馬怡暉，龐　霞，許晶晶，夏培苡，高漢青

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科、河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

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RBD+ODC及其突變體融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)驗(yàn)證

馬怡暉，龐霞，許晶晶，夏培苡，高漢青

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科、河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

目的構(gòu)建RBD+ODC及其突變體融合表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行驗(yàn)證。方法選取Ras下游效應(yīng)分子Raf-1中能夠與K-Ras蛋白相互作用的RBD+CRD氨基酸片段作為結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以O(shè)DC蛋白分子全長作為功能結(jié)構(gòu)域。以正常人胰腺組織的cDNA為模板擴(kuò)增相應(yīng)的目的基因片段，應(yīng)用分子克隆的方法通過在引物中引入GS片段使結(jié)合結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域相連并通過雙輪PCR法在ODC功能位點(diǎn)引入突變，所獲得的核苷酸片段均連入pcDNA3.1真核表達(dá)載體中。結(jié)果與結(jié)論經(jīng)測序和Western Bolt驗(yàn)證，成功構(gòu)建了RBD+ODC及突變體RBD+ODC的重組質(zhì)粒，2種質(zhì)粒均能夠在人HEK293T細(xì)胞中正常表達(dá)。

結(jié)合結(jié)構(gòu)域；功能結(jié)構(gòu)域；RBD；ODC；AZ

[Abstract]ObjectiveTo construct RBD+CRD and mutant RBD+CRD expressing vectors.MethodsThe RBD+CRD was chosen as the binding domain,and full length ODC as function domain,and the two domain were connected by molecular cloning.The mutant “RBD+ODC” was constructed by two step PCR.All the nucleotide fragments were connected into pcDNA3.1 vector.Results and ConclusionRBD+CRD and mutant RBD+CRD were constructed successfully by validation of sequencing and Western blot.

[Key words]binding domain; function domain; RBD; ODC; AZ

生物體內(nèi)蛋白分子降解的途徑有2種，第1種是泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)，該途徑控制著生物體內(nèi)絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解，主要由泛素分子、泛素激活酶E1、泛素轉(zhuǎn)移酶E2、泛素連接酶E3及26S蛋白酶體構(gòu)成，通過對底物的泛素化修飾完成對底物蛋白的降解[1]。第2種是鳥甘酸脫羧酶/抗酶系統(tǒng)(ODC/AZ)，其中ODC直接與底物蛋白結(jié)合，自身形成二聚體，進(jìn)一步與抗酶AZ結(jié)合后蛋白構(gòu)像被改變而直接被26S蛋白酶體識別降解[2-4]。相比較于第1種途徑，ODC/AZ系統(tǒng)對蛋白的降解不需要泛素化修飾，因此作用更直接快速。我們擬在前期靶向泛素化降解K-Ras癌蛋白研究的基礎(chǔ)上[5]，嘗試應(yīng)用ODC/AZ系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)敲減胰腺癌細(xì)胞中K-Ras癌蛋白，而研究的關(guān)鍵就是構(gòu)建能夠與K-Ras癌蛋白相互作用的融合蛋白，該融合蛋白需同時能夠與K-Ras癌蛋白相互結(jié)合，又要保留ODC分子的活性作用。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天根生物有限公司)，DNA聚合酶、dNTP、各種核酸內(nèi)切酶、T4連接酶(日本Takara公司)，質(zhì)粒提取試劑盒、lipofection2000轉(zhuǎn)染試劑、高溶點(diǎn)瓊脂糖(美國lnvitrogen公司)，鼠抗人β-actin單克隆抗體、c-Myc標(biāo)簽單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，HPR標(biāo)記二抗(北京中杉金橋生物有限公司)，丙烯酰胺、N’N’-亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸胺、SDS(美國Pierce公司)，DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(天津?yàn)柟?，ECL發(fā)光液(北京普利萊公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人HEK293T細(xì)胞系用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2孵箱中。

圖1　雙輪PCR定點(diǎn)突變ODC活性位點(diǎn)示意圖

以mRBD+CRD作為模板，分別應(yīng)用雙輪引物(A和B)擴(kuò)增出相應(yīng)的核苷酸片斷；再以第1輪上游引物和第2輪下游引物作為引物(C)擴(kuò)增含有突變位點(diǎn)的核苷酸片斷

表1各擴(kuò)增片段的引物序列

引物名稱引物序列RBD正向5’-CGGGATCCATGGGCAAACTCACAGATCCTTCTAAGACAAG-3’RBD反向5’-TAAAGCGGCCGCGAATTCAGGCATCCTGGAAACAGACTC-3’ODC正向5’-ATTTGCGGCCGCGGTTCCGGTTCCGGTTCCGGTTCCATGAACAACTTTGGTAATGAAGAG-3’ODC反向5’-CTACACATTAATACTAGCCGAAGCACAGGCTGCTCTGTGG-3’mRBD+ODC第1輪正向5’-CGGGATCCATGGGCAAACTCACAGATCCTTCTAAGACAAG-3’mRBD+ODC第1輪反向5’-CACATCCTCAGATCCAGGAAAGGTGGTGCCAATATCAAGC-3’mRBD+ODC第2輪正向5’-GCATGTATCTGCTTGATATTGGCACCACCTTTCCTGGATC-3’mRBD+ODC第2輪反向5’-CTACACATTAATACTAGCCGAAGCACAGGCTGCTCTGTGG-3’

1.4RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄參照Trizol Reagent試劑盒說明書，提取正常人胰腺組織中的總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增相應(yīng)的目的基因或片段。表2列出了各表達(dá)載體中連入核苷酸的理論數(shù)目。

1.5測序所有測序工作均委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.6融合蛋白表達(dá)驗(yàn)證用RIPA裂解液處理瞬時轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒48 h后的人HEK293T細(xì)胞，提取相應(yīng)的蛋白，以β-actin作為內(nèi)參，采用Western blot方法對不同處理組中攜帶有Myc標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。表2列出了各融合蛋白分子氨基酸理論數(shù)目及相應(yīng)的蛋白相對分子質(zhì)量。

2　結(jié)果

2.1質(zhì)粒測序驗(yàn)證所有構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)測序證實(shí)，連入的核苷酸序列是正確的。見圖2。

表2多肽片段在原蛋白分子中的氨基酸位點(diǎn)及選用的酶切位點(diǎn)

片段名稱理論氨基酸殘基位數(shù)/aa實(shí)際連入氨基酸殘基位數(shù)/aa目的片段核苷酸數(shù)目/bp融合蛋白相對分子質(zhì)量(×103)選用酶切位點(diǎn)RBD+CRD/mRBD+CRD51～22046～225195776.0上游BamHI/下游NotIODC1～461(全長)1～461(全長)138354.5上游NotI/下游XhoI

圖2　測序結(jié)果(A：RBD+ODC；B:mRBD+ODC)

2.2質(zhì)粒表達(dá)驗(yàn)證將所構(gòu)建的2個融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染人HEK293T細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，裂解后上樣檢測各重組質(zhì)粒Myc標(biāo)簽表達(dá)情況。設(shè)立pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組作為對照，以管家基因β-actin作為內(nèi)參，結(jié)果顯示2個融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒均可正常表達(dá)，蛋白相對分子質(zhì)量與理論值基本一致。見圖3。

3　討論

蛋白敲減技術(shù)是依據(jù)泛素-蛋白酶體途徑特異性降解蛋白分子的原理發(fā)展而來，通過構(gòu)建能與底物蛋白特異性結(jié)合的融合型泛素連接酶E3蛋白[7-10]或化學(xué)合成PROTACS小分子[11-14]，直接在蛋白水平(即翻譯后水平)實(shí)現(xiàn)對底物蛋白的降解(即敲減)。因此與傳統(tǒng)的基因沉默技術(shù)相比，該技術(shù)具有更大的靈活性。我們前期研究應(yīng)用該策略，構(gòu)建了能夠與Ras癌蛋白相互結(jié)合的融合型E3，該E3通過泛素化途徑靶向敲減了胰腺癌細(xì)胞中的K-Ras癌蛋白并抑制了胰腺癌細(xì)胞的生長活性。ODC/AZ系統(tǒng)是不同于UPP的另一條蛋白降解途徑，該蛋白降解過程不依賴泛素化修飾，因此受影響因素少，作用更直接快速。理論上，將能夠與底物結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域同ODC融合表達(dá)，在AZ的催化下，應(yīng)該可以實(shí)現(xiàn)不依賴泛素化修飾的蛋白降解。因次，本研究在前期靶向泛素化降解K-Ras癌蛋白的基礎(chǔ)上，嘗試通過構(gòu)建能與KRAS相互作用的RBD+ODC融合蛋白，實(shí)現(xiàn)對K-Ras不依賴泛素化修飾的降解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用分子克隆手段，我們成功構(gòu)建了RBD+ODC以及突變體RBD+ODC的重組質(zhì)粒，2種質(zhì)粒均能夠在人HEK293T細(xì)胞中正常表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)為下一步深入研究并評價(jià)RBD+ODC作為敲減底物蛋白工具的作用有效性奠定了基礎(chǔ)。

圖3　Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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Construction and Validation of RBD+CRD and Mutant RBD+CRD Expressing Vectors

Ma Yihui,Pang Xia,Xu Jingjing,Xia Peiyi,Gao Hanqing

(DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(編號：81401936)

馬怡暉(1978- )，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事胰腺癌發(fā)病機(jī)制研究。E-mail:allsunshine123@126.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.04.001

R735.9;R730.23

A

1673-5412(2016)04-0277-04

2016-05-10)