伍方佩　胡小平　于波　陳朝豐　劉曉云　黃國(guó)新

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科，深圳 518000)

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·論著·

Dectin-1及相關(guān)細(xì)胞因子在足菌腫皮損中的表達(dá)

伍方佩胡小平于波陳朝豐劉曉云黃國(guó)新

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科，深圳 518000)

目的觀察Dectin-1在真菌性足菌腫皮損中的表達(dá)，初步分析其在足菌腫發(fā)病中的作用。方法實(shí)驗(yàn)分為3組，A組8例足菌腫病例，B組為10例著色芽生菌病病例，A組和B組統(tǒng)稱(chēng)為感染組，C組為18例正常皮膚組織。應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)3組病例的組織蠟塊中Dectin-1、IL-4，IL-10，IFN-γ，TNF-α的表達(dá)。結(jié)果與正常組相比，感染組皮膚的Dectin-1、IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-10的積分光密度增高(P<0.05)。A組與B組相比，兩組間Dectin-1、IL-4、IFN-γ，TNF-α的積分光密度值比較無(wú)差異(P>0.05)。結(jié)論真菌感染皮損中Dectin-1的表達(dá)上調(diào)，可能說(shuō)明Dectin-1在足菌腫發(fā)病中具有一定作用。

Dectin-1；真菌性足菌腫；IL-4；IL-10；IFN-γ；TNF-α

[Chin J Mycol，2016，11(4):201-204]

Dectin-1可介導(dǎo)識(shí)別包括曲霉屬在內(nèi)的多種真菌病原體，通過(guò)Dectin-1識(shí)別這些菌體可促進(jìn)機(jī)體的保護(hù)性應(yīng)答反應(yīng)，包括對(duì)真菌的攝取及殺傷(通過(guò)呼吸爆發(fā)介導(dǎo))，以及產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和趨化因子包括TNF、IL-1、IL-6和粒細(xì)胞、單核細(xì)胞集落刺激因子等[1]。本研究通過(guò)觀察Dectin-1及細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α在真菌性足菌腫皮損中的表達(dá)變化，初步分析Dectin-1在足菌腫發(fā)病中的作用。

1　材料與方法

1.1材料

收集患者的組織蠟塊在北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科門(mén)診，從2012～2015年收集了8例真菌性足菌腫和10例著色芽生菌病患者，分別為A組和B組。根據(jù)患者臨床表現(xiàn)，病理活檢和真菌學(xué)檢查確診，皮損活檢后制成蠟塊保存?zhèn)溆?。確診的患者中有14名男性和4名女性，平均年齡46.9歲(26～69歲)。A組共有8例患者，男性7例，女性1例，平均年齡47.5歲；B組10例患者，男性7例，女性3例，平均年齡46.5歲。同時(shí)整形外科留取18例正常的皮膚組織，制成蠟塊保存?zhèn)溆?，分為正常C組，同時(shí)進(jìn)行組織的免疫組化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

主要試劑生物技術(shù)公司Abcam Anti IL-4 antibody(ab9622)、Anti IL-10 antibody(ab34843)、Anti-Interferon gamma antibody(ab25101)、Anti-TNF alpha antibody(ab6671)、Anti-beta Glucan Receptor antibody(ab189961)；中杉金橋PV-6001兔二步法檢測(cè)試劑盒(K142304F)；中杉金橋PV-9003山羊超敏二步法檢測(cè)試劑盒(K145620B)；中杉金橋ZLI-9036 AEC酶底物試劑盒(K146620D)；中杉金橋ZLI-9056進(jìn)口羊血清工作液(15A52806)。

1.2方法

蠟塊切片后的病理切片置入65度恒溫烤箱烤片1 h，然后進(jìn)行常規(guī)的無(wú)水二甲苯脫水，由高到低濃度梯度酒精復(fù)水，隨后使用pH=6.0的枸櫞酸鈉煮沸抗原修復(fù)，3%雙氧水浸泡阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，正常羊血清工作液封閉非特異性抗原1 h，分別滴加稀釋單抗孵育12 h。第2天常溫下復(fù)溫15 min，滴加相應(yīng)二抗常溫靜置45 min，AEC染色，靜置5～10 min，顯微鏡下觀察病理組織是否染色。蘇木素液體浸泡復(fù)染5 min，分化液分化，流水沖洗10 min，待顯微鏡下觀察細(xì)胞核顯色后，晾干水性膠水固定，蓋玻片完成。與之前制備好的陽(yáng)性玻片進(jìn)行對(duì)比。用顯微成相系統(tǒng)進(jìn)行照相。

1.3統(tǒng)計(jì)方法

使用Image-Pro Plus軟件分析免疫組化圖片并進(jìn)行半定量比較，Spss 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(見(jiàn)圖1)。

2　結(jié)　　果

對(duì)A、B、C組之間Dectin-1、IL-4、IL-10、IFN-γ,TNF-α的積分光密度值分別進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(見(jiàn)表1，圖2)。

表1　A、B、C組間t、P值的比較

2.1A和B組與C組積分光密度值比較

與C組相比，感染組A和B組皮膚的Dectin-1、IL-4、IFN-γ,TNF-α,IL-10的積分光密度值均增高(P<0.05)(見(jiàn)圖3)。

2.2A組與C組積分光密度值比較

與C組相比，A組IL-4、IFN-γ的積分光密度值增高(P<0.05)，而A組Dectin-1、IL-10、TNF-α積分光密度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.3B組與C組積分光密度值比較

與C組相比，B組IL-4、IFN-γ、IL-10、TNF-α的積分光密度值增高(P<0.05)，而B(niǎo)組Dectin-1積分光密度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.4A組與B組積分光密度值比較

A組與B組相比，兩組間Dectin-1、IL-4、IFN-γ,TNF-α的積分光密度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

3　討　　論

Dectin-1屬第V組C型凝集素，是由胞外C型凝集素樣碳水化合物識(shí)別域(CTLD)、短桿(Stalk)和具有免疫受體酪氨酸激酶活化基序(ITAM)的胞質(zhì)尾部構(gòu)成的糖基化的II型跨膜受體。人Dectin-1基因編碼33 kDa的糖蛋白，其多肽由247個(gè)氨基酸殘基組成。過(guò)去在對(duì)釀酒酵母、白色念珠菌的識(shí)別和非調(diào)理素性吞噬過(guò)程中，阻斷Dectin-1可顯著抑制巨噬細(xì)胞對(duì)酵母多糖的吞噬[2]，這提示Dectin-1可識(shí)別具有β-1，3連接和β-1，6連接的葡聚糖。又有研究發(fā)現(xiàn)Dectin-1是α-甘露糖的特異性受體[3]。因而Dectin-1是β-葡聚糖和α-甘露糖的特異性受體。Palma等[4]研究發(fā)現(xiàn)吞噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞通過(guò)Dectin-1識(shí)別β-葡聚糖，表明Dectin-1廣泛分布于髓樣細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、DC和中性粒細(xì)胞。而在人正常表皮中，Dectin-1蛋白選擇性表達(dá)于朗格罕細(xì)胞。Li等[5]對(duì)真菌性角膜炎的研究發(fā)現(xiàn)，Dectin-1在正常角膜上皮和真菌感染的角膜上皮均有表達(dá)，而體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)角膜上皮細(xì)胞在曲霉抗原刺激24 h后表達(dá)增加。

圖1各組免疫組化的比較：A1、A2、A3、A4、A5為A組Dectin-1、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的表達(dá)；B1、B2、B3、B4、B5為B組Dectin-1、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的表達(dá)；C1、C2、C3、C4、C5為C組Dectin-1、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的表達(dá)圖2各組積分光密度值的比較(* # &表示兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)圖3感染組與正常組積分光密度的比較(*表示兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)

Fig.1Comparison of each immunohistochemical group:A1-A5.The group A expression of Dectin-1,IL-4,IL-10,IFN-γ,TNF-α;B1-B5.The group B expression of Dectin-1,IL-4,IL-10,IFN-γ,TNF-α;C1-C5.The group C expression of Dectin-1,IL-4,IL-10,IFN-γ,TNF-α)Fig.2The comparison of each integral optical density valuesFig.3The comparison of the integral optical density values between the infected group and normal group

本研究中發(fā)現(xiàn)A、B、C三組皮膚中均可以表達(dá)Dectin-1。在正常表皮，Dectin-1表達(dá)于郎罕氏細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)中Dectin-1正常組皮膚表達(dá)證實(shí)了Dectin-1可以作為一種模式識(shí)別分子存在于表皮。真菌感染組A、B組皮膚中Dectin-1的表達(dá)高于正常皮膚組，推測(cè)當(dāng)真菌感染皮膚組織，樹(shù)突狀細(xì)胞和吞噬細(xì)胞通過(guò)Dectin-1識(shí)別真菌β-葡聚糖,趨化中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞，因大多數(shù)固有免疫細(xì)胞表面均有Dectin-1的表達(dá)，導(dǎo)致感染組的Dectin-1升高。

有研究報(bào)道，組織莢膜菌感染CRR2-小鼠，使其體內(nèi)IL-4明顯上升，且在小鼠肺部產(chǎn)生高濃度IL-4。升高的IL-4抑制宿主抗真菌感染，導(dǎo)致小鼠因感染加重而死亡[6]。IL-4能刺激吞噬細(xì)胞產(chǎn)生一種能減少產(chǎn)生一氧化氮獲得抗真菌活性的精氨酸酶-1[7]。此外，IL-4能夠阻滯粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子的活化，提高細(xì)胞內(nèi)的鋅以維持真菌生長(zhǎng)[8-9]，因此認(rèn)為IL-4能夠抑制抗真菌免疫。宿主對(duì)病原真菌有效的適應(yīng)性免疫反應(yīng)主要依靠Thl和Thl7的共同協(xié)同作用，而菌體的生長(zhǎng)則主要依靠抑制Thl、Thl7和上調(diào)Th2細(xì)胞的免疫反應(yīng)[10-11]。d'Avila等[12]對(duì)著色芽生菌病不同臨床時(shí)期如疣狀斑塊期和萎縮紅斑期進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，所有的皮損組織均表達(dá)IL-4，因此推測(cè)為機(jī)體啟動(dòng)細(xì)胞免疫。

本研究中發(fā)現(xiàn)IL-4可以在正常組織和真菌感染組織中表達(dá)，而真菌感染皮膚組織中IL-4的表達(dá)高于正常組，推測(cè)本研究中感染組的標(biāo)本均來(lái)源為疾病中晚期患者，著色芽生菌病患者臨床表現(xiàn)主要為疣狀斑塊、萎縮性斑塊或者混合型，而足菌腫患者主要表現(xiàn)為肉芽腫結(jié)節(jié)，機(jī)體啟動(dòng)了Th2細(xì)胞免疫，抑制抗真菌作用，同時(shí)IL-4是一種典型的Th2細(xì)胞因子，還可以促進(jìn)傷口愈合、組織修復(fù)[13]，因而IL-4的產(chǎn)生可以促進(jìn)患者組織的纖維化，修復(fù)傷口。

Hardison等[14]研究發(fā)現(xiàn)硫代乙酸納誘導(dǎo)的Dectin-1缺失的巨噬細(xì)胞中，β-葡聚糖誘導(dǎo)細(xì)胞因子生成的過(guò)程被大部分阻斷，巨噬細(xì)胞幾乎無(wú)法表達(dá)TNF-α、IL-10。吳呈霖等[15]研究將24只大鼠隨機(jī)分為兩組，感染組用熱處理的光滑念珠菌處理侵襲大鼠肺部，對(duì)照組不做處理，在第3、6天測(cè)定兩組大鼠肺泡灌洗液中IL-10、TNF-α的表達(dá)及肺組織，發(fā)現(xiàn)感染組肺組織Dectin-1及肺泡灌洗液中IL-10、TNF-α的表達(dá)呈進(jìn)行性升高。這些研究均表明在真菌感染組織中TNF-α、IL-10的表達(dá)均與Dectin-1呈相關(guān)性。

本研究中真菌感染組織皮膚中TNF-α、IL-10的表達(dá)同d'Avila的研究結(jié)果一致。d'Avila等[12]對(duì)不同程度著色芽生菌病患者的皮損進(jìn)行免疫組化研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)TNF-α在全部皮損中表達(dá)，IL-10在大多數(shù)的皮損中表達(dá)。TNF-α是多功能細(xì)胞因子，主要由樹(shù)突狀細(xì)胞和吞噬細(xì)胞產(chǎn)生，調(diào)節(jié)炎癥性和免疫反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)感染的細(xì)胞凋亡。推測(cè)在真菌感染后期，聚集的吞噬細(xì)胞通過(guò)Dectin-1的表達(dá)產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子TNF-α，抑制皮膚組織增生。IL-10作為T(mén)h2細(xì)胞因子，作用是免疫抑制，能阻抑T細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的活性和功能[16]。推測(cè)本研究中入組的患者真菌感染機(jī)體后活化固有免疫，免疫反應(yīng)持續(xù)加強(qiáng)，IL-10表達(dá)增加，抑制Th1促炎反應(yīng)，避免組織傷害。

胡志德等[17]發(fā)現(xiàn)不同濃度Dectin-1封閉劑昆布多糖與PBMC培養(yǎng)1 h后，再用熱滅活白念珠菌刺激PBMC 4 d，再用不同劑量的Dectin-1激活劑酵母聚糖刺激PBMC 4 d，收集培養(yǎng)液上清檢測(cè)IFN-γ水平，在此體系中加入不同濃度的昆布多糖則可以部分抑制熱滅活白念珠菌誘導(dǎo)IL-12和IFN-γ的能力,且具有濃度依賴。這提示Dectin-1的激活可能是導(dǎo)致Th1相關(guān)的細(xì)胞因子IFN-γ生成的原因。Gow等[18]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱處理殺死的白念珠菌能使其細(xì)胞壁最內(nèi)層的β-葡聚糖暴露從而被Dectin-1識(shí)別。用人、鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液分別與活白念珠菌、紫外線殺死、熱殺死白念珠菌孵育，熱殺死組較活的白念珠菌釋放更高的IFN-γ，而經(jīng)Dectin-1阻斷劑阻斷后，熱殺死組IFN-γ釋放無(wú)差異。這提示了IFN-γ的產(chǎn)生有Dectin-1的參與，可能同時(shí)存在其他途徑。

本次研究中感染組皮損IFN-γ表達(dá)較正常皮膚組升高，考慮為真菌感染后期啟動(dòng)Th1細(xì)胞免疫，IFN-γ是Th1細(xì)胞因子。這個(gè)結(jié)果與d'Avila等[12]的研究發(fā)現(xiàn)是相違背的，考慮原因可能是測(cè)量研究數(shù)據(jù)的方式不一樣，因此得到的結(jié)果也不一樣。A組與B組皮損中IFN-γ結(jié)果無(wú)差異，考慮原因還是研究對(duì)象例數(shù)不夠。

綜上，本研究中驗(yàn)證了Dectin-1在正常皮膚和真菌感染的皮膚均可以表達(dá)。在足菌腫與著色芽生菌病中Dectin-1表達(dá)的無(wú)差異，推測(cè)Dectin-1受體識(shí)別真菌的防御普遍存在于皮膚真菌感染疾病。而真菌性足菌腫皮損中Dectin-1的表達(dá)上調(diào)，可能說(shuō)明Dectin-1在足菌腫發(fā)病中具有一定作用。

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Express of Dectin-1 and related cytokines in skin with eumycetic mycetoma

WU Fang-pei，HU Xiao-ping，YU Bo,CHEN Chao-feng,LIU Xiao-yun,HUANG Guo-xin

(1.Department of Dermatology,Peking University Shenzhen hospital，Shenzhen 518000)

ObjectiveTo observe the expression of dectin-1 in the skin with eumycetic mycetoma，and to analyze the role of the pattern recognition receptors dectin-1 when the skin infected with eumycetic mycetoma.MethodsThere were three experiment al groups,group A included 8 cases of chromoblastomycosis,and group B contained 10 cases of mycetoma.The infection group included group A and B.The normal group contained 18 normal skin tissue.The expression of Dectin-1,IL-4,IL-10,IFN-γ and TNF-α were tested by immunohistochemical method in the paraffin embedded tissues.ResultsCompared with normal group,the integral optical density values of Dectin-1,IL-4,IFN-γ,TNF-α,IL-10 of the infected group were increased(P<0.05).The integral optical density values of Dectin-1 and IL-4,IFN-γ,TNF-α had no difference between group A and B.ConclusionIncreased expression of Dectin-1 of the skin with eumycetic mycetoma,suggested that Dectin-1 might have a certain role on the skin with fungal infection.

Dectin-1；eumycetic mycetoma；IL-4；IL-10；IFN-γ；TNF-α

深圳市科創(chuàng)委基金(JCYJ20140415162542984)；深圳市衛(wèi)計(jì)委基金(201401028)

伍方佩，女(漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:491937713@qq.com

胡小平,E-mail:47776040@qq.com

R 756.6

A

1673-3827(2016)11-0201-04

2016-02-18[本文編輯]衛(wèi)鳳蓮