基金面上項目(H201423),哈爾濱市科技局青年后備人才項目(2013RFQYJ062).Supported by General Program of National Natural Science Foundation of Heilongjiang Province (H201423) and Youth Talent Program of Harbin Municipal Science and Technology Bureau (2013RFQYJ062).

張驚宇,博士,主任醫(yī)師. E-mail: zhangjingyuyx@163.com

Corresponding author). Tel: 0451-85939431, E-mail: zhaohong661214@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160198

R 739.41

A