王建君，孫淼淼，張紅新，陳奎生

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科、河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052；2.鄭州人民醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450000；3.河南省腫瘤醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450008)

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食管鱗癌組織中GRIM-19的表達(dá)及意義

王建君1，2，孫淼淼3，張紅新1，陳奎生1

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科、河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052；2.鄭州人民醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450000；3.河南省腫瘤醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450008)

目的探討干擾素/維甲酸聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(GRIM-19)在食管鱗癌組織中的表達(dá)及意義。方法采用免疫組化S-P法檢測(cè)50例食管鱗癌組織、50例正常食管黏膜組織、30例癌旁不典型增生組織中GRIM-19蛋白表達(dá)；應(yīng)用原位雜交法檢測(cè)50例食管鱗癌組織、50例正常的食管黏膜組織、30例癌旁不典型增生的組織中GRIM-19 mRNA的表達(dá)。結(jié)果GRIM-19蛋白、mRNA在食管鱗癌組織中陽性表達(dá)率明顯低于癌旁不典型增生組織以及正常的食管黏膜組織，三者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。GRIM-19蛋白、mRNA的陽性表達(dá)率與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P均<0.05)，而與患者的性別、年齡均無關(guān)(P均>0.05)。結(jié)論GRIM-19表達(dá)與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其表達(dá)的降低可能促進(jìn)食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。

食管鱗癌；干擾素/維甲酸聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因；免疫組化；原位雜交

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expressions and clinical significances of gene associated with retinoid-interferon-induced mortality 19(GRIM-19) protein and mRNA in the esophageal squamous cell carcinoma tissues.MethodsThe expressions of GRIM-19 protein and mRNA in the 50 cases of esophageal squamous cell carcinoma tissues,50 cases of normal esophageal mucosa tissues and 30 cases of adjacent atypical hyperplasia tissues were de-tected by immunohistochemistry and in situ hybridization methods.ResultsThe expression of GRIM-19 protein and mRNA in the esophageal squamous carcinoma tissues were significantly lower than those of the atypical hyperplasia tissue adjacent to carcinoma and the normal esophageal mucosa(P<0.05).The GRIM-19 protein and mRNA positive expression rates were associated with tumor infiltration depth and lymph node metastasis(P<0.05),and had nothing to do with the age and gender(P>0.05).ConclusionThe GRIM-19 lower expression may be related to the occurrence and development of esophageal squamous carcinoma.

[Key words]esophageal squamous cell carcinoma; gene associated with retinoid-interferon-induced mortality 19; immunohistochemistry; in situ hybridization

干擾素/維甲酸聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因19(gene associated with retinoid-interferon-induced mortality 19，GRIM-19)是NADH脫氫酶I的亞單位，在線粒體的呼吸過程中發(fā)揮著重要作用[1]，其在正常組織中表達(dá)，但在腫瘤組織中卻呈現(xiàn)出不同程度的異常表達(dá)。研究[2-3]表明，GRIM-19是一種新的與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、凋亡等有關(guān)的基因。有關(guān)GRIM-19表達(dá)與食管癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，本研究采用免疫組化S-P法檢測(cè)50例食管鱗癌組織、50例正常食管黏膜組織、30例癌旁不典型增生組織中GRIM-19蛋白的表達(dá)，應(yīng)用原位雜交法檢測(cè)50例食管鱗癌組織、50例正常食管黏膜組織、30例癌旁不典型增生組織中GRIM-19 mRNA的表達(dá)，探討GRIM-19表達(dá)與食管癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料50例食管鱗癌標(biāo)本選取河南省腫瘤醫(yī)院病理科2013年1月至2013年12月手術(shù)切除的標(biāo)本，所有被選擇的患者術(shù)前均未接受過放療、化療及其他相關(guān)治療，臨床資料完整，并由兩名以上經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生診斷證實(shí)為食管鱗癌。每例標(biāo)本分別取癌組織、癌旁組織以及正常食管黏膜組織(手術(shù)切緣/距癌組織邊緣4 cm以外的組織)。所取標(biāo)本均經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定，經(jīng)常規(guī)脫水，采用石蠟包埋，進(jìn)行連續(xù)切片，備用。50例食管鱗癌標(biāo)本中，男26例，女24例；年齡34～79歲，中位年齡61歲，年齡≥60歲者30例，<60歲者20例；臨床分期根據(jù)2009年第7版國(guó)際抗癌聯(lián)盟食管癌的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定，浸潤(rùn)到黏膜下層或淺肌層者10例，浸潤(rùn)到深肌層者12例，浸潤(rùn)至全層或外膜者28例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例。

1.2主要試劑GRIM-19鼠抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；5’端生物素標(biāo)記GRIM-19探針(5’-GCGTCGAGGACTGTCGGG-3’)由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成；S-P免疫組化通用試劑盒、SA-AP顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3免疫組化步驟染色步驟按照免疫組化S-P法試劑盒說明進(jìn)行，高壓抗原修復(fù)，DAB顯色,蘇木素復(fù)染。采用已知陽性表達(dá)的組織切片作陽性對(duì)照；用0.01 mol·L-1PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4免疫組化結(jié)果判斷GRIM-19陽性產(chǎn)物定位于細(xì)胞漿，陽性染色為黃色或棕黃色。GRIM-19陽性表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)組織中陽性細(xì)胞所占的百分比以及陽性細(xì)胞的染色深度來進(jìn)行綜合的評(píng)分。陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：隨機(jī)選取10個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。以陽性細(xì)胞比例≤10%為0分，>10%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～100%為3分。陽性細(xì)胞的染色深度評(píng)分：陽性細(xì)胞無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。2項(xiàng)評(píng)分的乘積作為該標(biāo)本的積分，≤2分為陰性，>2分為陽性。

1.5原位雜交步驟組織經(jīng)新鮮配制二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水后,用新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶；質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%檸檬酸新鮮配制蛋白酶消化標(biāo)本DNA結(jié)合蛋白；滴加不含探針的預(yù)雜交液(42 ℃),預(yù)雜交4 h；滴加含探針的雜交液,42 ℃濕盒內(nèi)雜交12 h；滴加SA-AP 37 ℃,30 min,BCIP/NBT,避光顯色2～4 h。用已知GRIM-19 mRNA陽性表達(dá)的組織切片作為陽性對(duì)照，用不含探針的預(yù)雜交液孵育標(biāo)本作為陰性對(duì)照。

1.6原位雜交結(jié)果判斷GRIM-19 mRNA陽性表達(dá)均主要存在于細(xì)胞漿中，呈藍(lán)紫色顆粒。GRIM-19 mRNA表達(dá)的結(jié)果判定：根據(jù)陽性細(xì)胞在組織中所占百分比以及染色的深度來綜合評(píng)分。陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：陽性細(xì)胞百分率為隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，≤10%陽性細(xì)胞記為0分，11%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%為3分。陽性細(xì)胞染色深度評(píng)分：無色為0分，淡紫藍(lán)色為1分，紫藍(lán)色為2分，深紫藍(lán)色為3分。以2項(xiàng)評(píng)分的乘積作為該標(biāo)本的積分，≤2分為陰性，>2分為陽性。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料的相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1GRIM-19蛋白在不同食管組織中的表達(dá)GRIM-19蛋白在食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率為20.00%(10/50)，癌旁不典型增生組織為76.67%(23/30)，正常食管黏膜組織為84.00%(42/50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.13，P<0.05)。見圖1、表1。

圖1　GRIM-19蛋白在不同食管組織中的表達(dá)(S-P，×100)

組別n陽性陰性陽性表達(dá)率/%χ2P正常食管黏膜組織5042884.00癌旁不典型增生組織3023776.6712.130.034食管鱗癌組織50104020.00

2.2GRIM-19蛋白的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系GRIM-19蛋白的陽性表達(dá)率與食管鱗癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P均<0.05)，而與患者的年齡、性別均無關(guān)(P均>0.05)。見表2。

2.3GRIM-19 mRNA在不同食管組織中的表達(dá)GRIM-19 mRNA在食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率為24.00%(12/50)，癌旁不典型增生組織為76.67%(23/30)，正常食管黏膜組織為88.00%(44/50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.83，P<0.05)。見表圖2、表3。

2.4GRIM-19 mRNA的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系GRIM-19 mRNA的陽性表達(dá)率與食管鱗癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P均<0.05)，而與患者年齡、性別均無關(guān)(P均>0.05)。見表4。

表2GRIM-19蛋白的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

臨床病理參數(shù)nGRIM-19蛋白陽性陰性陽性表達(dá)率/%χ2P性別 男2671926.900.050.405 女2432112.50年齡/歲 ≥603042613.343.260.732 <602061430.00浸潤(rùn)深度 淺肌層105550.00 深肌層123925.006.610.037 全層282267.10淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有2532212.005.710.041 無2571828.00

圖2　GRIM-19 mRNA在不同食管組織中的表達(dá)(ISH，×200)

A：正常食管黏膜組織；B：癌旁不典型增生組織；C：食管鱗癌組織

表3GRIM-19 mRNA在不同食管組織中的表達(dá)

組別n陽性陰性陽性表達(dá)率/%χ2P正常食管黏膜組織5044688.00癌旁不典型增生組織3023776.6711.830.038食管鱗癌組織50123824.00

3　討論

GRIM-19定位于第19號(hào)染色體，主要在線粒體內(nèi)膜表達(dá)[4]。在多種正常組織(如心肌、肺臟、胸腺、骨骼肌、結(jié)腸)中均能檢測(cè)到GRIM-19表達(dá)[5]，通常是病毒癌基因結(jié)合的靶點(diǎn)。

研究[6-8]發(fā)現(xiàn)，GRIM-19基因的突變、蛋白表達(dá)降低或缺失發(fā)生在泌尿系統(tǒng)腫瘤、消化系統(tǒng)腫瘤等多種腫瘤組織中，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并有可能成為基因治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。另有研究[9]表明，GRIM-19在正常宮頸組織中高表達(dá)，在宮頸癌組織中的表達(dá)降低，其表達(dá)降低可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。研究[10-11]表明，GRIM-19表達(dá)可以抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能是宮頸癌治療的新靶點(diǎn)，此外，在一些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，上調(diào)GRIM-19的表達(dá)可抑制腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。下調(diào)GRIM-19的表達(dá)可促進(jìn)腎腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)育。但有關(guān)GRIM-19表達(dá)與食管癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

表4GRIM-19 mRNA的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

臨床病理參數(shù)nGRIM-19mRNA陽性陰性陽性表達(dá)率/%χ2P性別 男2671926.920.070.078 女2451920.83年齡/歲 ≥603072323.330.060.089 <602051525.00浸潤(rùn)深度 淺肌層104640.00 深肌層123925.006.440.045 全層2852317.86淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有2552020.005.130.036 無2571828.00

本研究結(jié)果顯示，GRIM-19蛋白、mRNA在食管鱗癌組織中陽性表達(dá)率明顯低于癌旁不典型增生組織、正常食管黏膜組織(P<0.05)。GRIM-19蛋白、mRNA的陽性表達(dá)率與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P均<0.05)，而與患者的性別、年齡均無關(guān)(P均>0.05)?？傊?，GRIM-19低表達(dá)可能與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，該研究結(jié)果為進(jìn)一步探討食管癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供了理論依據(jù)。

[1]Fitzgibbons PL,Page DL,Weaver D,et al.Prognostic factors in breast cancer.College of American Pathologists Consensus Statement 1999[J].Arch Pathol Lab Med,2000,124(7):966-978.

[2]Nallar SC,Kalakonda S,Sun P,et al.Identification of a structural motif in the tumor-suppressive protein GRIM-19 required for its antitumor activity[J].Am J Pathol,2010,177(2):896-907.

[3]Yeo WM,Isegawa Y,Chow VT.The U95 protein of human herpesvirus 6B interacts with human GRIM-19:silencing of U95 expression reduces viral load and abrogates loss of mitochondrial membrane potential[J].J Virol,2008,82(2):1011-1020.

[4]Zhang L,Gao L,Li Y,et al.Effects of plasmid-based Stat3-specific short hairpin RNA and GRIM-19 on PC-3M tumor cell growth[J].Clin Cancer Res,2008,14(2):559-568.

[5]Proietti C,Salatino M,Rosemblit C,et al.Progestins induce transcriptional activation of signal transducer and activator of transcription 3(Stat3) via a Jak- and Src-dependent mechanism in breast cancer cells[J].Mol Cell Biol,2005,25(12):4826-4840.

[6]周穎,凌斌.GRIM-19的功能及與腫瘤的相關(guān)性[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志,2008,5(3):262.

[7]沈國(guó)華，蔡華偉，趙禎.GRIM-19 及其相關(guān)蛋白促凋亡機(jī)制的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2015,28(3)：303-307.

[8]龔龍波,胡俊波.GRIM-19及其靶基因產(chǎn)物STAT3與結(jié)直腸癌惡性程度的關(guān)系[J].癌癥,2007,26(7):683-687.

[9]朱靖，衛(wèi)瑩，周穎.宮頸鱗組織中GRIM-19蛋白的表達(dá)及其臨床意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2010,26(6)：681-683.

[10]程勇，周穎，衛(wèi)瑩.GRIM-19 的表達(dá)對(duì)人子宮頸癌細(xì)胞移植瘤細(xì)胞侵襲、凋亡的影響研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010,14(5)：733-735.

[11]Cohen HT,McGovern FJ.Renal-cell carcinoma[J].N Engl J Med，2005，353(23):2477-2490.

Expression and Signficance of GRIM-19 in the Esophageal Squamous Carcinoma Tissues

Wang Jianjun1,2,Sun Miaomiao3,Zhang Hongxin1,Chen Kuisheng1

(1.DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China；2.DepartmentofPathology,thePeople'sHospitalofZhengzhou,Zhengzhou450000,China；3.DepartmentofPathology,HenanTumorHospital,Zhengzhou450008,China)

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：142300410076)

王建君(1984-)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事腫瘤病理學(xué)研究。E-mail:173939918@ qq.com

陳奎生(1964-)，男，博士，教授，主要從事腫瘤病理學(xué)研究。E-mail:chenksh2002@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.04.004

R735.1；R730.23

A

1673-5412(2016)04-0290-04

2016-01-13)