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        不同劑量MPTP所致帕金森病小鼠模型焦慮行為的評價

        2016-10-07 02:40:52葉素貞施劍夏譽(yù)張書平黃漢津
        關(guān)鍵詞:暗箱高架迷宮

        葉素貞,施劍,夏譽(yù),張書平,黃漢津

        (1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科,浙江 溫州 325015;2.綿陽市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,四川 綿陽 621000;3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)科,浙江 溫州 325015;4.樂清市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,浙江 溫州 325600;5.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,浙江 溫州 325027)

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        不同劑量MPTP所致帕金森病小鼠模型焦慮行為的評價

        葉素貞1,施劍2,夏譽(yù)3,張書平4,黃漢津5

        (1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科,浙江 溫州 325015;2.綿陽市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,四川 綿陽 621000;3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)科,浙江 溫州 325015;4.樂清市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,浙江 溫州 325600;5.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,浙江 溫州 325027)

        目的:研究不同劑量1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)所致急性帕金森病(PD)小鼠模型的焦慮行為。方法:選取40只C57BL/6J小鼠,隨機(jī)分為對照組、小劑量組、中劑量組和大劑量組,每組10只。用高架十字迷宮和明暗箱檢測小鼠的焦慮行為。結(jié)果:各模型組小鼠在暗箱停留的時間較對照組均有增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但各模型組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),各模型組間小鼠的穿箱次數(shù)差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);高架十字迷宮中各模型組小鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)(OE)、開放臂停留時間(OT)及開放臂停留時間百分比(OT%)與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),但各模型組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與對照組比,小劑量組和中劑量組小鼠OT%顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:MPTP所致急性PD小鼠模型早期即會出現(xiàn)焦慮行為,但焦慮的嚴(yán)重程度與造模MPTP劑量無關(guān)。

        1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶;小鼠;焦慮;帕金森病

        帕金森?。≒arkinson’s disease,PD),又名震顫麻痹(paralysis agitans),是一種常見的中老年神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,臨床以靜止性震顫、運(yùn)動遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢步態(tài)異常為特征。然而,有文獻(xiàn)報道除運(yùn)動障礙外,約60%~80%的患者合并程度不同的精神障礙如抑郁、焦慮、睡眠障礙、癡呆及藥物性精神障礙,對患者生活質(zhì)量的影響往往比運(yùn)動障礙更嚴(yán)重[1-2]。國內(nèi)研究[3]發(fā)現(xiàn),焦慮是PD患者常見的非運(yùn)動癥狀(non-motor symptoms,NMS)之一,焦慮發(fā)生率為33.87%,而且PD并發(fā)焦慮患者的NMS發(fā)生率也高,嚴(yán)重影響PD患者的日常生活活動能力,降低生活質(zhì)量。當(dāng)前對PD合并焦慮的研究多集中在

        對PD患者的臨床觀察[3-5],在動物模型上得出的實驗觀察較為有限。本實驗的目的在于觀察用不同劑量1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)急性造模PD小鼠的焦慮行為。

        1 材料和方法

        1.1材料

        1.1.1動物:雄性C57BL/6J小鼠40只,8周齡,體質(zhì)量20~25 g,購自上海斯來克實驗動物有限責(zé)任公司。清潔級飼養(yǎng),晝夜節(jié)律12/12 h,動物可以自由獲取食物和飲水。

        1.1.2分組和模型制備:小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,40只C57BL/6小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組,每組10只。小劑量組(MPTP 20 mg/kg×1次,0.9%氯化鈉溶液20 mg/kg×7次)、中劑量組(MPTP 20 mg/kg×4次,0.9%氯化鈉溶液20 mg/kg×4次)、大劑量組(MPTP 20 mg/kg×8次)連續(xù)腹腔注射2 d,對照組0.9%氯化鈉溶液20 mg/kg×8次,每次注射時間間隔2 h,每天4次,連續(xù)腹腔注射2 d。

        1.2方法

        1.2.1明暗箱實驗:于造模后第3天進(jìn)行?;贑rawley等[6]的實驗設(shè)計,明暗箱的長寬高分別為44 cm×21 cm×21 cm,分為明箱和暗箱,明箱占2/3,暗箱占1/3,明暗箱之間有一通道可供小鼠通過。明箱上方有白熾燈照亮。實驗室內(nèi)保持安靜,實驗前動物在房間內(nèi)先適應(yīng)1 h。操作者將小鼠放入明箱正中,記錄小鼠在箱內(nèi)5 min的行為活動,用計時器記下小鼠停留在暗箱的時間,計數(shù)器記錄明暗箱間的穿梭次數(shù)。

        1.2.2高架十字迷宮:于造模后第4天進(jìn)行?;贚ister[7]的實驗設(shè)計,小鼠面對開放臂放至迷宮中心的公共區(qū),用視頻攝像系統(tǒng)記錄小鼠5 min運(yùn)動軌跡指標(biāo):①進(jìn)入開放臂次數(shù)(open arm entry,OE):進(jìn)入到任一開放臂的次數(shù),以小鼠4個爪子均進(jìn)入到臂內(nèi)為準(zhǔn),中途一個爪子從該臂中完全退出則為該次進(jìn)入活動完成;②開放臂停留時間(open arm time,OT);③進(jìn)入封閉臂次數(shù)(close arm entry,CE):進(jìn)入任一封閉臂的次數(shù),以小鼠4個爪子均進(jìn)入到臂內(nèi)為準(zhǔn);④封閉臂停留時間(close arm time,CT)。

        1.3統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以表示,對4組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較方差齊者采用LSD檢驗,方差不齊者采用Dunnett’T3檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1明暗箱測試結(jié)果 在明暗箱測試中,4組小鼠的穿箱次數(shù)不同(F=3.084,P<0.05),但各造模組與對照組,以及各造模組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。4組小鼠在暗箱停留的時間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.253,P<0.05),各劑量造模組小鼠暗箱停留時間與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但各劑量組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

        表1 明暗箱的穿箱次數(shù)和在暗箱停留的時間(n=10,±s)

        表1 明暗箱的穿箱次數(shù)和在暗箱停留的時間(n=10,±s)

        與對照組比:aP<0.05

        組別 穿梭次數(shù)(次) 暗箱停留時間(s)對照組 8.8±1.8 142.5±18.6小劑量組 7.1±1.7 167.1±24.0a中劑量組 8.6±1.9 164.0±15.0a大劑量組 7.9±1.9 170.8±28.9a

        2.2高架十字迷宮實驗結(jié)果 在高架十字迷宮測試中,4組小鼠OE、OT、OE%、OT%的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);其中OE、OT、OT%,小劑量組、中劑量組、大劑量組與對照組比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但大劑量組和中劑量組、中劑量和小劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);OE%小劑量組和中劑量組與對照組比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05),但大劑量組與對照組間、大劑量組和中劑量組、中劑量和小劑量組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。

        表2 小鼠在高架十字迷宮中的行為學(xué)結(jié)果(n=10,±s)

        表2 小鼠在高架十字迷宮中的行為學(xué)結(jié)果(n=10,±s)

        與對照組比:aP<0.01

        組別 OE(次) OT(s) OE% OT%對照組 3.9±0.6a 34.9±11.9a 23.1±4.0a12.9±4.9a小劑量組 2.0±0.8a 15.3± 9.3a 14.4±5.0a5.4±3.4a中劑量組 2.3±1.0a 14.5± 9.5a 15.1±5.6a7.9±3.4a大劑量組 2.9±1.1a 21.7± 9.8a 19.6±5.8 7.8±4.8a

        3 討論

        研究[8]發(fā)現(xiàn),PD患者合并情感障礙,其中70%患者伴發(fā)抑郁,69%患者存在焦慮。MPTP是一種常用的PD造模藥物,C57BL/6小鼠是目前已知對MPTP最敏感的動物,MPTP小鼠模型能很好的復(fù)制PD的神經(jīng)病理和神經(jīng)生化改變。MPTP本身不具有毒性作用,毒性為其活性代謝產(chǎn)物MPP+,它能選擇性地?fù)p害黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)的多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元,進(jìn)而導(dǎo)致DA的丟失,出現(xiàn)選擇性的運(yùn)動癥狀[9]。嚙齒類動物的焦慮行為主要表現(xiàn)為探索本性和外界環(huán)境的矛盾沖突,其核心癥狀是擔(dān)憂,直接的表現(xiàn)就是對不熟悉環(huán)境的躲避。

        高架十字迷宮和明暗箱是目前比較公認(rèn)的評價小鼠焦慮行為的方法[10]。明暗箱是評價嚙齒類動物焦慮行為的經(jīng)典方法,水平運(yùn)動反映動物的一般活動習(xí)性,垂直運(yùn)動反映動物對新鮮環(huán)境的探索活性,抗焦慮藥物會增加動物在明箱的行為活動時間,而致焦慮劑明顯減少明箱的停留時間,穿梭次數(shù)反映運(yùn)動和探索活動,明箱停留時間反映抗焦慮狀態(tài);高架十字迷宮的OE%和OT%反映動物的焦慮狀態(tài)[11-12]。

        本實驗發(fā)現(xiàn)明暗箱中各模型組小鼠在暗箱停留時間增加,明箱的停留時間縮短;而高架十字迷宮中結(jié)果發(fā)現(xiàn)各模型組小鼠OE、OT、OE%、OT%均有減少,這表明模型組小鼠出現(xiàn)明顯焦慮癥狀。Levitskaya等[13]發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔注射神經(jīng)毒素MPTP(20 mg/kg)1次后便會增加動物的焦慮行為。Ho等[14]發(fā)現(xiàn)MPTP造模小鼠在注射后第1天即在高架十字迷宮實驗中表現(xiàn)出焦慮行為。一項類似研究提示,基因敲除的PD小鼠在明暗箱實驗中表現(xiàn)出明顯焦慮行為[15]。張如意等[16]研究發(fā)現(xiàn)MPTP所致急性PD小鼠1 d及3 d后都出現(xiàn)不同程度爬桿時間延長,自發(fā)活動次數(shù)減少。研究[17-18]發(fā)現(xiàn),MPTP所致PD模型C57BL/6J小鼠,在注射MPTP第1天后自主活動明顯下降,但是注射后第2天基本恢復(fù)。本研究行為學(xué)評價分別在造模后第3、第4天進(jìn)行,可相對減少M(fèi)PTP所致C57BL/6J小鼠PD模型的運(yùn)動障礙干擾。不同的研究對PD動物模型的自主活動或是運(yùn)動障礙結(jié)果存在差異,這些行為學(xué)的差異與給藥劑量、途徑、時間以及動物品系來源不同有關(guān)[19]。本實驗發(fā)現(xiàn)無論是明暗箱停留時間還是高架十字迷宮中的結(jié)果,各模型組之間的結(jié)果無明顯差異,提示造模所用MPTP劑量大小與小鼠焦慮程度無關(guān),這說明急性PD小鼠的焦慮癥狀并非只由MPTP劑量決定。然而,本實驗缺少不同病程,如慢性模型的對照組別,因此不能確定MPTP所致PD模型的急性、亞急性與慢性模型間的焦慮障礙的區(qū)別。

        在人體和焦慮動物模型中,紋狀體DA受體的結(jié)合能力降低,焦慮障礙患者多巴胺攝取減少。此外,去甲腎上腺素、五羥色胺等也發(fā)揮重要作用,這些都提示焦慮與PD發(fā)病相關(guān)[20]。研究表明,五羥色胺在焦慮中發(fā)揮重要作用,而PD患者的五羥色胺系統(tǒng)異常。而且,中腦皮質(zhì)邊緣葉DA路徑受累,DA含量減少可以加重情感障礙[3],更重要的是,與非焦慮組相比,焦慮組“開關(guān)”現(xiàn)象發(fā)生率更高,這與腦內(nèi)DA水平的變化相關(guān)??梢奝D和焦慮在發(fā)病機(jī)制上存在一定相關(guān)性。

        本實驗成功制作PD模型,且明確提示動物模型存在明顯焦慮癥狀,目前越來越多的流行病學(xué)和臨床研究發(fā)現(xiàn)在經(jīng)典的運(yùn)動癥狀出現(xiàn)之前,已經(jīng)出現(xiàn)了其他的NMS,如情感障礙和認(rèn)知功能損害[21],但動物模型不能完全模擬人體的各種生理病理機(jī)能,且焦慮與PD之間關(guān)系可能互為因果,不同劑量MPTP所致PD小鼠是否在亞急性期及慢性期會出現(xiàn)不同程度的焦慮癥狀不能確定,有待進(jìn)一步研究。

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        (本文編輯:趙翠翠,丁敏嬌)

        Evaluation the anxiety behavior in different dosage of MPTP-induced Parkinson's mice

        YE Suzhen1,SHI Jian2,XIA Yu3,ZHANG Shuping4,HUANG Hanjin5. 1.Department of Rehabilitation Medicine,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 2.Department of Neurology,Mianyang Central Hospital,Mianyang,621000; 3.Department of Emergency Medicine,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 4.Department of Neurology,Yueqing People's Hospital,Wenzhou,325600;5.Department of Neurology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

        Objective: To study the anxiety behavior in different dosage of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) -induced Parkinson's mice. Methods: Forty C57BL/6J were randomly divided into 4 groups: Low-dose group (LG),moderate-dose group (DG),high-dose group (HG) and control group (CG). The anxiety behavior in mice was tested with the elevated plus-maze test and the light/dark box. Results: The time of stayed in the dark box of model groups mice were longer than those of the control group (P<0.05),but the time and transition among model groups mice had no difference (P>0.05). The OE,OT and OT% in mode groups mic were signifcant lower than that in the control group (P<0.05) in the elevated plus-maze test,but there was no signifcant difference among the three model groups (P>0.05). The OE% in LG and DG was lower than that in control group (P<0.05) in the elevated plus-maze test. Conclusion: Anxious behavior appears in the model groups of early PD mice. But there is no difference among those model groups. The anxiety behavior is not dose-dependent.

        1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP); mice; anxiety; Parkinson's disease

        R749.2

        A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.08.009

        2015-12-08

        葉素貞(1984-),女,浙江溫州人,住院醫(yī)師,碩士。

        黃漢津,主任醫(yī)師,教授,碩士生導(dǎo)師,Email:hhj@ wzmc.edu.cn。

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