于俊勇，孫 龍，吳志誠（譯）

（廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場，廣西 橫縣 530317）

國際瞭望

通過攻毒模型對比免疫反應(yīng)、斷奶前死亡率來評估PEDV疫苗在陰性和感染過PEDV母豬群的免疫效果

于俊勇，孫 龍，吳志誠（譯）

（廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場，廣西 橫縣 530317）

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）屬于冠狀病毒，在美國于2013年4月首次發(fā)現(xiàn)。造成豬群100%的發(fā)病率、哺乳仔豬50%～100%的死亡率。已證實，豬流行性腹瀉?。≒ED）是一個很難處理及控制的疾病，沒有一個單一的干預(yù)措施能100%成功。通過仔豬的攻毒試驗發(fā)現(xiàn)，來自免疫母豬的初乳能提高仔豬的成活率。已有其他的研究報道指出，像PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）這樣的冠狀病毒能通過母乳激發(fā)較強(qiáng)的IgA反應(yīng)。用PEDV陽性仔豬的糞便返飼能刺激母豬產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)和初乳；然而，這種方式可能致使致病病毒持續(xù)存在豬群持續(xù)暴發(fā)腹瀉，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，母豬免疫應(yīng)答變異的不確定性。因此需要一個有效的疫苗，能產(chǎn)生有效的保護(hù)性抗體、能與野毒區(qū)分開來，安全不會產(chǎn)生或延長疾病暴發(fā)的威脅。

美國首次暴發(fā)PED時，PEDV疫苗已經(jīng)在亞洲國家使用，但美國沒有該種疫苗使用。碩騰公司獲得了滅活苗的生產(chǎn)許可證，滅活苗免疫能增加2.5倍血清抗體滴度，能減少90%的斷奶前死亡率（與不處理組對比）。碩騰公司的試驗證實，與對照組相比，PEDV疫苗免疫的母豬能多斷奶20.1%的仔豬。

迄今為止在攻毒模型試驗下關(guān)于PEDV疫苗的研究報告較少，但是，PEDV攻毒的試驗，已經(jīng)表明免疫PEDV疫苗能增加母豬血清和初乳中的抗體滴度，增加初乳的免疫力，減少斷奶前死亡率。因此，繼續(xù)的研究需要進(jìn)一步評估這些疫苗的有效性和它們在未來的可能作用。本研究的主要目的是評估在感染過PEDV母豬和陰性母豬進(jìn)行PEDV滅活疫苗免疫或不免疫對仔豬和母豬的影響。

1　材料和方法

32頭妊娠母豬（分娩前6周），其中16頭是感染過PEDV的（試驗前9個月PCR檢測肛拭子PEDV陰性）；另外16頭母豬未接觸過PEDV。所有母豬通過PCR檢測都是PRRSV、PEDV陰性。將陰性和感染過PEDV的母豬分為2組，每組2個處理，疫苗免疫組、疫苗不免疫組。感染過PEDV的母豬分組時將確保血清中PEDV中和抗體滴度高的與低的均勻分配，陰性母豬組將隨機(jī)分組（見表1）。

表1　試驗處理及分組

所有的母豬在妊娠舍單獨飼養(yǎng)適應(yīng)1周，飼料配方滿足需求，自由飲水。1周后（分娩前5周），疫苗免疫組肌肉注射疫苗，分娩前第2周進(jìn)行第2次注射。對照組在同樣的時間注射生理鹽水。所有的母豬4 d內(nèi)自然分娩，分娩當(dāng)天（0 d），收集母豬的血清檢測IgA 和IgG，在分娩后0 d、2 d、9 d收集母豬的初乳和奶水，每天觀察記錄母豬是否有PED的臨床癥狀。在分娩后2 d、9 d收集仔豬的血清檢測IgA和IgG、IgA和IgG的檢測是在Iowa州立大學(xué)獸醫(yī)診斷實驗室進(jìn)行。

在5日齡時，所有的仔豬口服接種1 mL 美國來源的PEDV。該病毒來自于之前分離的1日齡腹瀉仔豬的糞便，PCR Ct值為19，-80 ℃分裝保存的樣品。每天觀察2次仔豬的臨床癥狀。瀕死仔豬依據(jù)AASV/AVMA準(zhǔn)則進(jìn)行安樂死，所有的觀察持續(xù)到分娩后21 d。

對所有組的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行整理匯總統(tǒng)計，采用one way ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計分析母豬IgG及IgA的S/P，P＜0.05差異顯著，P＜0.01差異極顯著。

表2　分娩當(dāng)天母豬血清中IgA含量的ELISA檢測值最小二次方統(tǒng)計比較

表3　分娩當(dāng)天母豬血清中IgG含量的ELISA檢測值最小二次方統(tǒng)計比較

2　結(jié)果與討論

1）通過試驗結(jié)果可知，血清中的IgG的產(chǎn)生是源于之前接觸過PEDV，與陰性不免疫組相比，P.E.不免疫組有更高的IgG（P＜0.01），同時陰性免疫組也能產(chǎn)生接近P.E.不免疫組水平的IgG（P=0.02）。疫苗免疫也一定程度增加了P.E母豬血清和初乳中IgG的水平（圖1-圖3）。P.E.母豬與陰性免疫組母豬血清中IgG的免疫應(yīng)答是相近的。

圖1　分娩當(dāng)天母豬血清中IgG和IgA S/P值的比較，圖中陽性的閾值線定義為0.8，超過0.8的為陽性。

圖2　母豬初乳和奶水中IgG S/P值的比較，圖中陽性的閾值線定義為0.8，超過0.8的為陽性。

圖3　母豬初乳和奶水中IgA S/P值的比較，圖表中陽性的閾值線定義為0.8，超過0.8的為陽性。

2）IgA的免疫應(yīng)答方式與IgG卻不一樣。P.E.母豬組無論是免疫疫苗或不免疫疫苗，在血清及初乳中都有較高的IgA滴度（P＜0.01）。P.E免疫組有著最高的IgA滴度，不免疫組次之。在陰性免疫組能檢測到很低的IgA滴度、陰性不免疫組檢測不到（圖1-圖5），這2組之間的IgA水平差異不顯著（P=0.18）。這些結(jié)果并不意外，注射免疫僅能刺激體液IgG免疫應(yīng)答。與陰性不免疫組相比，免疫陰性母豬即使是能在初乳、奶水中激發(fā)產(chǎn)生能檢測到的IgA抗體（圖3），但是對降低死亡率沒有改善（圖6）。

圖4　分娩后第2天仔豬血清中IgG和IgA S/P值的比較，圖表中陽性的閾值線定義為0.8，超過0.8的為陽性。

圖5　分娩后9 d仔豬血清中IgG和IgA S/P值的比較，圖表中陽性的閾值線定義為0.8，超過0.8的為陽性。

圖6　各處理組仔豬死亡率的比較。PEDV接種發(fā)生在5 d，仔豬死亡持續(xù)發(fā)生至15 d，15～21 d沒有死亡，21 d試驗結(jié)束。

3）仔豬血清中IgG抗體水平趨勢與母豬血清和初乳類似，在P.E.組和陰性免疫組有著較高的水平，這與初乳的傳遞有關(guān)。仔豬血清中IgG和IgA的水平在2～9 d持續(xù)下降，與預(yù)期的被動免疫抗體衰減一致，由于IgG免疫球蛋白亞型主要集中在初乳中，奶水中IgG滴度下降。

4）IgA讓人感興趣的地方是IgA抗體水平與黏膜病理修護(hù)正相關(guān)，在本研究中，IgA的抗體水平強(qiáng)烈地影響仔豬的死亡率（圖4、圖5、圖6）。P.E.母豬組在初乳中有高滴度的IgA，仔豬在攻毒時表現(xiàn)出溫和的臨床癥狀、無死亡。相反，陰性母豬組的所有仔豬，無論是免疫組還是未免疫組，都對攻毒表現(xiàn)出強(qiáng)烈的反應(yīng)，與陰性不免疫組相比，免疫組仔豬的死亡只是延緩了，最終2組死亡率都達(dá)到了100%。

通過本研究的數(shù)據(jù)可知，對P.E.母豬或陰性母豬免疫碩騰的PEDV疫苗，顯著提高了母豬、一定程度增加了仔豬（母源抗體）血清中IgG的水平。但是，疫苗未能有效提高IgA的水平。本研究表明，疫苗免疫沒有產(chǎn)生有效母源抗體傳遞的IgA水平來減少陰性免疫組仔豬的斷奶前死亡率。本研究支持PEDV攻毒時高水平的IgA能提高仔豬存活率的假說。為保護(hù)陰性母豬群仔豬的有效疫苗，將是一種能夠誘導(dǎo)母豬奶水中產(chǎn)生更高IgA抗體滴度的疫苗。

原文作者及單位：

T.J.Schwartz1；C. J.Rademacher2；L.G.Gimenez-Lirola2；Y.Sun2；J.J.Zimmerman2

（1.SuidaeHealthand Production，Algona，Iowa；2.Department of Veterinary diagnostic and Production Animal Medicine，College of Veterinary Medicine，Iowa State University，Ames，Iwoa）

2016-05-25）