林志豪 ，鄧鈺宏 ，趙 靜

（1．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 廣州 510642； 2.廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院 廣州 510520）

黃瓜（Cucumis sativus L.）別名胡瓜、青瓜，屬于葫蘆科黃瓜屬草本植物，在國內(nèi)外廣泛種植，同時它也是重要的設(shè)施蔬菜主栽種類之一，在全球蔬菜供應(yīng)中占有舉足輕重的地位。受抗性基因資源匱乏的限制，傳統(tǒng)黃瓜育種方法很難快速得到具有抗性的優(yōu)良品種。黃瓜基因組測序的完成[1]，為黃瓜遺傳育種提供了重要的基因資源庫。要對此基因?qū)殠爝M行挖掘、篩選重要的基因資源，黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化方法顯得尤為重要。

發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物后，通過所含Ri質(zhì)粒的T-DNA在植物細(xì)胞基因組中整合并表達，獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根[2]。毛狀根能在無激素的培養(yǎng)基上生長，合成Ri T-DNA的表達產(chǎn)物冠癭堿，并能自發(fā)或人工誘導(dǎo)再生植株[3]。利用轉(zhuǎn)基因毛狀根對興趣基因進行功能分析，可大大縮短以往依賴于根癌農(nóng)桿菌進行遺傳轉(zhuǎn)化所要的時間，利于對興趣基因的功能研究，挖掘出可利用的基因資源。目前，利用發(fā)根農(nóng)桿菌進行基因的功能研究在許多植物上都有報道，如大豆[4]、番茄[5]、苜蓿[6]、高麗參[7]、西洋參[8]等。

利用發(fā)根農(nóng)桿菌對黃瓜進行遺傳轉(zhuǎn)化始于1991年，McInnes等[9]用含Ri T-DNA的發(fā)根農(nóng)桿菌侵染黃瓜子葉外植體，誘導(dǎo)出毛狀根。隨后發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)黃瓜毛狀根形成的遺傳轉(zhuǎn)化體系得到不斷優(yōu)化和完善。1997年，施和平等[10]研究了乙酰丁香酮對發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化黃瓜的影響，發(fā)現(xiàn)用添加乙酰丁香酮活化培養(yǎng)的菌液感染黃瓜子葉外植體生根更快；次年，該研究團隊用2種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株（R1000和R1601）侵染子葉外植體，成功獲得毛狀根，結(jié)果表明，含不同質(zhì)粒的農(nóng)桿菌誘導(dǎo)黃瓜子葉發(fā)生的毛狀根的形態(tài)和種類不同[11]；2000年他們又對黃瓜毛狀根形成過程中合適的外植體年齡和蔗糖濃度進行了研究，發(fā)現(xiàn)10 d苗齡的子葉外植體產(chǎn)生毛狀根的能力最強，外植體毛狀根誘導(dǎo)率為88.89%，隨著外植體年齡的增強，發(fā)根率減弱，直到不發(fā)根；培養(yǎng)基中添加2%、3%或4%的蔗糖可以顯著提高子葉外植體的毛狀根誘導(dǎo)率[12]。馮斌等[13]用發(fā)根農(nóng)桿菌A4對‘津研4號’黃瓜的子葉和下胚軸進行誘導(dǎo)，得到了再生植株，轉(zhuǎn)化植株的GUS染色檢測呈陽性，但毛狀根的芽分化率較低，再生率為1.6%。

對于同一物種的不同基因型，其體細(xì)胞胚發(fā)生的難易程度和發(fā)生頻率存在差別[14]，故不同基因型材料毛狀根誘導(dǎo)的適宜方法會有差異。‘中國龍’是用于黃瓜全基因組測序的品種[1]，前期的初步試驗發(fā)現(xiàn)，利用現(xiàn)有的黃瓜毛狀根誘導(dǎo)方法[11，15]，‘中國龍’毛狀根的誘導(dǎo)不穩(wěn)定、誘導(dǎo)率低，甚至出現(xiàn)不能誘導(dǎo)的現(xiàn)象。同時，以往的黃瓜毛狀根誘導(dǎo)體系中，大都是用 HgCl2為表面消毒劑[11，15]，考慮到 HgCl2的毒性，以及對環(huán)境的污染，探索其他合適的滅菌方法是非常有必要的，于是本文在以往建立起來的黃瓜毛狀根誘導(dǎo)體系的基礎(chǔ)上，從種子滅菌、共培養(yǎng)時間和菌液濃度3方面進行探索，建立一套適合于‘中國龍’的毛狀根誘導(dǎo)體系，可為今后分析黃瓜基因功能、挖掘黃瓜優(yōu)良基因提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌菌株及培養(yǎng)

試驗所用發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株為K599，由澳大利亞昆士蘭大學(xué)Peter Gresshoff教授惠贈。在侵染黃瓜子葉前，將活化好的農(nóng)桿菌單菌落接種于YEP培養(yǎng)基中，28℃振蕩暗培養(yǎng)16 h，待用。

1.2 植物材料

試驗材料為黃瓜測序品種‘中國龍’，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所黃三文研究員惠贈。

1.3 試驗所用培養(yǎng)基

共培養(yǎng) MS 培養(yǎng)基[16]：KNO31 900 mg·L-1、NH4NO31 650 mg·L-1、MgSO4·7H2O 370 mg·L-1、CaCl2332 mg·L-1、KI 0.83 mg·L-1、H3BO36.2 mg·L-1、MnSO4·4H2O 22.3 mg·L-1、ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg· L-1、CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1、EDTA-Fe 0.036 71 mg·L-1、KH2PO4170 mg·L-1、肌醇 100 mg·L-1、甘氨酸 2 mg·L-1、鹽酸硫酸素 0.1 mg·L-1、鹽酸吡哆素 0.5 mg·L-1、煙酸 0.5 mg·L-1、蔗糖 3%、植物膠0.3%，pH 調(diào)至 5.5～5.8。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基及繼代培養(yǎng)基：在共培養(yǎng)MS平板培養(yǎng)基中加入羧芐青霉素，最終配置成含羧芐青霉素（500mg·L-1）的 MS 平板培養(yǎng)基。

1.4 種子滅菌方法

在超凈工作臺中，將挑選出的飽滿種子用75%（φ，后同）乙醇消毒30 s，再用3個不同濃度的NaC-lO消毒液（濃度分別為1%、5%、10%）分別滅菌5、10、15、20 min，然后用無菌水漂洗4或5次，種植于已滅菌的墊有MS營養(yǎng)液潤濕的棉花的生長瓶中。每個生長瓶播10粒種子，每處理設(shè)置12個重復(fù)。置于24℃暗培養(yǎng)2 d，然后移入光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)8 d，溫度為白天24℃，夜晚24℃，每天12 h光照。

1.5 不同菌液侵染濃度處理

挑取活化后的單克隆菌落，接種到5 mL YEP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，用MS液體培養(yǎng)基稀釋菌液濃度至 OD600值分別為 0.4、0.6、0.8和 1.2，待用。

在超凈工作臺上，取萌發(fā)10 d的黃瓜無菌苗子葉，用滅過菌的手術(shù)刀在子葉葉柄邊緣處將黃瓜子葉切成2個外植體。將手術(shù)刀浸入至活化過的、調(diào)好OD600值的菌液中，再將沾有發(fā)根農(nóng)桿菌菌液的手術(shù)刀在黃瓜子葉表面輕輕地縱向和橫向劃若干刀口，每劃幾刀將手術(shù)刀放至菌液中浸泡，以保證傷口處都有菌液侵染到。然后使其傷口面朝下，接至準(zhǔn)備好的、鋪有濾紙的共培養(yǎng)MS平板培養(yǎng)基中（傷口面接觸濾紙），在26℃、光照條件下培養(yǎng)2 d。將培養(yǎng)好的受感染的黃瓜子葉外植體，傷口面朝上（切面不與培養(yǎng)基接觸），轉(zhuǎn)入準(zhǔn)備好的毛根誘導(dǎo)用MS平板培養(yǎng)基，在24℃、遮光條件下暗培養(yǎng)。時常觀察根毛生長狀況。

1.6 共培養(yǎng)處理時間處理

用活化好的菌液調(diào)至OD600為1.2左右來侵染黃瓜幼苗，將侵染后的外植體置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，先在26℃、光照條件下分別共培養(yǎng)2 d、3 d，再轉(zhuǎn)入準(zhǔn)備好的毛根誘導(dǎo)用MS平板培養(yǎng)基上，在24℃、遮光條件下暗培養(yǎng)。觀察不同共培養(yǎng)時間對黃瓜毛狀根誘導(dǎo)的影響。

1.7 毛狀根rolC基因的PCR擴增

利用Roger和Bendich的CTAB法[17]提取所獲得毛狀根的DNA，再利用文獻報道rolC基因引物[8]，擴增毛狀根中的rolC基因，上游引物rolC-F：ATGGCGGAATTTGACCTATG，下游引物 rolC-R：TTAGTTCCATCTGCCCATCC。

PCR擴增反應(yīng)體積為 20 μL，其中包括 10 μL Taq DNA 聚合酶，0.6 μL 10 μmol·L-1PCR 引物，和約0.2 μg DNA。用PTC-100型PCR擴增儀進行擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序為：94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 30 s，共 30個循環(huán)，72℃總延伸 10min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌條件對于黃瓜‘中國龍’種子萌發(fā)的影響

摒棄對人畜有劇毒的滅菌劑升汞，試驗采用75%的乙醇與不同濃度的次氯酸鈉相結(jié)合的方法對‘中國龍’進行種子滅菌。結(jié)果表明，當(dāng)次氯酸鈉濃度低時，種子出現(xiàn)長菌的情況；提高次氯酸鈉的濃度，可以減少種子長菌的情況，但會抑制種子的萌發(fā)。統(tǒng)計各處理條件下能正常萌發(fā)的無菌苗的比例，結(jié)果如圖1所示，當(dāng)次氯酸鈉濃度為1%時，培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)長菌情況，萌發(fā)率在73%到89%之間；而當(dāng)次氯酸鈉濃度提高到10%時，種子長菌的情況減少，但黃瓜種子可能由于受到傷害，萌發(fā)受到抑制，萌發(fā)率僅在78%到85%之間；當(dāng)次氯酸鈉濃度為5%，滅菌時間為5 min或10 min時，黃瓜種子的萌發(fā)率最高，均為96%。因此，先使用75%的乙醇處理種子30 s，再用5%的次氯酸鈉滅菌5～10 min，是獲取黃瓜‘中國龍’無菌幼苗的較好的滅菌方式。

圖1 不同滅菌條件對黃瓜萌發(fā)的影響

2.2 不同菌液濃度對黃瓜‘中國龍’毛狀根誘導(dǎo)的影響

菌液的OD600值反映了菌液的濃度，不同OD600值的菌液對于黃瓜毛狀根誘導(dǎo)的影響差異顯著。如表1可知，當(dāng)OD600值小于0.8時，毛狀根誘導(dǎo)率較低，在21.24%～57.69%之間。OD600值為1.2時，黃瓜毛狀根誘導(dǎo)率大大提高，為70.83%。故本試驗中，菌液的OD600值在1.2左右時，是適合侵染的菌液濃度。

表1 不同濃度菌液對黃瓜毛狀根誘導(dǎo)的影響

2.3 不同共培養(yǎng)時間對于黃瓜‘中國龍’毛狀根誘導(dǎo)的影響

共培養(yǎng)時間是用菌液侵染外植體后，讓發(fā)根農(nóng)桿菌在沒有加抗生素的環(huán)境下與外植體共同生長的時間。研究發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)的過程利于菌液的侵染，共培養(yǎng)時間為2 d時，外植體容易長出毛狀根，而受到農(nóng)桿菌的污染較少，污染率僅為5.26%（表2）。但當(dāng)共培養(yǎng)時間超過2 d，農(nóng)桿菌的生長旺盛，后期難以抑制（圖版-a～b），農(nóng)桿菌的污染率達到了84.85%（表 2）。

表2 不同共培養(yǎng)時間對外植體農(nóng)桿菌污染的影響

2.4 黃瓜‘中國龍’毛狀根的誘導(dǎo)、生長狀況及鑒定

以黃瓜‘中國龍’子葉為外植體，在上述優(yōu)化條件下，可獲得大量毛狀根（圖版-c～g）。

以T-DNA上的rolC基因為檢測對象，隨機選取7條從不同外植體上誘導(dǎo)出的毛狀根來抽取DNA，進行PCR擴增。在誘導(dǎo)獲得的毛狀根中都擴增出期望大小的rolC基因片段，該片段與從發(fā)根農(nóng)桿菌K599的Ri質(zhì)粒DNA中擴增出的特異性片段大小相同，而非轉(zhuǎn)化毛狀根的DNA未擴增出任何DNA條帶（圖2），表明發(fā)根農(nóng)桿菌上的Ri T-DNA已整合到黃瓜的毛狀根基因組中，獲得的毛狀根為轉(zhuǎn)基因根。

圖2 毛狀根rolC基因的電泳檢測

3 討論與結(jié)論

以往所建立黃瓜毛狀根誘導(dǎo)體系中，大多采用升汞（HgCl2）進行種子消毒[10-12]。升汞具有殺菌力強，滲透性好的特點，但對人畜有劇毒，且升汞滅菌后，較難徹底地清除殘留的汞。本試驗利用乙醇和次氯酸鈉相結(jié)合的方法，探索了用不同濃度次氯酸鈉（1%、5%和 10%）分別滅菌 5、10、15、20 min，觀察種子污染和萌發(fā)的情況。結(jié)果表明，低濃度的次氯酸鈉無法徹底進行種子的表面消毒，種子出現(xiàn)長菌污染的情況；而高濃度的次氯酸鈉則會傷害種子，導(dǎo)致種子萌發(fā)率降低。而在5%次氯酸鈉中消毒5～10 min的效果較好，污染少且萌發(fā)率高。所以本試驗最終采用75%的乙醇先處理種子30 s，再用5%的次氯酸鈉滅菌5～10 min的種子消毒方法。

菌液濃度對誘導(dǎo)效果表現(xiàn)出一定的影響，過高或過低的菌液濃度都不利于毛狀根的誘導(dǎo)。徐明芳等[19]在研究大苞栝樓毛狀根誘導(dǎo)體系時，發(fā)現(xiàn)其毛狀根的誘導(dǎo)率與菌液濃度在一定范圍內(nèi)呈線性上升關(guān)系，而隨著菌液濃度的增大又呈現(xiàn)非線性下降關(guān)系，認(rèn)為這是因為在一定菌液濃度范圍內(nèi)，菌細(xì)胞越多越能增加感染的位點，有更多的菌株的質(zhì)粒能夠整合在外植體的基因組中，菌液濃度過高后對外植體細(xì)胞有損傷，毛狀根誘導(dǎo)率反而下降，菌液OD600值為0.7是大苞栝樓最適的發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化濃度。同樣，王麗等[20]在研究龍葵毛狀根誘導(dǎo)條件時發(fā)現(xiàn)菌液OD600為0.6時，毛狀根誘導(dǎo)效果較好，而高于0.6后誘導(dǎo)效率急劇降低。本試驗中，分析了菌液OD600從0.2到1.2時，‘中國龍’的毛狀根誘導(dǎo)率，發(fā)現(xiàn)菌液濃度過低起不到感染的目的，毛狀根誘導(dǎo)率低，當(dāng)OD600值在1.2左右時毛狀根誘導(dǎo)率比較合適。

共培養(yǎng)是農(nóng)桿菌侵染外植體后，在不含任何抗生素的條件下，讓農(nóng)桿菌和外植體共同生長的過程。研究發(fā)現(xiàn)共培時間的長短影響著毛狀根誘導(dǎo)率，這是因為發(fā)根農(nóng)桿菌的T-DNA與外植體整合需要一定的時間。共培養(yǎng)時間不夠，則不能完成T-DNA的轉(zhuǎn)移與整合，不能誘導(dǎo)毛狀根，不利于農(nóng)桿菌將發(fā)根基因誘導(dǎo)到外植體基因中，而共培養(yǎng)時間過長又會導(dǎo)致農(nóng)桿菌大量繁殖，給以后的除菌帶來困難，農(nóng)桿菌除不凈就會使外植體失活，直接影響誘導(dǎo)率。孫敏等[20]在研究共培養(yǎng)時間對發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)長春花發(fā)根時發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)2 d時的毛狀根誘導(dǎo)率最高，達50.70%，從第3天開始，誘導(dǎo)率不斷下降。同樣，在龍葵上的研究結(jié)果也表明共培養(yǎng)2 d毛狀根誘導(dǎo)率最高[21]。本試驗結(jié)果表明黃瓜‘中國龍’在毛狀根誘導(dǎo)過程中，如果共培養(yǎng)超過2 d，發(fā)根農(nóng)桿菌會過度生長，對外植體生產(chǎn)毒害，難以誘導(dǎo)毛狀根。

以黃瓜基因組測序品種‘中國龍’為材料，建立其毛狀根誘導(dǎo)體系，可為充分利用該品種進行黃瓜的遺傳改良、挖掘黃瓜基因資源提供技術(shù)支撐。（本文圖版見彩插10）