劉海寧， 朱新宇， 吳　昊， 陳玉琢， 英和娜拉， 劉韜韜

復旦大學附屬中山醫(yī)院消化內科，上?！?00032

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·論著·

胃癌患者血清miRNA-223的表達水平及其診斷價值

劉海寧△， 朱新宇△， 吳昊， 陳玉琢， 英和娜拉， 劉韜韜*

復旦大學附屬中山醫(yī)院消化內科，上海200032

目的： 探討胃癌患者血清中miRNA-223的表達水平及其診斷價值。方法： 采用實時定量PCR法檢測50例胃癌患者和50名健康對照者血清miRNA-223的表達量，分析miRNA-223與胃癌臨床病理參數(shù)的關系。構建受試者工作特征(ROC)曲線，比較miRNA-223與癌胚抗原(CEA)的診斷效能。結果： 胃癌患者血清miRNA-223水平高于健康對照組(P<0.05)。ROC曲線顯示，miRNA-223診斷胃癌的曲線下面積(AUC)達0.636(95%CI 0.526～0.746)，靈敏度、特異度分別為48%、82%；miRNA-223聯(lián)合CEA診斷胃癌的AUC達0.769(95%CI 0.675～0.862)，靈敏度、特異度分別為70%、78%。結論： miRNA-223聯(lián)合CEA有助于胃癌的診斷。

胃癌；miRNA-223；診斷價值

胃癌是全球范圍內發(fā)病率占第4位的惡性腫瘤，在東亞地區(qū)的發(fā)病率遠高于其他地區(qū)[1]。多數(shù)胃癌患者在明確診斷時已為晚期，預后較差。因此，尋找胃癌的早期診斷標志物對于提高其早期診斷率與降低病死率顯得尤為重要。微小RNA(microRNA)是一類非編碼的單鏈RNA，包含20～24個核苷酸，可精細調控基因的表達。血液中多種microRNA可以作為胃癌的早期診斷標志物。miRNA-223在多種惡性腫瘤中表達增加。本研究通過檢測胃癌患者及健康對照血清中miRNA-223的表達量，評價其對胃癌的診斷效能。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2015年7月—9月在復旦大學附屬中山醫(yī)院就診的胃癌患者。所有病例均經病理證實，且均無手術或放化療史。50例患者中，男性33例，女性17例；年齡(64.5±10.0)歲。診斷依據(jù)胃鏡或手術后病理活檢結果。TNM分期依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟第7版標準，Ⅰ期13例，Ⅱ期13例，Ⅲ期18例，Ⅳ期6例。病理分期以病變僅侵及黏膜及黏膜下層為早期胃癌[2]，相當于T1N0M0期。本研究中，早期胃癌12例，進展期胃癌38例。另選擇2015年4月在復旦大學附屬中山醫(yī)院體檢中心體檢的50名健康志愿者作為對照，其中，男性29例，女性21例；年齡(34.8±7.2)歲；排除腫瘤性疾病。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核，所有患者及健康志愿者均知情同意并填寫知情同意書。

1.2方法

1.2.1血清收集及DNA提取清晨，空腹條件下，用SST血清分離膠管(BD公司，美國)抽取外周靜脈血約3 mL，血清析出后以1 000 ×g離心，吸取上層血清保存至-80℃冰箱。秀麗隱桿線蟲miRNA-39(cel-miRNA-39)作為外參，加入100 mL血清中。用miRNA提取分離試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取血清中總RNA。

1.2.2miR-223定量檢測用cDNA第一鏈合成試劑盒和miRNA熒光定量檢測試劑盒進行反轉錄及實時定量PCR檢測[試劑盒及引物均購自天根生化科技(北京)有限公司]。miR-223序列為5′-UGUC AGUUUGUCAAAUACCCCA-3′。實時定量PCR儀購自Applied Biosystems公司(7500型，美國)。1.2.3Ct值的處理PCR反應結束后，融解曲線顯示引物特異性良好。以Applied Biosystems 7500型實時定量PCR儀默認的閾值為標準，可得到目的基因在該樣本中擴增的Ct值。所有樣品均設3個副孔，取平均Ct值。相對表達量以cel-miR-39為外參，以log10(2-ΔCt)方法計算miRNA-223的相對表達量[3]。1.2.4血清癌胚抗原(CEA)檢測全自動化學發(fā)光免疫分析儀測定血清標本的CEA濃度。CEA<50 ng/L為正常。

1.3統(tǒng)計學處理采用Stata 12.0及SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。胃癌組與健康對照組的miRNA-223表達量采用成組兩樣本t檢驗，CEA濃度采用成組兩樣本Wilcoxon秩和檢驗。胃癌患者miRNA-223表達量與性別的關系采用成組兩樣本Wilcoxon秩和檢驗，與有無淋巴結轉移、TNM分期、病理分期的關系采用成組兩樣本t檢驗，與年齡、腫瘤直徑的關系采用Pearson線性相關分析。用受試者工作特征(ROC)曲線及其曲線下面積(AUC)評估m(xù)iRNA-223及CEA的診斷效能。所有檢驗均為雙側檢驗。檢驗水準(α)為0.05。

2　結　果

2.1兩組血清miRNA-223表達水平及CEA濃度的比較胃癌組患者血清miRNA-223的表達量為3.64±0.62，健康對照組為3.35±0.54，兩組差異有統(tǒng)計學意義(t=-2.518，P=0.013)。胃癌組血清CEA中位濃度為2.2 ng/L，健康對照組中位濃度為1.2 ng/L，兩組差異有統(tǒng)計學意義(Z=-4.264，P<0.001)。兩組miRNA-223的表達水平見圖1。

圖1　胃癌組及健康對照組血清miRNA-223表達水平

2.2胃癌患者血清miRNA-223表達水平與臨床病理參數(shù)的相關性胃癌患者血清miRNA-223表達水平與性別、年齡、腫瘤大小、有無淋巴結轉移、TNM分期、病理分期無關(表1)。胃癌患者不同TNM分期的血清miRNA-223表達水平見圖2。

表1　胃癌患者miRNA-223的相對表達量與

圖2　胃癌患者不同TNM分期血清miRNA-223的表達水平

2.3血清miRNA-223的診斷價值ROC分析(圖3)顯示：miRNA-223診斷胃癌的AUC為0.636(95%CI 0.526～0.746)；當臨界閾值為3.71時，約登指數(shù)最高，診斷胃癌的靈敏度為48%、特異度為82%、陽性預測值為72.7%、陰性預測值為61.2%。以CEA<50 ng/L作為正常參考值，CEA診斷胃癌的靈敏度為16%，特異度為100%。miRNA-223聯(lián)合CEA診斷胃癌的AUC達0.769(95%CI 0.675～0.862)。聯(lián)合診斷的計算式為：0.719×miRNA-223+0.874×CEA。當臨界閾值為4.16時，約登指數(shù)最高，兩者聯(lián)合診斷胃癌的靈敏度為70%、特異度為78%、陽性預測值為76.1%、陰性預測值為72.2%。

圖3　miRNA-223和(或)CEA診斷胃癌的ROC曲線

3　討　論

miRNA-223在多種惡性腫瘤患者血清中表達量升高，如胃癌[4]、結直腸癌[5]、肺癌[6]。研究[7]表明，腫瘤相關細胞(如樹突狀細胞、巨噬細胞、T細胞)可通過釋放含miRNA-223的外泌體來調控腫瘤細胞的增殖與侵襲。Zhou等[8]的研究表明，miRNA-223可通過F框/WD-40域蛋白7( FBXW7)調控胃癌細胞周期，促進其對順鉑的耐藥。

本研究進一步表明，胃癌患者的血清miRNA-223表達水平較健康人顯著升高，為健康人的1.95倍。miRNA-223表達水平與性別、年齡、腫瘤大小、有無淋巴結轉移、TNM分期、病理分期無關，提示該指標作為分期、化療后或術后療效預測、預后標志物有局限性。miRNA-223作為診斷標志物的曲線下面積為0.636，診斷效能最高時靈敏度為48%，特異度為82%。需要指出，本研究胃癌組與健康對照組年齡有顯著差異(P<0.001)，但Zhou等[8]的研究與本研究均認為，血清miRNA-223表達水平與年齡無關。

CEA是傳統(tǒng)的胃癌診斷標志物，但其在多種消化系統(tǒng)惡性腫瘤、肺癌中均可能升高，因此診斷特異度不高，且易受到吸煙、感染等影響。本研究以<50 ng/L作為CEA的正常參考值，CEA的靈敏度僅為16%，特異度為100%。CEA的特異度與既往研究不符，原因可能在于：由于其他癌癥人群比例較健康人群過低而未納入對照組，且<50 ng/L為95%健康人群的取值范圍，而本研究僅納入50例健康人為對照。聯(lián)合miRNA-223與CEA可使診斷的ROC曲線下面積上升至0.769，診斷效能最高時靈敏度為70%、特異度為78%。因此，miRNA-223聯(lián)合CEA可用于胃癌的診斷，并優(yōu)于單獨應用miRNA-223或CEA。

然而，miRNA-223及CEA水平在多種惡性腫瘤中升高，使其診斷胃癌的特異度降低，因此需先通過影像學檢查進行定位診斷。

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[本文編輯]姬靜芳

Diagnostic value and expression of serum miRNA-223 in patients with gastric cancer

LIU Hai-ning△, ZHU Xin-yu△, WU Hao, CHEN Yu-zhuo, Enkhnaran Bilegsaikhan, LIU Tao-tao*

Department of Gastroenterology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Objective： To discuss the expression and diagnostic value of miRNA-223 in patients with gastric cancer. Methods： The expression of serum miRNA-223 was detected in 50 patients with gastric cancer and 50 healthy controls by using real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). The relationship of miRNA-223 and clinicpathological parameter of gastric cancer was analyzed. The receiver operating curve (ROC) was constructed and the diagnostic value of miRNA-223 and carcinoembryonic antigen (CEA) was compared. Results： The serum miRNA-223 in patients with gastric cancer was significantly higher than control group. The ROC indicated that area under the ROC curve (AUC) of miRNA-223 was 0.636 (95%CI 0.526-0.746) with sensitivity of 48% and specificity of 82% whileAUCof combination of miRNA-223 and CEA was 0.769 (95%CI 0.675-0.862) with sensitivity of 70% and specificity of 78%. Conclusions： Combining miRNA-223 and CEA can be used to diagnosis gastric cancer.

gastric cancer；miRNA-223；diagnostic value

2016-05-29[接受日期]2016-08-01

劉海寧,博士生.E-mail: lhn0116@126.com;朱新宇, 主管護師. E-mail: zhu.xinyu@zs-hospital.sh.cn

Corresponding author). Tel: 021-64041990-2070, E-mail: liu.taotao@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160638

R 735.2

A

△共同第一作者(Co-first authors).