韓德忞　劉原志　朱均昊　李莉　章強強

(復旦大學附屬華山醫(yī)院皮膚科真菌室，上海 200040)

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·技術與方法·

熒光染色法與KOH濕片法在真菌直接鏡檢中的應用比較

韓德忞劉原志朱均昊李莉章強強

(復旦大學附屬華山醫(yī)院皮膚科真菌室，上海 200040)

目的探索一種結果更可靠的真菌直接鏡檢方法。方法對600例臨床高度疑似真菌感染的標本分別采用熒光染色法和KOH濕片法進行真菌直接鏡檢。結果熒光染色法和KOH濕片法的真菌檢出率分別為97%和88.5%。結論 熒光染色法是一種適合臨床的、快速有效的真菌鏡檢方法。

KOH濕片法；真菌直接鏡檢；真菌熒光染色法；真菌感染

[Chin J Mycol，2016，11(4):240-242]

直接鏡檢法旨在通過顯微鏡和簡單的試劑(通常1種)的幫助觀察標本中的真菌結構。在真菌實驗室中常規(guī)采用KOH濕片法觀察標本中有無真菌有形成分，本實驗采用熒光染色法與KOH濕片法分別對同一標本同時作鏡檢，比較兩種方法在鏡下的真菌形態(tài)的辨別清晰度與敏感性。

1　材料和方法

1.1熒光染色液的成分與染色原理

熒光染色液的成分我們采用的萊芙特敏真菌熒光染色液配有熒光染色A液及染色B液。其中熒光染色A液是一種含有特殊熒光素標聯的幾丁質酶的復合溶液，其中添加了濃度為10%的氫氧化鉀有助于溶解皮屑及甲屑標本中的角質細胞。染色B液是一種含有伊文思藍染料的溶液，用于去除視野中雜質熒光的干擾。

染色原理一般細胞熒光素會與各類標本中真菌細胞壁的(1,3)-β-D葡聚糖結合，從而通過熒光標記進行真菌檢測。本法利用一種重組幾丁質酶來檢測人體組織內是否存在真菌感染的方法。幾丁質存在于絕大多數真菌的細胞壁中，它是一種(1，4)-N-乙酰氨基葡萄糖均聚物。真菌熒光染色液中的重組幾丁質酶克隆自副溶血性弧菌，該重組酶可特異性地緊密結合到幾丁質上。特殊熒光素標聯的真菌酶可以作為組織化學標記物，在熒光顯微鏡下用來檢測各種組織樣本中的真菌細胞壁。特殊熒光素標聯的幾丁質酶可以高親和力與真菌細胞壁上的幾丁質結合，在一般的實驗條件下，不會被破壞。

1.2真菌熒光染色的適用范圍及存儲

該熒光染色液能夠與各類真菌(霉菌及酵母)細胞壁中的幾丁質結合從而產生熒光標記，包含皮膚癬菌、馬拉色菌、念珠菌、曲霉及各類變異的菌絲結構。適用于皮屑、甲屑、毛發(fā)、痰液、肺泡灌洗液、尿液、胸水等各種標本。熒光染色液可以室溫避光保存。

1.3標本來源

標本來自于華山醫(yī)院皮膚科門診及病房住院患者，臨床高度疑似真菌感染，共600例。其中皮屑標本中手足部位262份，體股部位52份，甲屑標本76份，毛發(fā)標本10份，深部標本包括痰液112份，尿液64份，胸水及其他體液標本24份。同時用2種方法檢測。

1.4方法

取材①深部標本：a.痰液標本取自患者清晨漱口后的第1口晨痰，標本存入無菌痰液容器中保存。b.尿液標本取自患者的早上的第1次清潔尿，使用無菌容器收集保存，離心后取沉渣作鏡檢。c.胸水及其他體液標本需要無菌采集于無菌試管中，離心后取沉渣作鏡檢。②淺部標本：a.皮屑：75%乙醇消毒患者皮損部位，使用鈍頭刀片刮取皮損炎性活動性邊緣的鱗屑，將標本直接置于載玻片上。b.毛發(fā)：75%乙醇消毒局部，使用鑷子拔取病發(fā)直接置于載玻片上。c.甲屑：75%乙醇消毒后，刮取甲下碎屑，直接置于載玻片上。

KOH濕片法采集各種標本于載波片上，滴加10%KOH溶液1滴，覆上蓋玻片，微加熱后輕壓蓋玻片使標本溶解后，置顯微鏡下觀察。尿液及胸水不加KOH。

熒光染色法將各種標本采集后置載玻片上，滴加1滴熒光染色A液，使標本與染液充分混勻作用1 min，甲屑標本需要延長至3 min，使其完全溶解，再滴加1滴染色B液，可使用竹簽混勻兩液，復染1 min后覆上蓋玻片，用濾紙吸取多余溢出的染液，輕壓蓋玻片后在熒光顯微鏡(型號Mshot SHHW-001)下低倍鏡觀察，查見熒光標記的菌絲或孢子后作高倍鏡證實。

2　結　　果

對600例患者的標本分別同時采用熒光染色法和KOH濕片法檢測，結果顯示熒光染色法對各種標本中的皮膚癬菌、念珠菌及馬拉色菌的熒光標記非常清晰(見圖1～4)，易于識別。熒光染色法與KOH濕片法的陽性率分別為97%及88.5%，統(tǒng)計學卡方檢測顯示x2=8.67，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，對比試驗顯示同一標本采用熒光染色法較KOH濕片法陽性率為高。具體結果見表1。

圖1痰標本：熒光染色，念珠菌孢子出芽(×400)圖2皮屑標本：熒光染色，大量的皮膚癬菌細長菌絲(×400)圖3皮屑標本：熒光染色，馬拉色菌短粗菌絲(×400)圖4皮屑標本：熒光染色，念珠菌菌絲(×400)

Fig.1Sputum sample:fluorescent staining,Candida spore germination(×400)Fig.2Dander sample:fluorescent staining,a large number of elongated dermatophytes hyphae(×400)Fig.3 Dander sample:fluorescent staining,Malassezia tubby hyphae(×400)Fig.4Dander sample:fluorescent staining,Candida hyphae(×400)

3　討　　論

KOH濕片法制作方法簡單便捷，成本低廉，不需要特殊的儀器設備，但非常依賴于檢驗人員的經驗與技術水平，且由于標本中常含有各種雜質導致視野背景較雜亂，影響真菌的檢出，其中甲屑標本最為明顯，KOH濕片法短時間無法溶解標本中的雜質，一定程度上干擾了真菌檢出，導致陽性率不高。

真菌熒光染色法通過特殊熒光素標聯的幾丁質酶與真菌細胞壁中的幾丁質產生特異性的結合，并吸收紫外光(波長340～380 nm)，使菌絲及孢子發(fā)出明亮的藍色熒光，在熒光顯微鏡下真菌輪廓和黑暗背景可形成明顯反差，易于在鏡下尋找及識別，其真菌的形態(tài)結構相對于KOH濕片法更為清晰，真菌熒光染色液A液中含有10%的KOH成分，能夠溶解皮屑、甲屑標本中的角質細胞及其他雜質。真菌熒光染色可通過反復染色使因放置時間過長而使熒光減少的樣本恢復熒光，也可通過重復染色步驟大幅減少背景熒光，使菌絲與孢子更為明顯。相對于KOH濕片法，雖然熒光染色法的操作需要增加一步染色步驟，且需要熒光顯微鏡，但其對于標本中菌絲、孢子由于熒光的標記使得尋找相對容易，也便于識別，真菌菌絲、孢子清晰顯現，檢測靈敏度大幅提高。特別是在KOH濕片法中孢子與脂肪滴有時很難鑒別，而熒光染色法對脂肪滴不產生標記，易于鑒別，且特異性高，其能使少量真菌著染，彌補了傳統(tǒng)的KOH濕片法在真菌數量少時檢出率不高的不足，并且染色時間短，只需2 min，結果直觀。根據我們的數據統(tǒng)計與經驗，熒光染色法在淺部標本與深部標本的檢測中，與KOH濕片法比較具有較大的優(yōu)勢，KOH濕片法因片中雜質多，背景雜亂，標本中的散在菌絲或孢子難以尋找辨認，存在著主觀判斷的誤差，易漏檢的局限性，而使用熒光染色能快速有效的找到標本中的菌絲或孢子，并且結構清晰，明顯地提高了標本的陽性率。以往的文獻[1-7]已證實熒光染色法在真菌檢測中較傳統(tǒng)的KOH濕片法具有敏感性強，陽性率高的特點。

表1各種標本熒光染色法與KOH濕片法檢測真菌的陽性率比較

Tab.1Comparison of the positive rates of various specimens in fungal detection between fluorescent staining and KOH

標本來源(例)熒光染色法KOH濕片法陽性(%)陰性(%)陽性(%)陰性(%)皮屑(314)318(98.09%)6(1.91%)283(90.13%)31(9.87%)甲屑(76)69(90.79%)7(9.21%)57(75%)19(25%)毛發(fā)(10)10(100%)0(0%)7(70%)3(30%)痰(112)107(96.42%)5(3.58%)102(91%)10(9%)尿(64)63(98.4%)1(1.6%)61(95.31%)3(4.69%)胸水及其他體液(24)24(100%)0(0%)21(87.5%)3(12.5%)合計(600)581(97%)19(3%)531(88.5%)69(11.5%)

所以，熒光染色法不失為一種快速有效檢測真菌的新方法。萊芙特敏熒光染色液性質穩(wěn)定，常溫下可保存2 a以上，但應避光保存，否則影響染色效果。

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[本文編輯]衛(wèi)鳳蓮

Comparison of novel fluorescent staining and KOH microscopic examination in fungal measured by direct microscopy

HAN De-min,LIU Yuan-zhi,ZHU Jun-hao,LI Li,ZHANG Qiang-qiang

(The Lab of Medical Mycology,Department of Dermatology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040)

ObjectiveTo explore a reliable and rapid method in direct microscopic examination for fungi using novel fungal fluorescent staining.MethodsSamples from 600 clinically suspected cases of fungal infection were screened by fluorescent staining and KOH microscopic examination.ResultsFungal elements were detected in 97% of the cases by fluorescent staining and 88.5% by KOH.ConclusionsFluorescent staining is a reliable and effective method for fungi microscopic examination.

KOH；fungal direct microscopy；fungal fluorescent staining；fungal infections

國家自然科學基金(81573056)

韓德忞，男(漢族)，大專，技師.E-mail:sarekes@126.com

章強強,E-mail:zhangqq8@163.com

R 446.5

A

1673-3827(2016)11-0240-03

2015-07-27