薛　山

(閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建 漳州　363000)

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柑橘皮渣中非水溶性抗氧化膳食纖維提取工藝優(yōu)化

薛山

(閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建 漳州363000)

用酶法提取榨汁后剩余柑橘皮渣中的非水溶性抗氧化膳食纖維(IADF)，并以提取物對DPPH自由基的清除能力作為抗氧化指標(biāo)進(jìn)行單因素和響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗。結(jié)果表明：在料液比33.58∶1(mL/g)，蛋白酶用量0.21 mL/g·皮渣，淀粉酶作用溫度67 ℃，糖化酶作用溫度64 ℃條件下，所提取的IADF抗氧化效果最顯著，為3.520 mmol Trolox /100 g IADF。

柑橘；皮渣；非水溶性膳食纖維；抗氧化

柑橘是世界第一大、中國第二大水果。在柑橘加工過程會生成40%～50%的皮渣副產(chǎn)物，其中橘皮(黃皮層和白皮層)幾乎為全果的25%[1]。膳食纖維(dietary fiber，DF)憑借其特殊的結(jié)構(gòu)組成和生理功效得到了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。作為人體必不可少的“第七營養(yǎng)素”，膳食纖維因其豐富而獨特的性質(zhì)備受關(guān)注[2]。然而，盡管諸多學(xué)者有研究果蔬(柑橘)[3-4]以及糧食谷物[5-6]中的膳食纖維提取，但是均以提取率為最終的指標(biāo)，而忽略了膳食纖維中多酚物質(zhì)所賦予其的抗氧化性。據(jù)報道[7-8]，柑橘果皮中的膳食纖維中含有豐富的生物活性物質(zhì)，主要包括酚酸和黃酮類化合物等自然抗氧化物質(zhì)。

1998年，Saura-Calixto[9]基于此提出了一個新概念——抗氧化膳食纖維(antioxidant dietary fiber，ADF)，即大量天然抗氧化劑結(jié)合到DF基質(zhì)中的產(chǎn)物。ADF按水中溶解性的不同分為水溶性膳食纖維(soluble antioxidant dietary fiber，SADF)和非水溶性膳食纖維(insoluble antioxidant dietary fiber，IADF)，其中IADF中富含黃酮類(花色素苷、黃烷、黃酮、黃酮醇、黃烷醇)、酚酸(沒食子酸、阿魏酸)以及縮合單寧(聚合的原花色素和高分子量水解鞣質(zhì))等天然抗氧化成分[10-12]。目前，植物性膳食纖維已被證實具有顯著的抗氧化活性[13]，并且已廣泛應(yīng)用于食品保鮮與功能食品研發(fā)等領(lǐng)域[14-15]。國外對于抗氧化膳食纖維的研究多集中于葡萄皮渣[10]和芒果皮渣[16]的應(yīng)用研究，而有關(guān)柑橘皮渣中ADF的報道較少。從國內(nèi)的研究情況來看，已有學(xué)者探討了植物性食品中膳食纖維的抗氧化活性[14]，但ADF這一概念僅在諶小立等[13]綜述中有提出，而針對柑橘皮渣中IADF的研究暫未查閱到。此外，關(guān)于IADF的提取，國內(nèi)外學(xué)者多以提取率為指標(biāo)，而本試驗以IADF的抗氧化性為基準(zhǔn)，對IADF的提取方法進(jìn)行優(yōu)化，具有一定的創(chuàng)新性。本研究擬從ADF角度出發(fā)，以DPPH清除率為指標(biāo)初步確定IADF的提取工藝，并通過單因素試驗和響應(yīng)曲面試驗優(yōu)化提取工藝，以期為日后柑橘皮渣中IADF的成分測定、提取利用及功能研究提供依據(jù)和參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料與試劑

柑橘皮渣：重慶市柑橘研究所；

α-淀粉酶(中溫)：酶活1 500 U/g，北京奧博生物技術(shù)有限公司；

酸性蛋白酶和糖化酶：酶活分別為3萬U/g和10萬U/g，上海博蘊(yùn)生物科技有限公司；

1, 1-二苯基苦基苯肼(DPPH)：分析純，美國Sigma公司；

甲醇、HCl、丙酮、無水乙醇、Na2CO3、NaOH、Na2HPO4和NaH2PO4：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2主要儀器設(shè)備

數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：85-2型，金壇市易晨儀器制造有限公司；

臺式離心機(jī)：TGL-16G型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-III型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

鼓風(fēng)烘箱：DHG-9240A型，上海一恒科技有限公司；

可見分光光度計：722型，上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HWS-26型，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-5298型，上海亞榮生化儀器廠。

1.2試驗方法

1.2.1柑橘皮渣預(yù)處理將柑橘皮渣切碎(1 cm×1 cm)，80 ℃燙漂30 s，離心脫水后，于65 ℃鼓風(fēng)烘箱內(nèi)干燥48 h。干燥后的皮渣用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，密封于塑料袋中，置于陰涼干燥處備用。

1.2.2柑橘皮渣化學(xué)組成的測定

(1) 水分：參照文獻(xiàn)[17]。

(2) 總灰分：參照文獻(xiàn)[18]1-2。

(3) 脂類：參照文獻(xiàn)[18]43-46。

(4) 粗蛋白：參照文獻(xiàn)[18]34-42。

(5) 可溶性糖：參照文獻(xiàn)[19]。

(6) 可提多酚：根據(jù)Sánchez-Alonso等[10]方法，修改如下：樣品液的制備：稱取1.000 0 g柑橘皮渣粉(干重)，加入40 mL甲醇/水(體積比1∶1)，用HCl(3 mol/L)調(diào)pH至2.0。將混合體系在室溫攪拌1 h，之后以2 500×g離心10 min，收集上清液。向所得殘渣中加入40 mL丙酮/水(體積比7∶3)，在室溫下振蕩1 h，再以2 500×g離心10 min，重復(fù)兩次操作。將所得上清液合并，于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥后溶解于10 mL無水乙醇。

多酚的測定：取樣品液0.1 mL，加入2 mL蒸餾水和1 mL Folin-Ciocalteu試劑(稀釋10倍)，室溫靜置6 min后，向混合體系中加入0.9 mL 75 mg/mL的Na2CO3溶液，定容至10 mL。混合體系靜置2 h后，于波長750 nm處測定吸光值，用蒸餾水作為空白對照。總多酚的量用沒食子酸當(dāng)量(GAE，mg/g·干重)來表示。

(7) 水溶性膳食纖維：參照AOAC法[20]。

(8) 非水溶性抗氧化膳食纖維的制備：參照Hassan等[20]方法，修改如下：稱取脫脂的干燥樣1.000 0 g，溶于50 mL pH 6.0(0.2 mol/L)的PBS中，加入0.2 mL的α-淀粉酶溶液(50 mgα-淀粉酶溶解于1 mL pH 6.0的PBS中)，蓋上鋁箔，于60 ℃磁力攪拌15 min，然后從水浴中移出，冷卻到室溫。用0.325 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)混合體系pH至2.0～3.0，加入0.2 mL的蛋白酶溶液(50 mg蛋白酶溶解于1 mL pH 6.0的PBS中)，蓋上鋁箔，于38 ℃磁力攪拌0.5 h，去除樣品中的蛋白質(zhì)。待樣品冷卻至室溫，用0.275 mol/L的NaOH(約10 mL)將上述溶液pH調(diào)節(jié)至4.0～4.5，加入0.3 mL/g糖化酶溶液1 mL，60 ℃水浴30 min，將所得的混合體系過濾，過濾后所得的殘渣分別用蒸餾水、丙酮洗滌，于105 ℃烘至恒重即可(最終的結(jié)果應(yīng)當(dāng)用樣品中殘留的不能消化的蛋白質(zhì)的含量和灰分的含量進(jìn)行校正，總膳食纖維是消化后的殘留物的質(zhì)量減去不能消化的蛋白質(zhì)和灰分質(zhì)量的差值)。

1.2.3單因素試驗

(1)α-淀粉酶作用時間：考察α-淀粉酶作用時間分別為5，10，15，20，25 min時，對IADF抗氧化性的影響。其他反應(yīng)條件為：料液比50∶1(mL/g)，α-淀粉酶溶液用量0.1 mL/g·皮渣，α-淀粉酶作用溫度60 ℃，用HCl調(diào)節(jié)pH至2.0～3.0，蛋白酶溶液用量0.1 mL/g·皮渣，38 ℃水浴30 min，NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至4.2～4.6，糖化酶溶液0.3 mL/g，60 ℃水浴30 min。

(2) 蛋白酶作用時間：考察38 ℃蛋白酶作用時間分別為5，10，15，20，25 min時，對IADF抗氧化性的影響。α-淀粉酶作用時間為15 min，其他反應(yīng)條件同1.2.3(1)。

(3) 糖化酶作用時間：考察60 ℃糖化酶作用時間分別5，10，15，20，25 min時，對IADF抗氧化性的影響。蛋白酶用作用時間為10 min，其他反應(yīng)條件同1.2.3(2)。

(4)α-淀粉酶溶液用量：考察α-淀粉酶溶液用量分別為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mL/g·皮渣時，對IADF抗氧化性的影響。糖化酶作用時間為10 min，其他反應(yīng)條件同1.2.3(3)。

(5) 酸性蛋白酶溶液用量：考察蛋白酶溶液用量分別為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mL/g·皮渣時，對IADF抗氧化性的影響。α-淀粉酶溶液用量為0.1 mL/g·皮渣，其他反應(yīng)條件同1.2.3(4)。

(6) 糖化酶用量：考察糖化酶溶液用量分別為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mL/g·皮渣時，對IADF抗氧化性的影響。酸性蛋白酶溶液用量為0.20 mL/g·皮渣，其他反應(yīng)條件同1.2.3(5)。

(7) 料液比：考察料液比分別為30∶1，35∶1，40∶1，45∶1，50∶1(mL/g)時，對IADF抗氧化性的影響。糖化酶溶液用量為0.15 mL/g·皮渣，其他反應(yīng)條件同1.2.3(6)。

(8)α-淀粉酶作用溫度：考察α-淀粉酶作用溫度分別為50，55，60，65，70 ℃時，對IADF抗氧化性的影響。其他反應(yīng)條件同1.2.3(7)，料液比為35∶1(mL/g)。

(9) 糖化酶作用溫度：考察糖化酶作用溫度分別為50，55，60，65，70 ℃時，對IADF抗氧化性的影響。α-淀粉酶作用溫度為65 ℃，其他反應(yīng)條件同1.2.3(8)。

1.2.4試驗優(yōu)化設(shè)計采用中心組合試驗設(shè)計(central composite design，CCD)原理，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，以抗氧化性為響應(yīng)值，對α-淀粉酶溶液用量、α-淀粉酶作用時間、蛋白酶作用時間、糖化酶溶液用量和糖化酶作用時間進(jìn)行優(yōu)化。在α-淀粉酶用量(0.1 mL/g·皮渣)與作用時間(15 min)、蛋白酶作用時間(10 min)、糖化酶用量(0.15 mL/g·皮渣)與作用時間(10 min)固定條件下，考察料液比、酸性蛋白酶用量、淀粉酶作用溫度、糖化酶作用溫度對DPPH自由基清除率的影響。

1.2.5非水溶性抗氧化膳食纖維對DPPH·的清除能力

采用以下基于固體粉末抗氧化測定的方法對IADF中結(jié)合態(tài)多酚的抗氧化性進(jìn)行評價。試驗均以溶于乙醇的Trolox溶液作為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品抗氧化能力用Trolox等價抗氧化能力(Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC)表示，即Trolox μmol/g IADF(干重)，乙醇作為空白對照。

測定方法根據(jù)Serpen等[21]報道，修改如下：取10 mg IADF，加入1.7 mL DPPH·試劑以進(jìn)行反應(yīng)[0.024 mg/mL的DPPH乙醇(95%)溶液]。測定操作以DPPH·的加入為起始，待混合物反應(yīng)0，15，25 min時分別振蕩3 min，使得樣品與DPPH試劑充分反應(yīng)。將該混合物以9 200×g離心2 min，收集上清液于734 nm處比色，測定吸光值。測定總時間準(zhǔn)確控制為30 min。

1.2.6數(shù)據(jù)處理用SPSS16.0和Design Expert 7.1 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。方差分析(P<0.05為顯著差異)，用Turkey’s HSD進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2　結(jié)果與討論

2.1柑橘皮渣中的化學(xué)成分

由表1可知，柑橘皮渣中總可提取酚含量有(2.56±0.03)%，可溶性糖含量約占35%，基本與前人結(jié)果一致。膳食纖維含量近80%，其中可溶性膳食纖維略高于王菁等[22]的研究結(jié)果，可能是此次試驗材料不是純的柑橘皮，還包括榨汁后的瓤肉。

表1　柑橘皮渣中的化學(xué)成分

2.2優(yōu)化試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，按照中心組合試驗設(shè)計，設(shè)定不同料液比、蛋白酶加入量、淀粉酶作用溫度以及糖化酶作用溫度(見表2)，進(jìn)行四因素五水平的優(yōu)化試驗，結(jié)果見表3。對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得抗氧化性(Y)的二次多項回歸方程為：

(1)

表2　中心組合設(shè)計因素水平表

表3　抗氧化性的中心組合試驗方案與結(jié)果

由圖1(a)可知，在料液比小于35.7∶1(mL/g)時，隨著料液比的增加，產(chǎn)品抗氧化性IADF的抗氧化性增加。當(dāng)料液比大于35.7∶1(mL/g)以后，抗氧化性隨著其用量增加有降低的趨勢。同時，隨著蛋白酶量的增加，更有利于IADF的提取，但當(dāng)酶加入過多時(>0.21 mL/g·皮渣)，抗氧化性出現(xiàn)下降的趨勢。

由圖1(b)可知，當(dāng)料液比一定時，淀粉酶作用溫度的升高能夠促進(jìn)所提IADF的抗氧化性；當(dāng)?shù)矸勖缸饔脺囟纫欢〞r，隨著料液比的增加，所提IADF的抗氧化性明顯增高。在料液比34.68∶1(mL/g)，淀粉酶作用溫度達(dá)66.6 ℃時，IADF的DPPH·清除率出現(xiàn)最大值。

由圖1(c)可知，當(dāng)料液比一定時，隨著糖化酶作用溫度的升高，所提IADF的抗氧化性呈上升趨勢；但溫度過高后，可能會導(dǎo)致DF中的抗氧化物質(zhì)如酚類被溶出，或者所提IADF中的結(jié)合酚被破壞。

圖1　料液比、蛋白酶用量、淀粉酶作用溫度、糖化酶作用溫度交互響應(yīng)面圖

方差來源平方和自由度均方F值P值模型23.81141.707.700.0002**X11.2011.205.410.0345*X21.3611.366.150.0255*X32.7812.7812.580.0029**X40.09110.0910.410.5299X1X20.3310.331.500.2400X1X32.2812.2810.340.0058**X1X40.6010.602.720.1198X2X30.09610.0960.430.5200X2X40.2110.210.930.3494X3X43.6713.6716.620.0010**X211.6711.677.560.0149*X222.0312.039.210.0084**X231.7211.727.770.0138*X249.1419.1441.38<0.0001**殘差3.31150.22失擬2.97100.303.610.0596純誤差0.3450.069總變異27.1229

?**為差異極顯著(P<0.01)；*為差異顯著(P<0.05)。

由圖1(d)可知，當(dāng)?shù)矸勖缸饔脺囟瓤刂圃?6.5 ℃以下時，提高蛋白酶加入量，IADF的抗氧化性有上升的趨勢，當(dāng)?shù)鞍酌赣昧窟^高，會阻礙所提IADF抗氧化性的發(fā)揮。

由圖1(e)可知，當(dāng)?shù)鞍酌讣尤肓恳欢〞r，隨著糖化酶作用溫度的增加，能夠有效地提取IADF，并且很可能對其結(jié)合的酚類等抗氧化物質(zhì)起到活化作用。

由圖1(f)可知，淀粉酶作用溫度一定時，隨著糖化酶作用溫度的升高，IADF的抗氧化性上升。當(dāng)?shù)矸勖傅淖饔脺囟燃s在67 ℃，糖化酶作用溫度約在64 ℃時，IADF的DPPH清除率出現(xiàn)最大值。

利用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化，得優(yōu)化條件為：料液比33.58∶1(mL/g)，蛋白酶用量0.21 mL/g·皮渣，淀粉酶作用溫度67 ℃，糖化酶作用溫度64 ℃。對此優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗證實驗，測得產(chǎn)品抗氧化性為3.520 mmol Trolox/100 g IADF，與預(yù)測值(3.556 mmol Trolox/100 g IADF)基本一致，再次驗證了回歸方程的正確性(相對誤差1%)。

ADF的抗氧化性主要依賴于其中所含的多酚類物質(zhì)，這些多酚物質(zhì)分為可提取多酚(EPP)和不可提取多酚(NEPP)，其中EPP較易提取，且具有很強(qiáng)的抗氧化活性[10]，而NEPP一般與膳食纖維、細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)結(jié)合緊密，難溶于有機(jī)溶劑和水。多數(shù)學(xué)者[7,23]將抗氧化膳食纖維的抗氧化功能歸結(jié)于其中的EPP，但也有學(xué)者[12]通過研究其中的NEPP發(fā)現(xiàn)，NEPP 猝滅過氧化自由基方面比單體酚有效15～30倍。目前來講，文獻(xiàn)對EPP和NEPP活性的報道不完全一致，推測其原因可能是與其中所含酚類的種類和含量有關(guān)。

3　結(jié)論

酶法能夠有效提取柑橘皮渣中的IADF。優(yōu)化試驗表明料液比33.58∶1(mL/g)，蛋白酶用量0.21 mL/g·皮渣，淀粉酶作用溫度67 ℃，糖化酶作用溫度64 ℃條件下，所提取的IADF抗氧化效果最顯著，為3.520 mmol Trolox /100 g IADF。該研究從“ADF”這一概念出發(fā)，以IADF的抗氧化性為指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)化，此內(nèi)容尚未見有報道。因此，本課題的研究將為包括柑橘皮渣在內(nèi)的植物性食品中IADF及其產(chǎn)品的研發(fā)、應(yīng)用與推廣提供理論參考和創(chuàng)新依據(jù)。除此之外，由于柑橘皮渣中IADF抗氧化活性可能與其中所含的酚類以及吸附螯合有機(jī)物的理化特性相關(guān)，具體的作用機(jī)理也將是日后進(jìn)一步研究的方向。

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The optimization of extraction process of insoluble antioxidant dietary fiber from orange pomace

XUE Shan

(College of Biological Science and Technology, Minnan normal university, Zhangzhou, Fujian 363000, China)

The enzymes-chemical method was used to extract the insoluble antioxidant dietary fiber (IADF) from the remaining orange pomace after oppressing juice. The single factor experiment and response surface optimization have carried out considering the clearance rate of DPPH free radical as the indicator. The results of response surface showed that the clearance rate of free radicals was best in the condition of liquid ratio 33.58 mL/g, protease dosage of 0.21 mL/g, amylase temperature of 67 ℃ and glucoamylase temperature of 64 ℃, and highest value was up to 3.520 mmol Trolox/100 g IADF.Key words: orange; pomace; insoluble dietary fiber; antioxidant

2015年福建省科協(xié)科技思想庫研究項目(決策咨詢類)重點項目(編號：FJKX-A1520)；閩南師范大學(xué)博士科研啟動基金(編號：2006L21513)

薛山(1988—)，女，閩南師范大學(xué)講師，博士。

E-mail: yixunchenglion@sina.com

2015—12—30

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.037