陳鐵壁> 劉冬敏鹿　康王建輝周　強鄧勝國李夢群

(1. 湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州　425199；2. 長沙理工大學(xué)湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙　410114)

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草魚魚鱗膠原蛋白酸酶分步提取工藝研究

陳鐵壁1> 劉冬敏1鹿康2王建輝2周強1鄧勝國1李夢群1

(1. 湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州425199；2. 長沙理工大學(xué)湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙410114)

為實現(xiàn)魚鱗膠原蛋白的高效提取，在優(yōu)化脫鈣、混酸法和酶法提取工藝基礎(chǔ)上，對魚鱗膠原蛋白的酸酶進行分步提取。研究發(fā)現(xiàn)，魚鱗最佳脫鈣工藝為料液比8∶100(g/mL)，鹽酸濃度1.0 mol/L，反應(yīng)時間1.0 h，反應(yīng)溫度20 ℃；混合酸法提取魚鱗膠原蛋白的最佳條件為醋酸料液比1∶12(g/mL)，檸檬酸料液比1∶10(g/mL)，乳酸料液比1∶12(g/mL)，即混合酸料液比為1∶34(g/mL)，其中，0.8 mol/L檸檬酸、1 mol/L乳酸、0.8 mol/L醋酸的體積比為6∶5∶6，提取時間2 d，膠原蛋白的提取率為48.14%；最佳酶法提取條件為胃蛋白酶用量450 U/g，提取溫度30 ℃，提取時間72 h，該條件下提取率為45.26%。酸酶耦合法優(yōu)于單一方法或同種方法兩次提取的效果，可實現(xiàn)酸溶性和酶溶性膠原蛋白的連續(xù)提取，先酸后酶法膠原蛋白的提取率達84.61%，SDS-PAGE凝膠電泳發(fā)現(xiàn)其為I型膠原蛋。

草魚；魚鱗；酸提；酶提；膠原蛋白

中國是世界上水產(chǎn)品產(chǎn)量最大的國家，也是世界上唯一養(yǎng)殖量超過捕撈量的國家，水產(chǎn)品產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的1/3左右。2014年中國水產(chǎn)品總量達6 461.52萬t，淡水產(chǎn)品產(chǎn)量3 165.30 萬t，占總產(chǎn)量的48.98%，同比增長4.36%[1]，其中，淡水養(yǎng)殖魚類中，草魚產(chǎn)量最高，為537.68萬t。據(jù)統(tǒng)計，中國每年魚的廢棄物總量達200萬t左右[2]，其中15%是魚鱗，約30萬t[3]，若處理不當(dāng)，濃烈的魚腥味或發(fā)臭氣味勢必給周圍環(huán)境帶來巨大影響。對其副產(chǎn)物進行精細加工，不但可提高水產(chǎn)品加工的附加值，安置漁區(qū)部分剩余勞動力，而且可帶動如加工機械業(yè)等相關(guān)行業(yè)的發(fā)展，具有明顯的經(jīng)濟和社會效益。

魚鱗膠原蛋白因其多功能性，已逐漸受到廣大研究者的關(guān)注，對魚鱗膠原蛋白的研究和應(yīng)用業(yè)已滲入多個行業(yè)和領(lǐng)域。然而，目前中國該產(chǎn)業(yè)尚處于初級收集階段，其中，魚鱗膠原蛋白提取工藝耗時長，成本高，提取率不高是主要的瓶頸難題[4-5]。是故，更為安全、高效、低成本的提取方法的研發(fā)已成為實現(xiàn)其高值利用的關(guān)鍵。國內(nèi)外對于魚鱗膠原蛋白的提取及其功能性研究頗多，但均以單一酸法或酶法提取為主。研究發(fā)現(xiàn)，酸溶性膠原蛋白和酶溶性膠原蛋白之間在分子構(gòu)型、氨基酸組成等方面的差異不明顯[6]。本研究擬采用酸酶分步法提取草魚魚鱗膠原蛋白，旨實現(xiàn)魚鱗膠原蛋白的高效提取，為其高效利用提供理論和技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1試驗材料

草魚魚鱗：湖南省益陽益華水產(chǎn)品有限公司，經(jīng)清水反復(fù)清洗后晾干，用萬能粉碎機磨成粉狀后，于4 ℃以下保存，備用。

1.2化學(xué)試劑

檸檬酸、醋酸、乳酸、氯化鈉、乙醇：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

高氯酸：分析純，北京興瑞達化工廠；

EDTA：分析純，長沙湘科精細化工廠；

鉻黑T：分析純，上海邁坤化工有限公司；

鹽酸：分析純，衡陽市凱信化工試劑有限公司；

氫氧化鈉：分析純，津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；

L-羥脯氨酸：分析純，上海安耐吉化學(xué)有限公司；

胃蛋白酶：≥1 200 U/g，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3主要儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-6型，鄭州佳創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司；

紫外分光光度計：UV-100型，天津市普瑞斯儀器有限公司；

恒溫磁力攪拌器：HJ-3型，蘇州江東精密儀器有限公司；

臺式pH計：DD.27-Delta320型，北京卓川電子科技有限公司；

電子分析天平：FA2004型，北京衡器廠有限公司；

真空冷凍干燥機：FD-1型，長沙太康儀器設(shè)備有限公司；

馬弗爐：LX/10型，常州市興光窯爐有限公司；

臺式離心機：DT5-6A型，北京時代北利離心機有限公司；

萬能粉碎機：FW100型，東西儀科技有限公司。

1.4試驗方法

1.4.1草魚魚鱗的基本成分分析

(1) 水分測定采用直接干燥法：按GB/T 5009.3—2003執(zhí)行。

(2) 粗蛋白測定采用量凱氏定氮法：按GB/T 5009.5—2003執(zhí)行。

(3) 粗脂肪測定采用索氏抽提法：按GB/T 5009.6—2003執(zhí)行。

(4) 灰分測定采用馬弗爐灰化法：按GB 5009.4—2003執(zhí)行。

1.4.2膠原蛋白含量的測定采用Woessner比色法[7]157-158。膠原蛋白的含量由所測羥脯氨酸含量乘以相關(guān)系數(shù)即得，同一種魚鱗相關(guān)系數(shù)一定，膠原蛋白的提取率可表示為：

(1)

1.4.3魚鱗脫鈣工藝研究Ca2+標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照王信蘇等[8]的方法，以鉻黑T為指示劑，用0.075 mol/L EDTA溶液滴定，得EDTA消耗量與Ca2+濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.711x+0.184 9(R2=0.998 2)。根據(jù)以往研究報道[7] 1-81[8-10]，脫鈣工藝研究按表1因素水平表進行正交試驗，根據(jù)EDTA消耗量計算溶液中Ca2+濃度，以脫鈣率為指標(biāo)，篩選出最佳脫鈣工藝。

表1　脫鈣因素水平表

1.4.4酸法提取膠原蛋白膠原蛋白的酸法提取中以往多以檸檬酸、乳酸、醋酸等單一酸水解，提取時間需3d[3,10]；本試驗在魚鱗脫鈣處理后，采用濃度為0.8 mol/L檸檬酸、1 mol/L乳酸、0.8 mol/L醋酸，在20 ℃下，磁力攪拌提取2 d，按表2因素水平表采用混合酸法進行膠原蛋白的提取，以膠原蛋白的提取率為評價指標(biāo)，篩選最佳酸法提取工藝。

表2　酸法提取膠原蛋白因素水平表

1.4.5酶法提取膠原蛋白魚鱗脫鈣后，根據(jù)以往研究[11-14]，分別選取提取溫度、提取時間、胃蛋白酶用量為考察因素，按表3因素水平表進行正交試驗，以膠原蛋白的提取率為評價指標(biāo)，篩選最佳酶法提取工藝。

1.4.6酸酶分步法提取膠原蛋白選取上述兩種提取膠原蛋白的最優(yōu)方案，分別采用酸—酸、酸—酶、酶—酶、酶—酸二次提取法，以膠原蛋白提取率為判斷標(biāo)準(zhǔn)篩選最優(yōu)試驗方案。

表3　酶法提取膠原蛋白因子水平表

1.4.7膠原蛋白的純化參考段宙位等[15]的方法，并稍作修改。取1.4.6中所得粗蛋白，加入NaCl至溶液終濃度為3.0 mol/L，于4 ℃條件下6 000 r/min離心10 min，重復(fù)兩次，透析，冷凍干燥，所得樣品即為純化后的膠原蛋白。

1.4.8十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)分析參考周愛梅等[16]的方法略加改進。先配制 2.0 mg/mL的膠原蛋白溶液，與添加有SDS、甘油、溴酚藍、β-巰基乙醇的Tris—HCl緩沖液混合，在沸水里加熱3 min，冷卻備用。用7.5%的丙烯酰胺對膠原蛋白進行電泳分析，電泳條件為200 V、2.0 h。采用考馬斯亮藍R250染色，用體積分?jǐn)?shù)為7.5%的醋酸和5% 的甲醇脫色。

1.5數(shù)據(jù)分析

結(jié)果以平均值表示，顯著性統(tǒng)計采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件的單因素方差分析，并進行Duncan氏多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2　結(jié)果與討論

2.1魚鱗的基本成分

由表4可知，草魚魚鱗中粗脂肪含量為0.51%，蛋白質(zhì)含量豐富，達60.02%，其灰分含量高達24.37%。因魚鱗中的灰分和脂肪均可能阻礙提取液與魚鱗間的接觸，直接影響到魚鱗膠原蛋白的提取，且魚鱗灰分中鈣質(zhì)多以羥基磷灰石形式存在，黏附于膠原纖維的表面[17-18]，因此，在提取魚鱗膠原蛋白過程中，首先必須使膠原蛋白脫離磷灰石晶格的束縛而溶出[19-20]。因魚鱗中粗脂肪含量較低，本試驗提取前的預(yù)處理主要對魚鱗進行脫鈣處理。

表4　魚鱗中各組分的含量?

?各組分均以干基計。

2.2魚鱗脫鈣工藝優(yōu)化

選定料液比、時間、溫度、鹽酸濃度4因素進行L9(34)正交試驗，由表5可知，影響魚鱗脫鈣效果的各因素中主次關(guān)系依次為：溫度(D)>料液比(A)>鹽酸濃度(C)>時間(B)，脫鈣最優(yōu)方案為A2B2C3D1，即以1.0 mol/L鹽酸為脫鈣液，料液比為8∶100(g/mL)，在20 ℃下提取1.0 h。

表5　脫鈣正交試驗表

2.3膠原蛋白的酸法提取工藝優(yōu)化

當(dāng)前用于魚鱗膠原蛋白提取的試劑多以可食用的檸檬酸、醋酸、乳酸為主，因此提取法無需嚴(yán)格的后續(xù)脫酸工藝。但在以往研究中，膠原蛋白的提取研究均用單一酸，其得率均不高。本研究分別以檸檬酸、乳酸和醋酸的料液比三因素進行L9(34)正交試驗。由表6可知，影響混合酸法提取魚鱗膠原蛋白的主次因素依次為：醋酸(B)>檸檬酸(A)>乳酸(C)，其最佳混合酸的料液比為1∶34(g/mL)，其中，0.8 mol/L檸檬酸、1 mol/L乳酸、0.8 mol/L醋酸的體積比為6∶5∶6。驗證實驗發(fā)現(xiàn)，按最優(yōu)混酸提取方案，磁力攪拌提取時間2 d，膠原蛋白的提取率達48.14%。

表6　酸法提取膠原蛋白正交試驗表

2.4膠原蛋白的酶法提取工藝優(yōu)化

膠原蛋白變性溫度較低，在32 ℃左右，因胃蛋白的易獲得性，且價格不高，最適溫度相近，同時，胃蛋白酶對膠原蛋白的有限水解可增大膠原蛋白的溶解度。是故，本研究選用胃蛋白酶，在正交試驗設(shè)計時，選擇反應(yīng)溫度小于32 ℃。由表7可知，影響酶法提取魚鱗膠原蛋白的主次因素依次為：A(溫度)>C(酶用量)>B(時間)，最佳提取條件為：酶用量450 U/g，于30 ℃條件下提取72 h，此時提取率為45.26%。

表7　酶法提取膠原蛋白正交試驗表

2.5膠原蛋白的酸酶分步法提取

由表8可知，酸酶分步法均顯著提高了魚鱗膠原蛋白的提取率(P<0.05)，且先酸后酶法優(yōu)于先酶后酸法(P<0.05)，其提取率分別為84.61%，76.65%?？赡芫売谙人岷竺阜ㄍㄟ^破壞魚鱗的表面結(jié)構(gòu)，使胃蛋白酶更容易滲入到魚鱗中，有利于胃蛋白酶發(fā)揮酶解作用，從而提高了膠原蛋白的提取效率。

2.6SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果

由圖1可知，酸酶分步法提取的魚鱗膠原蛋白含有兩條α肽鏈(α1、α2，分子量分別約為120，110 kD)和一條β聚合鏈(α的二聚體，分子質(zhì)量約為200 kD)，與鐘朝輝等[14]的研究結(jié)果相似，可初步確定酸酶分步法提取的魚鱗膠原蛋白為I型膠原蛋白，圖譜中無其他條帶，可見酸酶分步法所提膠魚鱗原蛋白純度較高，且未變性。

表8　酸酶耦合法試驗方案及其結(jié)果?

?同列上標(biāo)不同表示差異顯著( P<0.05) 。

M. 次高分量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker

3　結(jié)論

本研究以草魚魚鱗為研究對象，探索魚鱗膠原蛋白的高效提取工藝，系列研究發(fā)現(xiàn)：魚鱗最佳脫鈣工藝為料液比8∶100(g/mL)，鹽酸濃度1.0 mol/L，20 ℃條件下反應(yīng)1.0 h；采用三酸(檸檬酸、乳酸、醋酸)聯(lián)用，膠原蛋白的提取率為48.14%，較單一酸法提取大大節(jié)省了提取時間；酶法提取在胃蛋白酶活性范圍之內(nèi)，其最佳提取工藝為：酶用量為450 U/g，于30 ℃條件下提取72 h；采用酸酶分步法魚鱗膠原蛋白的提取率均顯著高于單一提取方法或同種方法兩次提取的效果(P<0.05)。本研究實現(xiàn)了酸溶性膠原蛋白和酶溶性膠原蛋白的連續(xù)提取，能保持膠原蛋白原有結(jié)構(gòu)不變，能更為有效地利用魚鱗蛋白，減少資源浪費和環(huán)境污染，對魚鱗蛋白乃至淡水魚加工副產(chǎn)物的高效利用具有很好的技術(shù)和理論指導(dǎo)意義。

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Combinated use of enzyme and acid for collagen extraction from fish scales>

CHEN Tie-bi1LIUDong-min1LUKang2WANGJian-hui2ZHOUQiang1DENGGuo-sheng1LIMeng-qun1

(1.DepartmentofBiologyandChemistry,HunanUniversityofScienceandTechnology,Yongzhou,Hunan425100,China;2.HunanProvincialEngineeringResearchCenterforFoodProcessingofAquaticBioticResources,ChangshaUniversityofScienceandTechnology,Changsha,Hunan410114,China)

In order to realize the efficient extraction of collagen from fish scales, acid-enzyme coupling methods was used for collagen extraction based on the optimized decalcification, mixed-acid and enzymatic extraction. The optimum decalcification of fish scales was as follows. The solid to liquid ratio was 8∶100, soluted in 1.0 mol/L hydrochloric acid, and then reaction at 20 ℃ for 1.0 h. The best conditions for collagen extraction using mixed acid were 1∶12 of acetic acid, 1∶10 of citric acid, and 1∶12 of lactic acid for 3 d extraction and the extraction yield of it was 48.14%. The best enzymatic extraction conditions were shown to be 450 U/g of pepsin at the extraction temperature of 30 ℃ for 72 h and the yield was 45.26%. Acid-enzyme coupling method showed better effect than acid or enzymatic extraction only, even though repeating them twice respectively was not as effective as the coupled one, in spite of relatively high cost and time-consuming (P<0.05). We could obtain 84.61% of the collagen using mixed acid followed by enzymatic extraction , and the extracted collagen was identified to be type I one using SDS-PAGE.

Grass carp; fish scale; acid extraction; enzymatic extraction; collagen

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(編號：31301564)；湖南省自然科學(xué)基金項目(編號：2015JJ2011)；湖湘青年英才支持計劃項目(編號：2015RS4051)；永州市科技局科技計劃項目(編號：永科發(fā)[2009]20號)；湖南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃資助(編號：2012-318)； 湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心開放基金資助項目(編號：2016GCZX02，2015GCZX08)

陳鐵壁，男，湖南科技學(xué)院實驗師，碩士。

王建輝(1980-)，男，長沙理工大學(xué)教授，博士。

E-mail:wangjh0909@163.com

2016—05—11

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.040