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9種市售阿膠蛋白質(zhì)特性比較分析

CHANG Bing-yu1CHENMao-shen1HAOXiang-hui2,3GUOShang-wei2,3MAJian-guo1ZHONGFang1

(1.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China;2.Dong’eE-jiaoCo.,LTD,Liaocheng,Shandong252201,China;3.NationalEngineeringResearchCenterforGelatineTCM,Liaocheng,Shandong252201,China)

對(duì)9種市售阿膠(E1～E9)進(jìn)行蛋白質(zhì)特性分析比較，包括氨基酸組成、等電點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和分子量分布。結(jié)果表明，9種市售阿膠的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)均在4.38～4.88，無明顯差異；圓二色譜表明所有樣品中蛋白質(zhì)的三螺旋結(jié)構(gòu)均被破壞，呈無規(guī)則卷曲狀態(tài)；氨基酸組成大致相似，而亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)組成有一定差異，E2、E3、E4、E9的亞氨基酸含量較低，小于23.8%，其余5種樣品的含量較高，大于25.0%；蛋白質(zhì)分子量分布有較大差異，E2、E4、E7、E8的阿膠蛋白質(zhì)分布更分散，含有較多的高分子蛋白(占比>4.46%)，且主要蛋白質(zhì)的重均分子量較大，為120～132 kD，而其余5種樣品的分子量分布較集中，高分子蛋白占比小于1.16%，且主要蛋白質(zhì)的重均分子量較小，為36～42 kD。市售阿膠的蛋白質(zhì)差異主要是蛋白質(zhì)的降解程度不同造成的。阿膠差異化評(píng)價(jià)的蛋白質(zhì)特性評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步考察工藝對(duì)蛋白質(zhì)特性的影響提供依據(jù)。

阿膠；氨基酸；分子量分布；蛋白質(zhì)特性

阿膠(Asini Corri Collas，ACC)與人參、鹿茸并稱“中藥三寶”，是中國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，有滋陰補(bǔ)血、潤(rùn)燥止血的功效[1]。針對(duì)阿膠的藥理作用機(jī)制，研究人員作了很多研究。通過分析阿膠的主要成分發(fā)現(xiàn)其中含有豐富的氨基酸和微量元素[2]，為人體提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；還有研究發(fā)現(xiàn)阿膠中含有較多的羧基、硫酸酯基、硫酸基等負(fù)電荷，可形成聚負(fù)離子基結(jié)構(gòu)，電泳時(shí)偏向陽(yáng)極[3]，每個(gè)分子可形成一個(gè)穩(wěn)定的大分子晶體結(jié)構(gòu)，使其不必進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，僅通過細(xì)胞外間質(zhì)的代謝來調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，參與生理與病理過程[4]。

阿膠的主要成分有蛋白質(zhì)、氨基酸及微量元素，還有硫酸皮膚素等多糖類物質(zhì)。其中，蛋白質(zhì)類含量約為60%～85%，是阿膠的主要成分[5]。多肽和氨基酸主要是在制膠過程中膠原蛋白部分肽鍵斷裂所形成的一系列降解產(chǎn)物[6]。阿膠補(bǔ)血補(bǔ)益作用的物質(zhì)基礎(chǔ)與阿膠中蛋白質(zhì)類物質(zhì)有密切關(guān)系，研究阿膠中蛋白質(zhì)、多肽的特性和結(jié)構(gòu)尤為重要。如今，對(duì)阿膠蛋白質(zhì)的特性已有一定的研究，李峰等[7]對(duì)阿膠和其它動(dòng)物膠進(jìn)行了SDS-PAGE分析，得出了阿膠蛋白質(zhì)各電泳譜帶的泳動(dòng)率Rf值；陳振江等[8]采用IFE法測(cè)定出阿膠及其偽品中幾種主要蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在4.15～4.80。這些研究多側(cè)重于真?zhèn)舞b別和阿膠與其它動(dòng)物膠的對(duì)比，沒有對(duì)阿膠蛋白質(zhì)的特性進(jìn)行系統(tǒng)的研究，同時(shí)，尚未有對(duì)市售阿膠中蛋白質(zhì)特性差異進(jìn)行研究。

本研究從市場(chǎng)上收集了具有代表性的9種阿膠樣品，擬對(duì)其蛋白質(zhì)特性如氨基酸組成、等電點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和分子量分布進(jìn)行詳細(xì)的分析對(duì)比，從而揭示不同廠家所產(chǎn)阿膠的內(nèi)在差別所在，對(duì)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)阿膠有一定的指導(dǎo)意義，補(bǔ)充完善現(xiàn)有的阿膠評(píng)價(jià)中蛋白質(zhì)特性評(píng)價(jià)部分，并為下一步研究加工工藝對(duì)蛋白質(zhì)特性的影響提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

樣品E1～E9：9種市售某品牌阿膠；

牛血清白蛋白、疊氮化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑均為分析純；

高效液相色譜儀：Agilent1260型，美國(guó)安捷倫公司；

多角度激光散射凝膠色譜儀：DAWN HELEOS Ⅱ型，美國(guó)懷雅特技術(shù)公司；

圓二色光譜儀：MOS-450型，法國(guó)Biologic公司；

Zeta電位及納米粒度分析儀：ZetaPALS型，美國(guó)布魯克海文儀器公司；

電子天平：AL204型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司。

1.2成分測(cè)定

(1) 水分含量：直接干燥法[9]。

(2) 蛋白質(zhì)含量：凱氏定氮法[10]。

1.3阿膠蛋白質(zhì)的提純

稱取適量阿膠于熱水中充分溶解，4 000 r/min離心10 min，加入預(yù)冷的無水乙醇至乙醇終濃度為75%，4 ℃保存1 h后，于4 ℃，5 000 r/min條件下冷凍離心15 min。去上清液，加入25 mL預(yù)冷的75%乙醇，4 ℃保存30 min，冷凍離心，去上清液，反復(fù)洗滌3次。沉淀物于通風(fēng)櫥揮盡酒精味后，水洗至培養(yǎng)皿中，冷凍干燥得蛋白提純物[11]。提純后的阿膠蛋白中，蛋白含量均大于94%，糖含量均小于0.82%。該方法的蛋白提取率高于85.31%，糖去除率高于91.20%，提取出的蛋白可以代表阿膠中的主要蛋白。

1.4阿膠蛋白的氨基酸組成分析

精密稱取提純物放入水解管中，加入8 mL鹽酸溶液(6 mol/L)和2滴辛醇，將水解管抽真空密封，于110 ℃烘箱中水解21 h。取出冷卻后定容至25 mL，過濾。吸取1 mL濾液放入燒杯中，置于含有氫氧化鈉的干燥器中50 ℃保溫過夜。加入1 mL鹽酸溶液(0.02 mol/L)，混勻，離心，將上清液轉(zhuǎn)移至樣品瓶中待測(cè)[12]。

采用OPA-PMOC柱前衍生化分析方法。色譜條件：色譜柱250 mm×4.6 mm，5 μm；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A相，稱取8.0 g結(jié)晶乙酸鈉于1 000 mL燒杯中，加入1 000 mL開水?dāng)嚢柚了薪Y(jié)晶溶解，再加225 μL三乙胺，攪拌并加5%的醋酸，調(diào)pH 7.2，加入5 mL四氫呋喃，混合后備用；B相，稱取8.0 g 結(jié)晶乙酸鈉于800 mL燒杯中，加入400 mL開水?dāng)嚢柚了薪Y(jié)晶溶解，滴加2%的醋酸，pH調(diào)至7.2，將此溶液加入800 mL乙腈和800 mL甲醇備用；流速：1.0 mL/min；紫外檢測(cè)器：262 nm(脯氨酸和羥脯氨酸)，338 nm(其余氨基酸)；梯度洗脫[13]。

1.5阿膠蛋白的等電點(diǎn)分析

阿膠蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定根據(jù)Nalinanon等[14]的方法修改如下：稱取提純物加水溶解后配制成0.4 mg/mL溶液，用0.02 mol/L的NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH，每隔0.5個(gè)pH取樣，測(cè)定其Zeta電位。

1.6阿膠蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

采用圓二色光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行圓二色譜分析。稱取提純物加水溶解后配制成1 mg/mL的溶液，4 000 r/min離心5 min，取上清液供試。樣品吸收池光程為0.01 cm，譜帶寬度：1 nm；測(cè)定范圍：180～300 nm；掃描波長(zhǎng)間隔：0.1 nm；每點(diǎn)響應(yīng)時(shí)間：1 s；每個(gè)供試品重復(fù)測(cè)定3次；測(cè)定溫度：室溫。

1.7阿膠蛋白的分子量分析

采用多角度激光光散射凝膠色譜系統(tǒng)(HPSEC-RI-MALLS)測(cè)定阿膠蛋白質(zhì)分子量分布。流動(dòng)相采用含0.15 mol/L 氯化鈉的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0,含0.02%疊氮化鈉)；流速為0.35 mL/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)選用220 nm。用牛血清白蛋白(Mw=77 kDa)校準(zhǔn)儀器。

稱取適量提純物粉溶解于流動(dòng)相，配制成1 mg/mL的樣品溶液，過0.45 μm微孔濾膜后進(jìn)行HPSEC-RI-MALLS分析。采用ASTRA軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。dn/dc值取0.185[15]。

1.8數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0和Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，顯著性分析采用最小顯著差法(LSD)檢驗(yàn)，P≤0.05認(rèn)為差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1阿膠蛋白質(zhì)含量分析對(duì)比

阿膠的蛋白質(zhì)含量可由氮含量乘以換算系數(shù)而計(jì)算出，驢皮的換算系數(shù)取5.55。市售阿膠的蛋白質(zhì)含量見表1。9種阿膠的蛋白質(zhì)含量在72.15%～89.44%，含量很高，與趙曦等[16]的研究結(jié)果類似。

2.2阿膠蛋白的氨基酸組成分析

對(duì)提取后的阿膠蛋白質(zhì)的氨基酸組成進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。共檢測(cè)出阿膠蛋白質(zhì)中含有17種氨基酸，含7種必需氨基酸。阿膠屬于膠原蛋白水解產(chǎn)物，不含色氨酸、半胱氨酸。所有樣品中，以甘氨酸含量最高，占總氨基酸含量的21.5%～22.5%，其次為谷氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、丙氨酸和精氨酸，以上6種氨基酸為阿膠中主要氨基酸，占氨基酸總量的70%以上，與已有的報(bào)道[17]一致。分析對(duì)比9種阿膠蛋白質(zhì)的氨基酸組成差異，可以發(fā)現(xiàn)大多數(shù)阿膠蛋白質(zhì)的組成非常接近，但亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)的組成有一定的差異。據(jù)報(bào)道[18]，亞氨基酸是膠原蛋白中起到穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的重要氨基酸，而降解程度過大會(huì)導(dǎo)致亞氨基酸較多地釋放。因此，亞氨基酸含量較低的樣品可能與驢皮中膠原蛋白的降解程度有關(guān)。

表1　不同阿膠蛋白質(zhì)含量

表2　不同阿膠氨基酸組成?

?每1 000個(gè)氨基酸殘基含有的氨基酸殘基數(shù)；亞氨基酸為脯氨酸和羥脯氨酸之和。

2.3阿膠蛋白的等電點(diǎn)分析

Zeta電位是描述膠粒表面電荷性質(zhì)的一個(gè)物理量，它是距離膠粒表面一定距離處的電位。若膠粒表面帶有某種電荷，其表面就會(huì)吸附相反符號(hào)的電荷，構(gòu)成雙電層[19]。在滑動(dòng)面處產(chǎn)生的動(dòng)電電位叫做Zeta電位。在溶液pH<等電點(diǎn)(pI)時(shí)，由于可電離氨基酸的增加，膠粒表現(xiàn)為帶正電荷；

圖1　阿膠蛋白溶液(E9)在不同pH下的Zeta電位

pH>pI時(shí)，膠粒表面所帶電荷為負(fù)；當(dāng)pH=pI時(shí)，膠粒表面上的正電荷數(shù)與固定層吸附的負(fù)離子數(shù)相等，Zeta電位為零，可以求得此時(shí)溶液的pH值，即為溶液的pI。

阿膠蛋白溶液在不同pH下的Zeta電位曲線見圖1(以E9為例)，可以求得其Zeta電位為零時(shí)的pI值。各樣品的等電點(diǎn)值見表3。

表3　不同阿膠蛋白溶液的等電點(diǎn)

結(jié)果表明，所有樣品的pI在4.38～4.88。由于膠原蛋白的pI在4.8左右，水解的進(jìn)行使酰胺鍵斷裂，羧基釋放，從而使阿膠的pI略微下降[20]。但是由于阿膠的制作工藝均是膠原蛋白的熱裂解，因此所有樣品的pI相差很小，僅相差0.5，與安廣杰等[21]的研究結(jié)果類似。

2.4阿膠蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

圓二色譜(CD)通常被用來研究蛋白分子的空間構(gòu)象。一般分為遠(yuǎn)紫外區(qū)(190～250 nm)與近紫外區(qū)(250～500 nm)，遠(yuǎn)紫外區(qū)反映的是主鏈構(gòu)象，屬于肽鍵的吸收，常被用來表征蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息；而近紫外區(qū)則主要反映蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)信息[22]。

阿膠蛋白質(zhì)的遠(yuǎn)紫外區(qū)圓二色譜圖見圖2(以E1為例)，其余樣品的圓二色譜圖與E1相似，均在190 nm左右有一大的負(fù)峰，在220 nm左右處幾乎無峰或僅有微弱的小峰。天然膠原蛋白具有三螺旋結(jié)構(gòu)，其圓二色譜特征是在190～200 nm左右有一個(gè)強(qiáng)的負(fù)吸收峰，在210～230 nm時(shí)有一個(gè)弱的正吸收峰。而所有阿膠蛋白樣品的圓二色譜圖在220 nm左右處幾乎無峰或僅有微弱的小峰。阿膠中蛋白質(zhì)經(jīng)過工藝中的化皮、熬煮處理，其三螺旋結(jié)構(gòu)已被破壞或僅有極少量的三螺旋結(jié)構(gòu)，表明市售阿膠中的蛋白質(zhì)構(gòu)象無差異，均呈現(xiàn)無規(guī)則卷曲的狀態(tài)。

2.5阿膠蛋白的分子量分布

各個(gè)樣品的分子量分布見圖3。由圖3可知，各個(gè)樣品的分子量分布曲線有較大差異，為方便對(duì)比樣品，將洗脫曲線分為三部分，分別為20～25 min高分子量區(qū)域，25～32 min中分子量區(qū)域和32～37 min低分子量區(qū)域，并用ASTRA軟件計(jì)算出各區(qū)域的重均分子量和所占比例，見表4。由圖3中各樣品的流出曲線可知，阿膠中的蛋白質(zhì)分子量為連續(xù)分布，集中在中分子量區(qū)域(占比為82.37%～98.02%)，各樣品的重均分子量為37～132 kDa。各樣品的蛋白質(zhì)重均分子量和分子量分布有較大差異。

圖2　阿膠蛋白質(zhì)(E1)的圓二色譜圖

樣品名高分子量區(qū)域Mw/kD占比/%中分子量區(qū)域Mw/kD占比/%低分子量區(qū)域Mw/kD占比/%E121370.824296.08363.10E247055.1412882.376112.50E339420.253891.42468.32E442607.4513287.01895.54E532991.163787.502211.34E647720.493694.16295.35E730704.4612085.153310.39E841695.5613090.851733.59E978150.163698.02331.82

圖3　不同阿膠蛋白質(zhì)分子量分布

由表4可以得出，各樣品的中分子量區(qū)域的重均分子量有較大差異，其中，E2、E4、E7、E8的重均分子量較大(為120～132 kDa)，其余樣品的重均分子量較小(為37～42 kDa)。

由圖3可以看出，各樣品的分子量分布有較大差異?？梢詫⑺袠悠贩譃?類，第一類為E1、E9，僅中分子量區(qū)域有一個(gè)較窄的大峰，表明這類樣品的蛋白質(zhì)分子量分布很集中，集中在中分子量區(qū)域，占比達(dá)96%以上；第二類為E3、E5、E6，這類樣品的分子量分布曲線除了有一個(gè)中分子量區(qū)域的較窄大峰外，在低分子量區(qū)域還有一個(gè)小峰，其蛋白質(zhì)在高分子量區(qū)域分布很少，在低分子量區(qū)域的分布較多(占比為5.35%～11.34%)；第三類為E8，分子量分布曲線為一個(gè)較寬的大峰，呈現(xiàn)出明顯的前沿峰，分子量分布較分散，蛋白質(zhì)在高分子量區(qū)域有分布(占比為5.56%)；第四類為E2、E4、E7，這類樣品的分子量分布曲線除了有一個(gè)較寬的大峰之外，在小分子量區(qū)域還有一個(gè)小峰，分子量分布較分散，這類樣品在高分子量區(qū)域有少量分布(占比為4.46%～7.45%)，在低分子區(qū)域也有分布(占比為5.54%～12.50%)。

阿膠生產(chǎn)過程是膠原降解的過程，降解條件的強(qiáng)弱和時(shí)間長(zhǎng)短直接影響了阿膠分子量分布[23]。降解不充分可能導(dǎo)致高分子量蛋白的殘留，而降解程度過大可能導(dǎo)致產(chǎn)生較多的低分子量蛋白。第二類樣品在大峰之后又出現(xiàn)一個(gè)小峰，存在少部分低分子量蛋白質(zhì)，可能是降解程度較大導(dǎo)致的，第三類樣品呈現(xiàn)出前沿峰，存在大分子量蛋白質(zhì)，可能是降解程度小導(dǎo)致的。第四類樣品有前沿峰，且在大峰后出現(xiàn)一個(gè)小峰，表明同時(shí)存在大分子量和低分子量蛋白，則可能是降解條件較為劇烈，產(chǎn)生了較多的低分子量蛋白，但作用時(shí)間又較短，使得大分子量蛋白質(zhì)有一定的殘留。第一類樣品的分子量分布集中，可能與其降解條件適中有關(guān)。合適的降解程度是生產(chǎn)高質(zhì)量阿膠的重要保證，降解驢皮的程度和條件是未來阿膠研究的重要方向。

3　結(jié)論

對(duì)市售的9種阿膠進(jìn)行蛋白質(zhì)特性分析。通過測(cè)定Zeta電位計(jì)算出阿膠蛋白的等電點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)9種市售阿膠的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)無明顯差異。圓二色譜圖顯示9種阿膠蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)無規(guī)則卷曲狀態(tài)，在加工過程中蛋白質(zhì)的三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞。氨基酸結(jié)果顯示，共檢測(cè)到17種氨基酸，其中15種氨基酸組成接近，而亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)的組成上有一定的差異，這與加工過程中的過度降解有關(guān)。HPSEC-RI-MALLS結(jié)果表明，蛋白質(zhì)分子量大小和分子量分布有較大差異，有4種阿膠的蛋白質(zhì)分布較為分散，呈現(xiàn)出明顯的前沿峰，存在較多的高分子蛋白質(zhì)，可能與降解不充分有關(guān)。因此，市售阿膠的蛋白質(zhì)差異主要是驢皮中蛋白質(zhì)降解程度的不同造成的。本研究補(bǔ)充完善了現(xiàn)有的阿膠差異化鑒別的蛋白質(zhì)特性部分，可為進(jìn)一步考察工藝條件對(duì)蛋白質(zhì)降解程度的影響提供依據(jù)。

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Comparison and analysis of the protein characteristics in 9 kinds of commercial Asini Corii Collas

常冰玉1陳茂深1郝向慧2,3郭尚偉2,3麻建國(guó)1鐘芳1

(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫214122；2. 東阿阿膠股份有限公司，山東 聊城252201；3. 國(guó)家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，山東 聊城252201)

The protein characteristics of 9 kinds of commercial Asini Corri Collas (ACC, E1—E9) were compared, including amino acid composition, pI, secondary structure and molecular weight distribution. The differences of pI were negligible and all samples showed a range of 4.38—4.88. Circular dichroism results indicated that only random coil configurations was observed of all ACC samples due to the damage of triple helix structures. The amino acid composition was similar other than some differences in imino acid (Pro and Hyp) composition. E2, E3, E4 and E9 showed lower imino acid content (<23.80%) than that of others (>25.0%). Significant differences in the molecular weight distribution were observed. E2, E4, E7 and E8 appeared to be in a wider distribution containing more high molecular weight (>4.46%) and the major MW fraction was located in the range of 120-132 kD. The other 5 samples, however, showed a narrower distribution (high molecular weight protein <1.16%) and the major MW fraction was located in the range of 36-42 kD. The difference in protein characteristics of commercial ACC attributed to the differences in degradation degree of protein. This study would improve the protein characteristics evaluation system of ACC and lay a foundation to further study the effect of processing on protein characteristics.

Asini Corri Collas; amino acid; molecular weight distribution; protein characteristics

常冰玉，女，江南大學(xué)在讀碩士研究生。

鐘芳(1972—)，女，江南大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師。

E-mail：fzhong@jiangnan.edu.cn

2016-03-15

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.049