葛　新，曹　章，呂鵬威，李靖若，谷元廷

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科，河南 鄭州 450052)

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miR-206抑制SDF-1/CXCR4信號(hào)活化誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移和增殖

葛新，曹章，呂鵬威，李靖若，谷元廷

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科，河南 鄭州 450052)

目的研究miR-206在乳腺癌細(xì)胞中的作用及其機(jī)制。方法MDA-MB-231細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miRNA-NC和miR-206 mimic后，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，細(xì)胞添加不同劑量(20 ng·mL-1和40 ng·mL-1)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(SDF-1)處理，利用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移，噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖，qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中CXC趨化因子受體4(CXCR4)mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中CXCR4蛋白表達(dá)水平。結(jié)果miRNA-NC組和miR-206 mimic組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分別為(83.4±6.3)%和(87.6±8.3)%。與對(duì)照組比較，SDF-1顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移和增殖(P<0.05)。miR-206 mimic轉(zhuǎn)染明顯抑制細(xì)胞遷移和增殖(P<0.05)。SDF-1處理促進(jìn)細(xì)胞中CXCR4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)。miR-206 mimic轉(zhuǎn)染則抑制CXCR4蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，但不影響CXCR4 mRNA表達(dá)(P>0.05)。結(jié)論miR-206通過抑制CXCR4表達(dá)拮抗SDF-1誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞遷移和增殖作用。

miR-206；乳腺癌；基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1；CXC趨化因子受體4；遷移；增殖

[Abstract]ObjectiveTo explore the role of miR-206 in the breast cancer cells as well as its mechanism.MethodsFollowing the transfection of miRNA-NC and miR-206 mimic into MDA-MB-231 cells,the transfection efficiency was observed with a fluorescent microscope.Meanwhile,these cells were conditioned with different doses(20 ng·mL-1and 40 ng·mL-1) of stromal-derived factor-1(SDF-1).Cell migration was evaluated by Transwell assay.Cell proliferation was determined by MTT assay.The mRNA expression of CXC chemokine receptor 4(CXCR4) was analyzed by qRT-PCR method.Protein expression of CXCR4 was analyzed by Western blot.ResultsThe transfection efficiency of the miRNA-NC group and the miR-206 mimic group was (83.4±6.3)% and (87.6±8.3)%.Compared with the control group,SDF-1 significantly promoted cancer cells migration and proliferation(P<0.05).Transfection of miR-206 mimic markedly inhibited cancer cells migration and proliferation(P<0.05).SDF-1 conditioning enhanced the mRNA and protein expression of CXCR4 in cancer cells(P<0.05).Transfection of miR-206 mimic constrained CXCR4 protein expression(P<0.05),but did not influence its mRNA expression(P>0.05).ConclusionmiR-206 counteracted the role of SDF-1 in inducing breast cancer cell migration and proliferation through regression of CXCR4 expression.

[Key words]miR-206; breast cancer; stromal-derived factor-1; CXC chemokine receptor 4; migration; proliferation

微小RNA(microRNAs，miRs)是一種進(jìn)化上保守的、長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，能夠通過序列互補(bǔ)的方式在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)[1]。miR-206在多種惡性腫瘤中具有重要的腫瘤抑制作用，包括胃癌[2]、結(jié)直腸癌[3]和乳腺癌[4]等。miR-206能夠直接靶向抑制肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白基因的表達(dá)、重塑微絲形態(tài)、抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞遷移[5]。我們前期研究[6]也發(fā)現(xiàn)miR-206可以直接靶向抑制PFKFB3分子，影響乳腺癌細(xì)胞糖酵解過程以及細(xì)胞增殖和遷移。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal-derived factor-1，SDF-1)，也稱為CXC趨化因子配體12，其跨膜信號(hào)由一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體CXC趨化因子受體4(CXC chemokine factor receptor 4，CXCR4)介導(dǎo)[7]，能激活細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣通量、趨化、轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞存活[8]。國(guó)內(nèi)有研究[9]發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌組織中SDF-1和CXCR4的表達(dá)是患者預(yù)后的重要生物學(xué)指標(biāo)。本研究擬通過研究miR-206對(duì)SDF-1作用下乳腺癌細(xì)胞行為的影響，旨在探索miR-206在乳腺癌臨床治療中的作用，為乳腺癌的生物治療提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)自于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、Trizol試劑盒、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜、硝酸纖維素膜購(gòu)自大連寶生物公司；重組人SDF-1購(gòu)自上海滬震生物科技有限公司；miRNA-NC和miR-206 mimic購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000、DNA Engine OpticonTM2熒光檢測(cè)系統(tǒng)和DyNAmo SYBR Green qPCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；抗CXCR4單克隆抗體和酶標(biāo)羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理將MDA-MB-231細(xì)胞孵育于體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、SDF-1A組、SDF-1B組、miRNA-NC組、miR-206 mimic組。SDF-1A組和SDF-1B組細(xì)胞分別用20 ng·mL-1和40 ng·mL-1SDF-1處理12 h，對(duì)照組細(xì)胞用等體積的PBS處理，miRNA-NC組和miR-206 mimic組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miRNA-NC和miR-206 mimic 24 h后，添加40 ng·mL-1SDF-1處理12 h。

1.2.2miR-206 mimic轉(zhuǎn)染miRNA-NC和miR-206 mimic干粉離心后配制成終濃度為20 mol·L-1的工作液鋪板，24 h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)3×105，轉(zhuǎn)移至Transwell上層小室中，每孔鋪200 μL細(xì)胞，加入200 μL無血清培養(yǎng)基。下層板孔中加入600 μL完全培養(yǎng)基，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，隨后取出小室用體積分?jǐn)?shù)90%乙醇固定，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%結(jié)晶紫溶液染色，置于顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取4個(gè)低倍視野(×100)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算平均值。

1.2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按每孔3×104個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板。細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)用于MTT實(shí)驗(yàn)。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分別在細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h 后進(jìn)行。按實(shí)驗(yàn)分組情況，每孔加入 20 μL MTT(5 mg·mL-1)后培養(yǎng)4 h。去掉上清，按照每孔150 μL加入二甲基亞砜?；靹蚝笥妹笜?biāo)儀測(cè)定(測(cè)量波長(zhǎng)為570 nm)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均數(shù)作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5qRT-PCR檢測(cè)利用Trizol試劑盒提取培養(yǎng)細(xì)胞系總RNA，按照步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。查找Genbank序列設(shè)計(jì)并合成CXCR4基因引物序列，上游引物：5’-GGT GGT CTA TGT TGG CGT CT，下游引物： 5’-TGG AGT GTG ACA GCT TGG AG-3’。采用DNA Engine OpticonTM2熒光檢測(cè)系統(tǒng)和DyNAmo SYBR Green qPCR 試劑盒進(jìn)行基因表達(dá)的測(cè)定。反應(yīng)體系為25 μL，其中12.5 μL DyNAmo SYBR Green qPCR mix，0.5 μL 20 pmoL引物，2 μL cDNA模板(<10 ng·mL-1)。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃ DNA變性20 s，引物在54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)，72 ℃后延伸10 min。熔解曲線的制作條件為65～95 ℃，每0.2 ℃停留1 s。目的基因和 β-actin基因的拷貝數(shù)分別根據(jù)產(chǎn)生的Ct值從各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得。取3次重復(fù)的平均值，靶基因的相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算由目的基因的拷貝數(shù)除以β-actin的拷貝數(shù)。

2　結(jié)果

2.1miR-206轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞情況miR-206 mimic及miRNA-NC轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào)(圖1)，則視為轉(zhuǎn)染成功。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)可得，miRNA-NC組和miR-206 mimic組轉(zhuǎn)染效率分別為(63.4±6.3)%和(67.6±8.3)%。

圖1　熒光顯微鏡觀察miRNA-NC和

2.2miR-206拮抗SDF-1誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移情況與對(duì)照組細(xì)胞比較，20 ng·mL-1SDF-1(SDF-1A組)和40 ng·mL-1SDF-1(SDF-1B組)處理明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞體外遷移(P<0.05)；與SDF-1A組及SDF-1B組比較，miR-206 mimic+SDF-1處理顯著降低細(xì)胞遷移(P<0.05)，而miRNA-NC+SDF-1則無影響(P>0.05)。見圖2、3。

圖2　Transwell法檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞的體外遷移

圖3　MDA-MB-231細(xì)胞體外遷移定量分析

與對(duì)照組比較，1)P<0.05；與SDF-1A組比較，2)P<0.05；與miRNA-NC比較，3)P<0.05

2.3miR-206拮抗SDF-1誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖情況與對(duì)照組細(xì)胞比較，SDF-1A組和SDF-1B組細(xì)胞增殖速率顯著升高(P<0.05)；miR-206 mimic轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞增殖速率降低(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miRNA-NC則不能改變細(xì)胞增殖速率(P>0.05)。見圖4。

圖4　MTT法檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞增殖

與對(duì)照組比較，1)P<0.05；與SDF-1A組比較，2)P<0.05；與miRNA-NC比較，3)P<0.05

2.4miR-206對(duì)乳腺癌細(xì)胞CXCR4 mRNA表達(dá)的影響qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞CXCR4 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，SDF-1A組和SDF-1B組細(xì)胞CXCR4 mRNA明顯高于未經(jīng)處理的對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miRNA-NC和miR-206 mimic對(duì)CXCR4 mRNA的表達(dá)無顯著影響(P>0.05)。見圖5。

2.5miR-206對(duì)乳腺癌細(xì)胞中CXCR4蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)細(xì)胞CXCR4蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞比較，SDF-1處理顯著促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞中CXCR4蛋白的表達(dá)(P<0.05)；但是，轉(zhuǎn)染miR-206 mimic顯著抑制細(xì)胞中CXCR4蛋白的表達(dá)(P<0.05)，轉(zhuǎn)染miRNA-NC則不能對(duì)CXCR4的表達(dá)產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。見圖6、7。

圖5　qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)

與對(duì)照組比較，1)P<0.05；與SDF-1A組比較，2)P<0.05

圖6　Western blot檢測(cè)

圖7　CXCR4蛋白條帶定量分析

與對(duì)照組比較，1)P<0.05；與SDF-1A組比較，2)P<0.05；與miRNA-NC比較，3)P<0.05

3　討論

研究[10]顯示miRNA調(diào)控細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)，既可以作為乳腺癌促癌基因也可以作為抑癌基因。促癌miRNA在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并能夠抑制下游許多與腫瘤抑制相關(guān)的基因的表達(dá)，例如原肌球蛋白1、程序性細(xì)胞凋亡因子4、同源性磷酸酶-張力蛋白、和金屬蛋白酶組織抑制因子等[10]。相反，腫瘤抑制miRNA則可以靶向抑制促癌基因，當(dāng)它們功能缺失時(shí)，則可能導(dǎo)致細(xì)胞癌變[10]。miR-206是一種抑癌基因，其表達(dá)下調(diào)與多種惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)，其中包括乳腺癌[11]、胃癌[12]等。因此，研究miR-206在乳腺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制具有重要的臨床意義。本研究利用miRNA-NC和miR-206 mimic體外轉(zhuǎn)染MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染效率可分別達(dá)(63.4±6.3)%和(67.6±8.3)%，因此可用于下一步研究，探索miR-206對(duì)腫瘤細(xì)胞的表達(dá)調(diào)控。

趨化因子家族是結(jié)構(gòu)上相關(guān)、具有4個(gè)保守半胱氨酸位點(diǎn)的趨化性細(xì)胞因子，能夠與7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合[13]。SDF-1是最先發(fā)現(xiàn)的與發(fā)育相關(guān)的趨化因子，具有調(diào)控造血作用、心臟發(fā)生、血管形成和神經(jīng)形成的功能[13]。近年來，研究[14]發(fā)現(xiàn)SDF-1在腫瘤疾病進(jìn)展中具有重要作用，利用SDF-1處理小鼠乳腺癌細(xì)胞可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。本研究首先利用2個(gè)不同劑量的SDF-1處理MDA-MB-231細(xì)胞，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2個(gè)劑量的SDF-1均可促進(jìn)細(xì)胞遷移，且具有劑量依賴性，驗(yàn)證了趨化因子SDF-1對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用。然而，當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-206 mimic時(shí)，細(xì)胞遷移受到明顯抑制，而轉(zhuǎn)染miRNA-NC則不影響細(xì)胞遷移，說明了miR-206可以拮抗SDF-1誘導(dǎo)的遷移作用。本研究同時(shí)檢測(cè)了SDF-1對(duì)細(xì)胞增殖的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2個(gè)劑量的SDF-1均可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，其中高劑量組作用最明顯。與轉(zhuǎn)染miRNA-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-206 mimic后，細(xì)胞增殖速率顯著降低，說明了miR-206具有拮抗SDF-1誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖的作用。

CXCR4是趨化因子SDF-1的經(jīng)典受體。SDF-1與CXCR4相互作用可活化下游多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及效應(yīng)因子，從而介導(dǎo)細(xì)胞存活、增殖、趨化、遷移和粘附等細(xì)胞行為[15]。詹升華等[16]研究發(fā)現(xiàn)CXCR4表達(dá)于乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞株中，SDF-1可有效促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的體外增殖和遷移。通過查閱TargetScan數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)CXCR4是miR-206的潛在靶分子之一。因此本研究猜測(cè)miR-206可能通過直接調(diào)控CXCR4的表達(dá)來影響其配體SDF-1的作用。利用qRT-PCR法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SDF-1處理可以顯著促進(jìn)細(xì)胞中CXCR4 mRNA的表達(dá)；轉(zhuǎn)染miRNA-NC以及miR-206 mimic后，細(xì)胞中CXCR4 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，說明miR-206不影響CXCR4的轉(zhuǎn)錄水平。隨后研究進(jìn)一步利用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中CXCR4蛋白的表達(dá)。與mRNA水平類似，SDF-1可以提高乳腺癌細(xì)胞中CXCR4蛋白水平；然而轉(zhuǎn)染miR-206 mimic后，CXCR4蛋白的表達(dá)水平受到顯著抑制，轉(zhuǎn)染miRNA-NC則無此作用，說明了miR-206對(duì)CXCR4表達(dá)的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-206可通過抑制乳腺癌細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)、拮抗SDF-1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移作用。本研究局限于體外實(shí)驗(yàn)，在之后研究中需要更多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)證明miR-206通過CXCR4發(fā)揮腫瘤抑制作用，從而為乳腺癌的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

[1]O’day E,Lal A.MicroRNAs and their target gene networks in breast cancer[J].Breast Cancer Res,2010,12(2):201.

[2]Yang Q,Zhang C,Huang B,et al.Downregulation of microRNA-206 is a potentprognostic marker for patients with gastric cancer[J].Eur J Gastroenterol Hepatol,2013,25(8):953-957.

[3]Parasramka MA,Dashwood WM,Wang R,et al.A role for low-abundance miRNAs in colon cancer:the miR-206/Kruppel-like factor 4(KLF4) axis[J].Clin Epigenetics,2012,4(1):16.

[4]Li Y,Hong F,Yu Z.Decreased expression of microRNA-206 in breast cancer and its association with disease characteristics and patient survival[J].J Int Med Res,2013,41(3):596-602.

[5]Wang J,Tsouko E,Jonsson P,et al.miR-206 inhibits cell migration through direct targeting of the actin-binding protein coronin 1C in triple-negative breast cancer[J].Mol Oncol,2014,8(8):1690-1702.

[6]Ge X,Lyu P,Cao Z,et al.Overexpression of miR-206 suppresses glycolysis,proliferation and migration in breast cancer cells via PFKFB3 targeting[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,463(4):1115-1121.

[7]Bleul CC,Farzan M,Choe H,et al.The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry[J].Nature,1996,382(6594):829-833.

[8]Scala S.Molecular Pathways:Targeting the CXCR4-CXCL12 Axis--Untapped Potential in the Tumor Microenvironment[J].Clin Cancer Res,2015,21(19):4278-4285.

[9]孔令禹,付勤燁.SDF-1、CXCR4在三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的相關(guān)性[J].山東醫(yī)藥,2014,54(38):22-25.

[10]Zhang K,Zhang Y,Liu C,et al.MicroRNAs in the diagnosis and prognosis of breast cancer and their therapeutic potential(review)[J].Int J Oncol,2014,45(3):950-958.

[11]Sasaki A,Tsunoda Y,Tsuji M,et al.Decreased miR-206 expression in BRCA1 wild-type triple-negative breast cancer cells after concomitant treatment with gemcitabine and a Poly(ADP-ribose) polymerase-1 inhibitor[J].Anticancer Res,2014,34(9):4893-4897.

[12]Zhang L,Xia L,Zhao L,et al.Activation of PAX3-MET pathways due to miR-206 loss promotes gastric cancer metastasis[J].Carcinogenesis,2015,36(3):390-399.

[13]Nagasawa T.CXC chemokine ligand 12(CXCL12) and its receptor CXCR4[J].J Mol Med(Berl),2014,92(5):433-439.

[14]Wani N,Nasser MW,Ahirwar DK,et al.C-X-C motif chemokine 12/C-X-C chemokine receptor type 7 signaling regulates breast cancer growth and metastasis by modulating the tumor microenvironment[J].Breast Cancer Res,2014,16(3):R54.

[15]Xu C,Zhao H,Chen H,et al.CXCR4 in breast cancer:oncogenic role and therapeutic targeting[J].Drug Des Devel Ther,2015,9:4953-4964.

[16]詹升華,鄧敏,顧冬梅,等.CXCR4/SDF-1α信號(hào)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的體外增殖和遷移的促進(jìn)作用[J].山東醫(yī)藥,2011,51(32):13-15.

MiR-206 Suppresses Breast Cancer Cell Migration and Proliferation Induced by SDF-1/CXCR4 Signaling

Ge Xin,Cao Zhang,Lv Pengwei,Li Jingruo,Gu Yuanting

(DepartmentofBreastSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

葛新(1981-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事乳腺疾病基礎(chǔ)和臨床研究。E-mail：gexin1981@126.com

谷元廷(1965-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事乳腺疾病基礎(chǔ)和臨床研究。E-mail：zzyuantinggu@126.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.04.005

R737.9；R730.23

A

1673-5412(2016)04-0294-05

2016-07-06)