王 艷，田紅梅，張 建，王明霞，賈 利，方 凌

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所 合肥 230031）

番茄是全球最重要的蔬菜之一，番茄紅素是決定番茄果實(shí)外觀顏色的最主要的物質(zhì)，同時(shí)還是重要的功能性營養(yǎng)物質(zhì)，是目前自然界中發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)抗氧化劑，可有效地減少單線態(tài)氧和氧自由基對(duì)人體自身免疫系統(tǒng)的侵害。番茄果實(shí)在低溫等條件下番茄紅素合成受阻導(dǎo)致轉(zhuǎn)色困難是生產(chǎn)上至今未攻克的難題。目前番茄紅素的生物合成途徑已基本清楚[1-2]，其中關(guān)鍵酶基因PSY和PDS已于1992年得到闡明[3-4]，對(duì)番茄植株生長過程中這2種基因表達(dá)的跟蹤研究表明，在番茄果實(shí)發(fā)育過程中，PSY表達(dá)量增加了20倍，PDS表達(dá)增加量則少于3倍[5]。果實(shí)中番茄紅素合成受諸多因素影響[6]。在前期的研究中，筆者初步探索了低溫條件對(duì)番茄紅素積累及其關(guān)鍵酶的影響[7]，本研究旨在前期研究的基礎(chǔ)上繼續(xù)探討外源物質(zhì)（K+、Mn2+）對(duì)番茄紅素關(guān)鍵酶（PSY1、PSY2、PDS、ZDS）基因表達(dá)量的影響，為解決低溫條件下番茄轉(zhuǎn)色困難這一對(duì)生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響的難題提供新的解決思路及途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所培育的番茄高代穩(wěn)定自交系‘T-CRH-13’。

1.2 方法

于2014年1月20日播種于安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，穴盤育苗，3月22日定植，留3穗果打頂。從植株第一穗果果實(shí)膨大期開始，以清水為對(duì)照，澆施 240mg·L-1K2SO4（處理 1）、噴施0.1%MnSO4（處理2），每7 d處理1次，至果實(shí)膨大結(jié)束，采用隨機(jī)區(qū)組處理，每處理設(shè)3個(gè)小區(qū)，每小區(qū)12株，分5個(gè)時(shí)期采樣，根據(jù)果實(shí)成熟度標(biāo)準(zhǔn)在各小區(qū)隨機(jī)采樣，采樣標(biāo)準(zhǔn)：第1個(gè)時(shí)期為青熟期，果頂泛白；第2個(gè)時(shí)期為轉(zhuǎn)色期，果頂由白變紅；第3個(gè)時(shí)期為半熟期，果實(shí)一半轉(zhuǎn)色；第4個(gè)時(shí)期為堅(jiān)熟期，整果著色，果實(shí)堅(jiān)硬；第5個(gè)時(shí)期為完熟期，果實(shí)紅熟變軟（圖1）。每處理每小區(qū)取3～4果，將整果果肉（含果皮）打碎后混合取樣待測。

圖1 果實(shí)轉(zhuǎn)色的5個(gè)時(shí)期

采用分光光度計(jì)法和real-time實(shí)時(shí)熒光定量法測量果實(shí)轉(zhuǎn)色的各個(gè)時(shí)期果實(shí)內(nèi)番茄紅素含量及PSY1、PSY2、PDS、ZDS的基因表達(dá)量。基因的相對(duì)定量分析采用ABI（Applied Biosystems）7500 Real Time PCR System進(jìn)行，所用引物見表1，每個(gè)樣品3次技術(shù)重復(fù)。以Actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行分析。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 K+處理后果實(shí)番茄紅素含量及合成途徑中關(guān)鍵酶的變化

2.1.1 K+處理后番茄紅素含量的動(dòng)態(tài)變化 K+處理后果實(shí)中番茄紅素含量均隨果實(shí)成熟度增加而不斷增加，與對(duì)照的番茄紅素含量積累趨勢相似，且K+處理下的番茄紅素含量在果實(shí)發(fā)育的前2個(gè)時(shí)期積累緩慢，轉(zhuǎn)色期后積累迅速，在果實(shí)進(jìn)入完熟期之前，其番茄紅素含量一直低于對(duì)照，至完熟期才明顯高于對(duì)照。對(duì)照與處理番茄紅素積累高峰期是一致的，均在轉(zhuǎn)色期至堅(jiān)熟期（圖2）。

圖2 K+處理后果實(shí)不同成熟期番茄紅素含量的變化

2.1.2 K+處理后番茄紅素關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化 如圖3所示，在完熟期之前，K+處理后果實(shí)不同成熟期的番茄紅素關(guān)鍵酶PSY1、PSY2以及ZDS基因表達(dá)量均低于對(duì)照，其中PDS基因表達(dá)量在堅(jiān)熟期始高于對(duì)照，完熟期時(shí)PSY1、PSY2、ZDS以及PDS基因表達(dá)量均高于對(duì)照，這與K+處理后番茄紅素含量的積累規(guī)律是相似的，說明在果實(shí)完熟期之前K+可能通過某些作用抑制了這幾種酶的基因表達(dá)從而影響了果實(shí)中番茄紅素含量在這些階段的積累，使得番茄紅素含量低于對(duì)照，之后調(diào)控作用消失或者調(diào)控方向由負(fù)調(diào)控向正調(diào)控轉(zhuǎn)化，從而使得番茄紅素大量快速積累，至完熟期明顯高于對(duì)照。

圖3 K+處理后果實(shí)不同成熟期番茄紅素關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化

2.2 Mn2+處理后果實(shí)中番茄紅素含量及其關(guān)鍵酶的動(dòng)態(tài)監(jiān)測

2.2.1 Mn2+處理后果實(shí)中番茄紅素含量的動(dòng)態(tài)變化

圖4 Mn2+處理后果實(shí)不同成熟期番茄紅素含量的變化

由圖4可以看出，Mn2+處理后果實(shí)不同成熟期的番茄紅素含量在整個(gè)果實(shí)轉(zhuǎn)色過程中雖然是一直上升的，但均低于對(duì)照水平，這與有些文獻(xiàn)中報(bào)道的試驗(yàn)結(jié)果不一致。對(duì)照條件下，番茄紅素迅速積累及在轉(zhuǎn)色期至堅(jiān)熟期，而Mn2+處理下的番茄果實(shí)中番茄紅素含量快速積累期在堅(jiān)熟期至完熟期，這說明在本試驗(yàn)中，Mn2+處理后番茄紅素積累的高峰期延遲，并且降低了番茄紅素含量的整體水平。

2.2.2 Mn2+處理后果實(shí)的番茄紅素關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化 從圖5可以看出，Mn2+處理后果實(shí)不同成熟期的各番茄紅素關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的變化規(guī)律不同。其中PSY2隨轉(zhuǎn)色程度的加深而逐漸升高，PSY1從青熟期至轉(zhuǎn)色期有較大幅度的升高，之后有所下降，在半熟期后逐漸升高，轉(zhuǎn)色期與完熟期2個(gè)時(shí)期的PSY1基因表達(dá)量差異不明顯，Mn2+處理后的番茄果實(shí)其完熟期PSY1、PSY2的基因表達(dá)量均高于對(duì)照水平；而Mn2+處理后番茄果實(shí)中的PDS、ZDS基因表達(dá)量水平在5個(gè)轉(zhuǎn)色時(shí)期均明顯低于對(duì)照水平，這可能是造成其番茄紅素含量低于對(duì)照水平的主要原因。

圖5 Mn2+處理后果實(shí)不同成熟期番茄紅素關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化

3 討論與結(jié)論

前人研究表明，K+與Mn2+處理可使果實(shí)中的番茄紅素含量增加[8-10]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，K+在調(diào)控果實(shí)中番茄紅含量積累上起到了一定的作用，且在不同發(fā)育時(shí)期調(diào)控效果是不同的，在果實(shí)轉(zhuǎn)色的前4個(gè)時(shí)期，番茄紅素含量一直低于對(duì)照，即在轉(zhuǎn)色前幾個(gè)階段，K+對(duì)番茄果實(shí)中番茄紅素的積累并未起到促進(jìn)作用，堅(jiān)熟期至完熟期，正向調(diào)控作用才充分發(fā)揮出來，在番茄果實(shí)不同的轉(zhuǎn)色階段，K+發(fā)揮的調(diào)控作用是不同的，堅(jiān)熟期之前是抑制了八氫番茄紅素向番茄紅素轉(zhuǎn)化過程中PSY1、PSY2、ZDS以及PDS這些關(guān)鍵酶基因的表達(dá)而使得番茄紅素含量減少，堅(jiān)熟期之后這些關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量有了快速的升高，從而番茄紅素也大量積累，明顯高于對(duì)照，這也說明了K+不僅參與了整個(gè)番茄紅素合成途徑的八氫番茄紅素脫氫過程，而且參與了從八氫番茄紅素合成六氫番茄紅素，再脫飽和至ζ-胡蘿卜素、鏈孢紅素的過程中（圖 6）[11-12]。

圖6 番茄紅素合成途徑圖

GGPS活性依賴PSY，Mn2+是決定GGPS用來合成類胡蘿卜素還是其他類異戊二烯產(chǎn)物的關(guān)鍵調(diào)控因子，對(duì)番茄紅素的合成至關(guān)重要。PSY是控制番茄紅素合成的一個(gè)限速酶基因，控制著GGPP向八氫番茄紅素的轉(zhuǎn)化，PSY催化八氫番茄紅素的形成依賴Mn2+[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，Mn2+處理后的PSY基因表達(dá)量并不是在果實(shí)轉(zhuǎn)色的每個(gè)時(shí)期都高于對(duì)照，而是在堅(jiān)熟期后至完熟期高于對(duì)照，而其他2個(gè)酶PDS、ZDS基因表達(dá)量則一直低于對(duì)照，從而使番茄紅素積累至完熟期仍低于對(duì)照，這與前人的研究中適宜濃度的錳肥葉面噴施可以提高番茄果實(shí)中的番茄紅素含量的結(jié)論相異。

果實(shí)發(fā)育堅(jiān)熟期至完熟期可通過K+調(diào)控而使該階段的番茄紅素含量迅速積累，在果實(shí)發(fā)育的不同階段，K+所表現(xiàn)出的對(duì)番茄紅素積累的不同調(diào)控方向，說明K+在番茄紅素合成的過程中所起到的作用可能不僅僅是調(diào)控PSY1、PSY2、ZDS以及PDS這些酶，深入的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步的試驗(yàn)探索；不同番茄材料對(duì)Mn2+的調(diào)控響應(yīng)存在差異，是否與材料的基因型差異有關(guān)還需要進(jìn)一步探索。