王慧賓,熊偉,韓曉丹,胡銀,付建平,鄧朝陽(yáng)

（江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所,江西南昌 330096）

超聲輔助提取藤茶多糖的工藝優(yōu)化及其成分分析

王慧賓*,熊偉,韓曉丹,胡銀,付建平,鄧朝陽(yáng)

（江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所,江西南昌 330096）

本文采用超聲輔助技術(shù)，以高效提取藤茶中的水溶性活性多糖為主要目的，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)超聲功率、提取溫度、提取時(shí)間以及液料比對(duì)藤茶多糖的得率影響進(jìn)行了工藝優(yōu)化。結(jié)果表明，在超聲功率1 000W，提取溫度50℃，提取時(shí)間15m in，液料比30∶1的工藝條件下，藤茶粗多糖得率最高可達(dá)6.74%。通過紫外-可見光譜、紅外光譜分析表明，藤茶多糖是一種富含糖醛酸的多糖，其中性糖含量為40.11%，糖醛酸含量為41.37%。與熱水提取法比較,超聲輔助提取工藝具有提取溫度低、提取時(shí)間短、效率高的特點(diǎn)，且獲得的藤茶多糖產(chǎn)品性狀好、得率高。

藤茶；多糖；超聲提??；正交實(shí)驗(yàn)

在植物、動(dòng)物及微生物細(xì)胞中都存在不同類型的天然活性多糖，它們具有分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點(diǎn)。多糖獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了它們特有的免疫活性、抗腫瘤、降血糖、抗氧化等生物活性[1]。近年來，越來越多的研究者開始從植物、動(dòng)物及微生物中提取天然活性多糖[2，3]。藤茶，學(xué)名顯齒蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata)，又名莓茶、長(zhǎng)生藤，是廣泛分布于我國(guó)南方各山區(qū)的一種野生藤本植物[4]。藤茶中富含黃酮類物質(zhì)，當(dāng)茶飲別有風(fēng)味，且回味甘甜，又有一定的藥理作用（如消炎、殺菌作用），因此在民間廣受歡迎。近年來，對(duì)藤茶中的黃酮類物質(zhì)研究較多[5，6]，而對(duì)其活性多糖的研究較少[7]。傳統(tǒng)的熱水提取多糖技術(shù)用于藤茶多糖的提取存在溫度高、耗時(shí)長(zhǎng)的特點(diǎn)[8]，本文在已有研究的基礎(chǔ)上[9]，開發(fā)了一種超聲輔助高效提取藤茶中水溶性活性多糖的工藝，旨在提高效率、節(jié)約能耗。通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了工藝參數(shù)，并對(duì)提取的多糖進(jìn)行了初步的理化性質(zhì)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生藤茶，采自江西省撫州市黎川縣。濃硫酸、苯酚、無水乙醇、四硼酸鈉、葡萄糖、葡萄糖醛酸、間羥基聯(lián)苯等，均為分析純?cè)噭?/p>

超聲循環(huán)提取機(jī)（HF-5B型，北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司），紫外-可見分光光度計(jì)（TU-1810型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），冷凍干燥機(jī)（FD-1C50型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），臺(tái)式高速大容量冷凍離心機(jī)（H2050R型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），傅立葉變換紅外光譜儀（FTIR-7600型，天津港東科技發(fā)展股份有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藤茶的預(yù)處理

收集到的藤茶莖葉人工除去大部分粗枝后，將藤茶葉在烘箱中60℃下充分干燥至恒重，高速粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，置干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 藤茶多糖的提取流程和條件優(yōu)化

藤茶粉碎料和水以一定配比混合后開始超聲提取。一定時(shí)間后料液混合物進(jìn)行高速離心，棄去殘?jiān)锨逡河眯D(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，繼而用80%的乙醇沉淀。再次離心，所得沉淀用無水乙醇洗滌3次，真空抽干或以水復(fù)溶后凍干，稱重后計(jì)算得率。得率為多糖凈重和藤茶原料的比值。

以蒸餾水為提取劑，基礎(chǔ)條件確定為液料比50∶1，時(shí)間10min，溫度50℃，功率800W的條件下分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。液料比范圍在20∶1、30∶ 1、40∶ 1、50∶ 1、60∶ 1、70∶ 1和80∶1；提取時(shí)間范圍在3、5、10、15、20min和25min；提取溫度范圍在30、40、50、60℃和70℃；提取功率范圍在250、600、800、1 000W和1 200W。

1.2.3 紅外光譜分析

很多孕媽媽都感覺乳房，尤其是乳頭附近似乎沉積了很多污垢，特別想清洗。由于孕期激素的改變，乳暈區(qū)域擴(kuò)大，色素沉著增加，乳頭周圍還會(huì)出現(xiàn)一些小隆起，因此乳房看起來會(huì)比較“臟”。但這是懷孕后的一種正常變化，不是沉積的污垢。孕媽媽不要刻意去清洗，只需洗澡的時(shí)候順便清洗一下就可以，也不建議用肥皂或其他洗液清洗。另外，清洗時(shí)，不要使勁搓洗乳房，否則會(huì)引起宮縮。

取100℃充分干燥的藤茶多糖少量，與一定比例干燥的溴化鉀粉末混合后置于瑪瑙研缽中充分研磨，壓片，測(cè)定其紅外光譜，掃描波數(shù)范圍4 000～400cm-1。

1.2.4 中性糖和糖醛酸測(cè)定方法

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，采用苯酚-硫酸法測(cè)定藤茶多糖的中性糖含量。精確移取濃度為0.05mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2～0.9mL并定容至1.0mL，隨后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚水溶液0.5mL，混勻，分別加入濃硫酸5.0mL，快速充分搖勻，室溫下靜置10min后，測(cè)定490nm處吸光度，并以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)建立回歸方程（見圖1）：Y=0.009 47X-0.017 900（R2=0.995 6）。藤茶多糖樣品配制成0.05mg/mL的水溶液，取1.0mL按上述步驟相繼加入苯酚和濃硫酸，測(cè)定490nm處吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品的中性糖含量。

以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，采用間羥基聯(lián)苯法測(cè)定藤茶多糖的糖醛酸含量。精確移取濃度為0.06mg/mL的葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4mL 和0.5mL并加水定容至0.5mL，在冰浴中逐滴加入12.5mM的四硼酸鈉的硫酸溶液1.5mL?；靹蚝笤诜兴≈屑訜?min，冷至室溫后分別加入0.15%的間羥基聯(lián)苯的0.5%的氫氧化鈉溶液0.025mL，混勻后在520nm處測(cè)定吸光度，以葡萄糖醛酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)建立的回歸方程為（見圖2）：Y=0.001 81X-0.000 214（R2=0.994 3）。藤茶多糖樣品配制成0.06mg/mL的水溶液，取0.5mL按上述步驟操作并測(cè)定520nm處吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品的糖醛酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)選擇了液料比、溫度、超聲功率和時(shí)間等對(duì)藤茶多糖得率影響較大的4個(gè)因素進(jìn)行考察。以多糖得率為縱坐標(biāo)，4個(gè)影響因素為橫坐標(biāo)分別作圖，從而對(duì)影響多糖得率的因素進(jìn)行直觀分析。

圖3 不同液料比比對(duì)藤茶多糖得率率的影響

圖4 不同溫度對(duì)藤茶多糖得率的影響

圖5 不同超聲功率對(duì)藤茶多糖得率的影響

圖6 不同超聲時(shí)間對(duì)藤茶多糖得率的影響

從圖3可以看出，藤茶多糖的得率隨液料比的增大，得率反而下降，同時(shí)液料比過大時(shí)，后續(xù)的離心、濃縮操作也會(huì)增大時(shí)間成本，并可能對(duì)多糖活性產(chǎn)生一定影響。因此，液料比控制在40∶1以內(nèi)比較合適。

不同的超聲功率對(duì)藤茶多糖得率的影響如圖5所示，從圖中可以看出，在50℃的溫度和較低的功率下，多糖得率很低；當(dāng)功率變大后，多糖的得率隨功率增加而迅速增大。但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)功率過高時(shí)，提取混合液隨時(shí)間的延長(zhǎng)，容易被破碎過度而變成懸濁液，不利于后續(xù)的離心分離，因此適宜的超聲功率在1 000 W左右。

超聲時(shí)間對(duì)藤茶多糖得率的影響如圖6所示，可見隨時(shí)間延長(zhǎng)藤茶多糖得率也相應(yīng)增加，但20min以后，多糖得率不再增加，說明多糖已基本全部溶出，因此最佳的提取時(shí)間應(yīng)在20min以內(nèi)。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)液料比、溫度、超聲功率、時(shí)間4個(gè)因素分別選取3個(gè)水平進(jìn)行了四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，如表1所示。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析如表2所示。極差結(jié)果分析表明，影響多糖得率的因素順序從大到小分別為：功率、時(shí)間、溫度和液料比。綜合分析后，最佳方案選擇為A2B3C2D3，即液料比30∶1，時(shí)間15min，溫度50℃，功率1 000W。在此條件下進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，多糖得率為6.74%，說明正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果較好。

2.3 藤茶多糖成分分析

2.3.1 藤茶多糖的紅外光譜測(cè)定

藤茶多糖的紅外光譜如圖7所示，其中1 629.55cm-1處為羧基上O-C-O的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)，而1 415.49 cm-1處為C-OH變角振動(dòng)和羧基上O-C-O對(duì)稱伸縮振動(dòng)[10]，兩者均說明藤茶多糖很可能為一種糖醛酸多糖，繼而下一步對(duì)藤茶多糖分別進(jìn)行了中性糖和糖醛酸含量的測(cè)定。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析

圖7 藤茶多糖的紅外光譜圖

2.3.2 藤茶多糖的中性糖和糖醛酸含量測(cè)定

苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的原理是多糖被硫酸脫水后生成糖醛衍生物，繼而和苯酚生成橙黃色物質(zhì)，從而可在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)照，計(jì)算可得藤茶多糖的中性糖含量為40.11%。間羥基聯(lián)苯法測(cè)定多糖的原理是利用多糖中的糖醛酸殘基在四硼酸鈉和間羥基聯(lián)苯的共同作用下，在520nm處生成特異吸收峰。本文以葡萄糖醛酸作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，測(cè)得藤茶多糖的糖醛酸含量為41.37%。

3 結(jié)論

和傳統(tǒng)的水熱提取法相比，超聲輔助提取技術(shù)可顯著降低提取溫度和時(shí)間。本文通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后，得到最佳工藝參數(shù)為：液料比30∶1，超聲時(shí)間15min，功率1 000W，溫度50℃。在此條件下藤茶多糖得率可達(dá)6.47%，所得多糖顏色為灰白色，利于多糖的進(jìn)一步純化。本工藝操作路線適宜于工業(yè)化操作，可為藤茶多糖的生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

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Ultrasound-assisted Extraction of Polysaccharide from Ampelopsis Grossedentata and the Composition Analysis

Wang Hui-bin*, Xiong Wei, Han Xiao-dan, Hu Yin, Fu Jian-ping, Deng Zhao-yang
(Institute of Applied Chemistry, Jiangxi Academy of Sciences, Jiangxi Nanchang 330096)

A high efficient water-soluble polysaccharide extraction technology from Ampelopsis grossedentata was developed. Through single factor and orthogonal experiments, four main extraction parameters, the extraction time, temperature, ultrasonic power and ratio of water to material were optimized by designing four factors and three levels of orthogonal experiment. Considering the orthogonal experiment results, the optimum extraction parameters were obtained: ratio of water to material 30∶1, extraction time 15min, ultrasonic power 1 000W, and extraction temperature 50℃. Under optimum conditions, polysaccharides yield was 6.74%. Polysaccharide obtained from ultrasonic extraction was determined by IR and UV-Vis spectrum and was considered to be a kind of uronic acid polysaccharide which has neutral sugar content 40.11% and uronic acid content 41.37%. The products obtained by ultrasonic extraction technology have high crude product purity and yield and better appearance. The process technology can greatly reduce the extraction time and extraction temperature.

Ampelopsis grossedentata; Polysaccharides; Ultrasonic extraction; Orthogonal experiment

TQ91

A

2096-0387（2016）01-0007-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)31260400）；江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)20151BBF60024）；江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)20132BBG70045）。

王慧賓（1980-），男，博士，助理研究員，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。