張亮行， 張帆濤,2*， 聶　麗， 萬令飛，梁劍秋， 張雨佳， 馬羊帥， 謝建坤

( 1. 江西師范大學 生命科學學院， 南昌 330022； 2. 江西師范大學 江西省亞熱帶植物資源保護與利用重點實驗室， 南昌 330022 )

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水稻黃綠葉突變體ygl-63的特征和基因定位

張亮行1， 張帆濤1,2*， 聶麗1， 萬令飛1，梁劍秋1， 張雨佳1， 馬羊帥1， 謝建坤1

( 1. 江西師范大學 生命科學學院， 南昌 330022； 2. 江西師范大學 江西省亞熱帶植物資源保護與利用重點實驗室， 南昌 330022 )

葉綠體的正常發(fā)育對于植物至關重要，突變體研究是探明葉綠體發(fā)育過程中基因功能的有效途徑。葉色突變體已引起人們廣泛的關注，通過對各種植物材料的研究，葉色突變的分子機制已取得一定進展，但遠未被闡明，尤其在水稻當中。目前，已報道的水稻葉色突變體，主要表現(xiàn)為黃化、白化、亮綠、條斑條紋、溫敏變色、轉綠和轉紫等。該研究使用甲基磺酸乙酯(EMS)處理粳稻日本晴，獲得一份遺傳穩(wěn)定的突變體ygl-63，其整個生育期葉片均表現(xiàn)為黃綠色。通過測定ygl-63和野生型苗期葉片的葉綠素含量發(fā)現(xiàn)，ygl-63中葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量與野生型相比分別下降了31.9%、42.2%和34.1%，同時葉綠素a/b值較野生型增加。這表明葉綠素含量的降低是導致ygl-63黃綠葉突變性狀的主要原因，并且葉綠素b的降幅大于葉綠素a。在成熟后調查主要農(nóng)藝性狀發(fā)現(xiàn)ygl-63單株有效穗數(shù)和結實率分別減少8.9%和8.5%；千粒重增加10.4%；而株高，穗長和每穗著粒數(shù)和野生型相比差異并不顯著。通過測量微量元素發(fā)現(xiàn)，ygl-63種子中的鐵和鋅含量較野生型顯著降低，分別減少85.7%和64.8%。將ygl-63與正常綠色品種明恢63雜交獲得F1和F2群體，進行遺傳分析發(fā)現(xiàn)，ygl-63突變性狀受1對隱性基因控制，通過基因定位，將該基因定位到水稻第11染色體長臂的分子標記InDel-3和InDel-5之間約2.4 cM范圍內。該基因被認為是一個新的水稻葉色突變基因，暫命名為ygl-63(g)。所得結果為今后對ygl-63(g)基因的進一步研究奠定了基礎。

水稻, 葉色突變體, 甲基磺酸乙酯, 微量營養(yǎng)元素, 分子標記, 遺傳分析, 基因定位

光合作用是綠色植物利用葉綠素等光合色素，在可見光的照射下，將二氧化碳和水轉化為有機物，并釋放出氧氣的生化過程(Leister et al, 2003)。葉片是植物進行光合作用的主要器官，其中的葉綠體不僅參與了重要的光合作用，將光能轉化為化學能，同時，葉綠體還參與了植物體內的各種代謝產(chǎn)物的合成途徑(黃曉群等，2007; 程欣等，2013)。突變體在植物的生理、生化和功能基因組研究等方面具有重要作用(楊松濤等，2010; 張霞等，2012)。迄今為止，在許多高等植物中都發(fā)現(xiàn)了葉色相關突變體，如水稻(胡忠等，1981)、大豆(Ghirardi et al, 1988)、大麥(Krol et al, 1995)、小麥(Falbel et al, 1996)、玉米(Greene et al, 1998)和擬南芥(Carol et al, 1999)等。葉色突變不僅影響植物的光合作用，而且會破壞植物正常的生長發(fā)育，甚至導致植株死亡(Jung et al, 2003; Nakanishi et al, 2005; Zhang et al, 2006)。

以擬南芥為模式植物，葉色調控機制的研究已取得重要進展，其合成葉綠素b所需酶的編碼基因都已被克隆(Nagata et al, 2005; Beale et al, 2005)。水稻作為重要的糧食作物和單子葉模式植物，許多葉色基因相繼被報道，但是迄今為止，只有其中少數(shù)基因被克隆，水稻葉色調控的分子機理還遠未被闡明(李育紅等，2011)。OsPPR1是一個水稻葉綠體發(fā)育相關的基因，該基因表達水平的降低可引起水稻葉片發(fā)生白化(Gothandam et al, 2005)；OsCAO1和OsCAO2基因編碼水稻葉綠素酸酯α加氧酶，OsCAO1受光誘導，而OsCAO2則在黑暗條件下起作用(Lee et al, 2005)；OsChlD和OsChlI基因分別編碼ChlD和ChlI亞基，它們是水稻失綠突變體Chlorina-1和Chlorina-9的突變相關基因(Zhang et al, 2006)；YGL1基因位于水稻第5染色體上，負責編碼水稻葉綠素合酶(Wu et al, 2007)；RNRLI和RNRSl

圖 1　ygl-63和野生型親本在分蘗期的表型(A)與種子的比較(B)Fig. 1　Plant phenotype of the ygl-63 and the wild type at tillering stage (A) and comparison of the mature grains (B)

基因分別編碼水稻葉綠體發(fā)育必需的核苷酸還原酶的大亞基和小亞基(Yoo et al, 2009)；OsDVR基因編碼水稻聯(lián)乙烯還原酶，該酶可以催化水稻中聯(lián)乙烯葉綠素a轉化為單乙烯葉綠素a(Wang et al, 2010)。本研究通過EMS誘變獲得了一份水稻黃綠葉突變體，暫命名為ygl-63，其整個生育期葉片均呈現(xiàn)黃綠色。與野生型親本相比，ygl-63的單株有效穗數(shù)和結實率顯著減少，千粒重顯著增加，種子中的鐵和鋅元素含量較野生型顯著降低。此外，通過構建遺傳群體，對突變體進行了遺傳分析和基因定位，為進一步圖位克隆突變基因奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1 材料及田間試驗

用化學誘變劑甲基磺酸乙酯(EMS)處理日本晴(粳稻)，獲得一份黃綠葉突變體，連續(xù)進行多代自交后發(fā)現(xiàn)突變體性狀不發(fā)生分離，表明該突變體遺傳穩(wěn)定，暫命名為ygl-63。以日本晴為野生型對照。將ygl-63與正常綠葉秈稻品種明恢63雜交，分別播種F1和F2群體，用于遺傳分析和基因定位。

1.2 葉綠素含量的測定

于苗期取突變體ygl-63和野生型親本相同部位的葉片，分別進行葉綠素a和葉綠素b含量的測定，并計算葉綠素總含量及葉綠素a和葉綠素b的比值(Chl a/b)，測定方法參照Lichtenthaler(1987)。

1.3 微量營養(yǎng)元素鐵和鋅含量的測定

將突變體ygl-63和野生型親本的種子自然風干后，委托農(nóng)業(yè)部稻米及制品質量監(jiān)督檢驗測試中心測定種子中鐵和鋅元素的含量。

1.4 基因池的構建、定位群體和總DNA的提取

以突變體ygl-63與明恢63雜交獲得F2群體。從群體中分別選取20株正常植株和20株突變植株構建正?；虺睾屯蛔兓虺?，并利用群體中的166株突變植株進行基因定位。DNA提取方法參照McCouch et al(1998)。

1.5 分子標記和遺傳圖譜的構建

簡單序列重復標記(SSR)來自Gramene數(shù)據(jù)庫(http://www.gramene.org/microsat/)。運用Primer 3 (v. 0.4.0)(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)在線軟件設計插入缺失標記(InDel)。PCR反應總體系及PCR程序參照Panaud et al(1996)進行，將擴增產(chǎn)物電泳和成像后記錄結果。所得數(shù)據(jù)用Mapmaker 3.0作圖軟件進行連鎖分析，并使用Kosambi函數(shù)將重組率進行轉化，獲得遺傳距離(厘摩，cM)，進而構建分子標記連鎖圖譜。

2　結果與分析

2.1 ygl-63的特征與主要農(nóng)藝性狀

相比野生型，突變體ygl-63植株的整個生育期均表現(xiàn)為黃綠葉表型。同時，突變體ygl-63的單株有效穗數(shù)和結實率分別減少8.9%和8.5%，千粒重增加10.4%，達到差異極顯著水平(P<0.05)。而株高、穗長和每穗著粒數(shù)等農(nóng)藝性狀在突變體ygl-63和野生型親本之間差異不顯著(圖 1，表 1)。

表 1　ygl-63和野生型的農(nóng)藝性狀

注： *P=0.05差異顯著。 下同。

Note: * Significantly different atP= 0.05. The same below.

2.2 ygl-63葉綠素含量分析

經(jīng)測定，突變體ygl-63中總葉綠素、葉綠素a和葉綠素b含量與野生型親本相比分別減少34.1%、31.9%和42.2%，葉綠素a/b值較野生型親本增加17.6%，均達到差異極顯著水平(P<0.05)(表2)。表2結果表明，葉綠素含量減少是導致ygl-63黃綠葉突變性狀的主要原因，并且ygl-63中葉綠素b含量的降幅較葉綠素a更大。

表 2　ygl-63和野生型的葉綠素含量

2.3 微量營養(yǎng)元素的含量分析

通過測定野生型親本和突變體ygl-63種子中鐵和鋅微量元素的含量，發(fā)現(xiàn)突變體ygl-63種子中的鐵和鋅元素含量分別為2.32和13.7 mg·kg-1，均明顯低于野生型親本種子中的鐵(16.26 mg·kg-1)和鋅(38.9 mg·kg-1)的含量，分別減少85.7%和64.8%，達到差異極顯著水平(P<0.05)(表 3)。

表 3　ygl-63和野生型谷粒中鐵和鋅的含量

2.4 ygl-63的遺傳分析

2.5 ygl-63(g)的分子標記定位

在水稻12條染色體上，選取230對較均勻分布的SSR引物擴增定位群體的雙親DNA，篩選出具有多態(tài)性的引物，然后用這些引物擴增正常基因池和突變基因池，結果發(fā)現(xiàn)引物RM2110和RM4601在兩池之間表現(xiàn)有明顯差異，推測兩引物可能與ygl-63(g)基因位點相連鎖。隨后利用F2群體中的20株正常葉色植株和20株突變葉色植株進行驗證，證明了兩引物確與ygl-63(g)位點有連鎖關系。利用定位群體將ygl-63(g)基因定位在水稻第11號染色體引物RM2110和RM4601之間約12.0 cM的范圍內。隨后在兩引物之間進一步的設計合成更多的分子標記，將ygl-63(g)基因最終定位在引物InDel-3 (F: TGCTTTCATCAAGATTGTGC, R: GGGGTAC-TGCTTGACTGCTC)和InDel-5 (F: CCACGCGATGA-TGTTAAGGT, R: GCAGCACAGTTTGCATTAGC)之間約2.4 cM的范圍內，遺傳距離分別約為0.9 cM和1.5 cM(圖 2)。

圖 2　ygl-63(g)基因在第11染色體長臂上基因定位Fig. 2　Gene mapping of ygl-63(g) on the long arm of chromosome 11

3　討論與結論

本研究中，我們利用化學誘變劑EMS誘變粳稻品種日本晴，獲得了一份遺傳穩(wěn)定的水稻突變體ygl-63，該突變體在全生育期均表現(xiàn)出黃綠葉的突變表型。目前所發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)水稻葉色調控基因在使得葉色發(fā)生變化的同時也會引起其他性狀的改變。例如水稻黃綠葉突變體D83，該突變體與野生型相比，成熟期每穗著粒數(shù)和千粒重分別減少9.45%和10.76%(李秀蘭等，2010)；水稻黃綠葉突變體507ys，與野生型相比，突變體507ys在成熟期株高、每穗著粒數(shù)、每株有效穗數(shù)和結實率分別減少8.3%、7.4%、51.0%和11.6%(李燕群等，2014)；水稻黃綠葉突變體ygl10，與野生型相比，突變體ygl10在成熟期株高、穗長和結實率均發(fā)生了顯著的降低或減少(楊海蓮等，2014)。同樣，突變體ygl-63除葉色變異外，還伴隨有單株有效穗數(shù)和結實率顯著降低，而千粒重顯著增加的變異性狀。單株有效穗數(shù)、結實率和千粒重是決定水稻產(chǎn)量的關鍵因素，對ygl-63進一步的研究將有利于探明水稻產(chǎn)量調控機理，其結果對于增加水稻產(chǎn)量具有重要的理論意義。

此外，我們通過測定微量營養(yǎng)元素，發(fā)現(xiàn)突變體ygl-63種子中的鐵和鋅元素含量較野生型親本顯著降低，分別減少85.7%和64.8%。鐵和鋅作為人體必需的微量營養(yǎng)元素，對人們的身體健康極為重要(鄭建仙等，1999)。缺鐵性貧血和缺鋅可引發(fā)營養(yǎng)不良、免疫功能下降、生長發(fā)育遲緩和智力降低等一系列疾病，已對我國的國民健康和社會發(fā)展構成了巨大威脅，緩解鐵鋅等微量營養(yǎng)元素缺乏所帶來的危害迫在眉睫(何一哲等，2012)。補充鐵鋅等微量營養(yǎng)元素，最好采取食補(韓龍植等，2003)。水稻作為我國重要的糧食作物，全國有近三分之二的人口以稻米為主食，對其進行品質改良，尤其是提高稻米中微量營養(yǎng)元素的含量，是當今水稻育種的一項重要任務(孫明茂等，2006)。對于突變體ygl-63的進一步研究將有助于理解水稻種子微量營養(yǎng)元素含量的調控機理，為改良水稻品質奠定理論基礎。

通過構建分離群體，我們將突變基因ygl-63(g)定位在水稻第11染色體，位于標記InDel-3和InDel-5之間，遺傳距離約為2.4 cM。目前，在同一條染色體共有6個葉色相關基因被定位，即V9(Satoh et al, 1984)，tsc1(Dong et al, 2001)，OsPPR1(Gothandam et al, 2005)，Z1(張道允等, 2008)，Z2(Chai et al, 2011)和yl11(劉朝輝等, 2012)。其中，V9突變體在幼苗期表現(xiàn)出幾乎純白色，在移栽后葉片表現(xiàn)為淺綠色和白色葉脈；tsc1突變體是一個溫敏葉色突變體，苗期低溫時表現(xiàn)葉綠素缺失，高溫時正常綠色；OsPPR1突變體表現(xiàn)出葉片白化，并伴隨有致死表型；Z1、Z2突變體均表現(xiàn)出斑馬葉表型；yl11突變體的苗期呈現(xiàn)出淡黃色表型，從分蘗期開始葉片的黃色逐漸加深，到達成熟期時葉片呈現(xiàn)出完全黃色的表型?？梢?，ygl-63與這些葉色突變體的表型性狀有很大差異，是一個新型的水稻葉綠素缺失突變體。同時，從定位結果分析，ygl-63(g)基因被定位在水稻第11染色體長臂分子標記InDel-3和InDel-5之間，與同一染色體的葉色基因不在同一范圍內，說明ygl-63(g)基因是一個新的水稻葉色突變基因。今后我們將在已有基礎上擴大定位群體，在初定位區(qū)間發(fā)展新的分子標記，精細定位、克隆ygl-63(g)基因，并進一步對該基因的功能進行研究。

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Characteristics and gene mapping of yellowish green leaf mutantygl-63 in rice (OryzasativaL.)

ZHANG Liang-Xing1， ZHANG Fan-Tao1,2*， NIE Li1， WAN Ling-Fei1，LIANG Jian-Qiu1， ZHANG Yu-Jia1， MA Yang-Shuai1， XIE Jian-Kun1

( 1.CollegeofLifeSciences，JiangxiNormalUniversity， Nanchang 330022， China； 2.KeyLaboratoryofProtectionandUtilizationofSubtropicPlantResourcesofJiangxiProvince,JiangxiNormalUniversity， Nanchang 330022， China )

Chloroplasts are important organelles in green plants for photosynthesis, and normal development of chloroplasts is important to plants. Mutant analysis is a useful approach to illuminate the function of gene in complex biological process of chloroplast development. Nowadays, extensive attention has been paid to the leaf-color mutation, and certain achievements have been made by studying various organisms, but the mechanism of mutation and the responsible loci have not been fully understood at molecular level, especially in rice. Up to now, many leaf-color mutants were reported in rice, mainly featured by etiolation, albino, brilliant green, stripe, temperature sensitive allochromasia, turning green and purple in leaf color. In this study, a rice yellowish green leaf mutantygl-63 was identified, which derived from Nipponbare (Oryzasativassp.japonica) treated by ethyl methanesulfonate (EMS). The mutantygl-63 exhibited distinct yellowish green leaf trait throughout the growth period. To characterize the yellowish green leaf phenotype of theygl-63 mutant, we measured its chlorophyll contents at the seedling stage. Compared to that of its wild-type parent Nipponbare, the content of chlorophyll (Chl) a, Chl b and total chlorophyll decreased significantly in the mutantygl-63, with 31.9%, 42.2% and 34.1% respectively, indicating that the mutant phenotype ofygl-63 was resulted from reduced chlorophyll level. In addition, the ratio of Chl a/b was increased, due likely to the potential of Chl b synthesis in suffering a more severe decline than Chl a in theygl-63 mutant; and at maturity, the number of productive panicles per plant and seed setting rate reduced by 8.9% and 8.5%, respectively; the 1 000-grain weight increased by 10.4%; but the plant height, panicle length and the number of spikelets per panicle were not affected remarkably with its wild-type parent Nipponbare. Meanwhile, by measuring the contents of micronutrients, we found that the Fe and Zn contents in the seeds ofygl-63 mutant were significantly reduced by 85.7% and 64.8% respectively, compared with its wild-type parent Nipponbare. Genetic analysis of F1and F2generations ofygl-63 mutant crossed with the normal green variety Minghui 63 (Oryzasativassp.indica) showed that the mutant trait ofygl-63 was controlled by a single recessive nuclear gene. Genetic mapping of the mutant gene was conducted by using SSR and InDel molecular markers and 166 F2plants from the cross ofygl-63 with the normal green variety Minghui 63, and the mutant gene ofygl-63 was finally mapped on the long arm of rice chromosome 11. The genetic distances from the target gene to the markers InDel-3 and InDel-5 were 0.9 and 1.5 cM, respectively. The geneygl-63 was considered to be a new rice yellowish green leaf mutant and its mutant gene was tentatively named asygl-63(g). These results will provide the information for the cloning and functional analysis ofygl-63(g) gene in the future.

rice, leaf color mutant, ethyl methanesulfonate, micronutrients, molecular marker, genetic analysis, gene mapping

10.11931/guihaia.gxzw201411029張亮行， 張帆濤， 聶麗， 等. 水稻黃綠葉突變體ygl-63的特征和基因定位 [J]. 廣西植物， 2016， 36(8):891-896

ZHANG LX， ZHANG FT， NIE L， et al. Characteristics and gene mapping of yellowish green leaf mutantygl-63 in rice (OryzasativaL.) [J]. Guihaia， 2016， 36(8):891-896

2014-11-23

2015-03-31

國家自然科學基金(31201191，31660386)； 江西省自然科學基金(20132BAB214009，20142BAB204012)； 江西省教育廳項目(GJJ14248)； 江西省亞熱帶植物資源保護與利用重點實驗室開放基金(YRD201403) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31201191，31660386)；Natural Science Foundation of Jiangxi (20132BAB214009，20142BAB204012)； Jiangxi Program of Education Office (GJJ14248)； Open Fund of Jiangxi Key Laboratory of Protection and Utilization of Subtropical Plant Resources (YRD201403)]。

張亮行(1986-)，男，碩士研究生，主要從事水稻分子生物學研究，(E-mail)121084760@qq.com。

張帆濤，博士，碩士生導師，研究方向為水稻遺傳育種與分子生物學，(E-mail)zhang84004@163.com。

Q945.45

A

1000-3142(2016)08-0891-06