王　微, 李圓萍, 謝惠玲, 肖清鐵, 鄭梅琴, 陳　燊, 何小三, 鄭新宇, 林瑞余, 林文雄

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所, 福建 福州 350002)

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銅綠假單胞菌菌劑載體的篩選

王微, 李圓萍, 謝惠玲, 肖清鐵, 鄭梅琴, 陳燊, 何小三, 鄭新宇, 林瑞余, 林文雄

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所, 福建 福州 350002)

為將銅綠假單胞菌應(yīng)用于重金屬污染環(huán)境的生物修復(fù)，以硅藻土(1～3 mm)、硅藻土(3～6 mm)、活性炭和輕石為材料，通過測定不同材料的吸水率、菌體吸附與釋放作用及制備菌劑的活菌數(shù)，篩選出適宜的菌劑載體.結(jié)果表明，在設(shè)定的載體濃度下(0～20 g·L-1)，不同載體的菌體去除率隨濃度提高而增大，Q值在4.90%～49.60%之間；載體負(fù)載量隨濃度提高而減小，L值在923.33～82.83 mg·g-1之間；硅藻土、活性炭的Q值在30 min達(dá)到最大.硅藻土(1～3 mm)、硅藻土(3～6 mm)、活性炭和輕石的吸水率依次為60.3%、43.3%、23.4%和33.1%；以上4種載體制備的菌劑(菌劑A、B、C和D)的活菌釋放率依次為27.4%、28.8%、19.7%和37.1%.室溫保存30 d后，菌劑A活菌數(shù)為6.25×108CFU·g-1，減少了78.4%，菌劑B活菌數(shù)為1.12×1010CFU·g-1，是初始值的5.38倍，菌劑C的活菌數(shù)為2.95×108CFU·g-1，減少了73.9%，菌劑D的活菌數(shù)為3.61×109CFU·g-1，增殖了127.0%.可見，載體濃度及吸附時(shí)間顯著影響其對菌體的吸附作用，3～6 mm硅藻土的負(fù)載量適中，菌體存活率高，活菌釋放率高，可作為銅綠假單胞菌的菌劑載體.

銅綠假單胞菌; 菌劑; 載體; 硅藻土; 活性炭; 輕石; 吸附作用

農(nóng)田土壤重金屬污染問題已引起人們的高度重視，研制微生物菌劑用于污染土壤的修復(fù)，可有效降低農(nóng)產(chǎn)品安全風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)農(nóng)田可持續(xù)經(jīng)營.假單胞菌是廣布于自然環(huán)境中的革蘭氏陰性菌，具有氧化降解生物表面活性劑等作用，能在碳?xì)浠衔?、多氯?lián)苯等污染的環(huán)境中存活[1-4]，還可通過外排泵及細(xì)胞內(nèi)的氧化還原酶系統(tǒng)對重金屬產(chǎn)生抗性，具有重金屬污染修復(fù)潛力[5-7].銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是一種眾所周知的植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)，具有根際集群能力強(qiáng)、世代時(shí)間短、易于遺傳操作、能夠產(chǎn)生鐵載體、分泌植物抗病物質(zhì)及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等作用，已被廣泛用作生防菌[8,9].一些研究表明，銅綠假單胞菌具較強(qiáng)的重金屬耐性和富集能力[10,11]，具有一定的重金屬生物修復(fù)潛力；且有研究表明，芽孢桿菌制成的顆粒狀菌劑已用于廢水中金屬離子的回收[12]；酵母菌R32經(jīng)凝膠海藻酸鈉包埋固定后可較好地去除水中六價(jià)鉻[13].通過選擇適當(dāng)?shù)妮d體，將具有根際促生作用的銅綠假單胞菌制成菌劑并用于農(nóng)業(yè)重金屬污染修復(fù)，可為農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)提供技術(shù)支持.現(xiàn)有可供選擇的菌劑載體種類繁多、性能各異，以硅藻土最為常見，活性炭和輕石等載體亦具良好的吸附性能[14-20].硅藻土對水中Cd2+、Pb2+具有較好的吸附效果[21]，已有用做熒光假單胞菌P13菌劑的載體的研究報(bào)道[22]；活性炭是重金屬的常用吸附劑[23]；輕石具有一定吸附能力并被用做光催化載體[24]，經(jīng)赤泥改性的浮石吸附劑可去除水體中的砷[22]；周鐵海等[25]也以浮石為載體，制備了La3+和Fe3+摻雜TiO2的復(fù)合光催化劑，用于去除污水中的TOC.目前，有關(guān)農(nóng)田重金屬污染修復(fù)微生物菌劑的研究極少，本課題組前期從水稻根際土壤分離出一株具有良好的鎘富集能力的銅綠假單胞桿菌，該菌株對水稻生長有一定的促進(jìn)作用.本研究通過評價(jià)硅藻土、活性炭及輕石作為菌劑載體的吸附作用、吸水率及其制備菌劑的有效菌體的釋放率、菌體存活率等，篩選出合適的菌劑載體，為銅綠假單胞桿菌菌劑的開發(fā)與應(yīng)用提供依據(jù).

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

載體材料硅藻土和輕石均購買自上海秋草園藝設(shè)備有限公司，硅藻土A的粒徑為1～3 mm，硅藻土B的粒徑為3～6 mm，呈灰白色，質(zhì)地較軟，質(zhì)量輕，具有含大量微孔，空腔和通道的復(fù)雜結(jié)構(gòu)；輕石又稱浮石或浮巖，質(zhì)量輕，能浮于水，多孔，表面粗糙，吸附能力較強(qiáng).顆粒狀活性炭購買自上海展云化工有限公司，黑色顆粒狀，具多孔結(jié)構(gòu)，比表面積約1 000 m2·g-1.各載體材料經(jīng)過兩次高壓滅菌(121 ℃，30 min)、烘干后備用.供試銅綠假單胞桿菌菌株為課題組分離出的耐鎘菌株(甘油保存，-80 ℃超低溫冰箱)，菌株采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基活化、培養(yǎng)，培養(yǎng)基pH 7.2，培養(yǎng)溫度37 ℃.

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1載體對菌體的吸附作用在無菌條件下，分別將0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 g載體加人到裝有90 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，保持37 ℃,pH=7.2，混勻，然后加入10 mL培養(yǎng)24 h的菌懸液，在恒溫?fù)u床上吸附30 min, 測定不同載體的菌體去除率Q和載體負(fù)載量L[22].Q(%)=(C-C′)/C×100,菌體質(zhì)量以細(xì)胞濕重計(jì)算，C、C′分別為吸附前后溶液中菌體的質(zhì)量濃度(mg·L-1)；L(mg·g-1)=(C-C′)/C0,C0為載體用量(g·L-1).同時(shí)，分別稱取1.0 g不同載體，加入100 mL的菌液中，設(shè)置載體濃度為10 g·L-1的處理,在吸附的5,10,15,20,25,30 min，分別測定菌體去除率Q和載體負(fù)載量L，分析兩者隨時(shí)間的變化.各處理設(shè)3次重復(fù).

1.2.2不同載體吸水率的測定稱取載體材料100 g，在無菌條件下，加入無菌水，混勻并使載體材料濕潤，保持疏松、不結(jié)塊，吸水率以100 g載體所含的液體量表示，各處理3次重復(fù).

1.2.3菌劑的制備及其有效菌體釋放率的測定稱取等量的硅藻土A、硅藻土B、活性炭、輕石于小燒杯中，經(jīng)兩次高壓滅菌，每次121 ℃處理30 min，65 ℃烘干備用；在無菌條件下，根據(jù)4種載體材料的吸水率加入銅綠假單胞菌菌液，混勻并保持載體材料濕潤、疏松、不結(jié)塊，制成菌劑.制備的菌劑依次命名為菌劑A、菌劑B、菌劑C和菌劑D，并放置在陰涼處室溫保存.保存2 d后分別取0.1 g菌劑加入到盛有100 mL無菌水的250 mL錐形瓶中，37 ℃恒溫?fù)u蕩2 h后，立即稀釋涂布，測定有效菌體釋放率，各試驗(yàn)3次重復(fù).有效菌體釋放率(%)=釋放細(xì)菌密度/接種細(xì)菌密度(CFU)×100%[22].

1.2.4菌劑中菌體存活率的測定在菌劑室溫保存的2、7、14和30 d，分別稱取0.1 g菌劑，加人到盛有100 mL無菌水的250 mL錐形瓶中，恒溫?fù)u蕩培養(yǎng)2 h后進(jìn)行稀釋涂布，測定活菌數(shù)，菌體存活率用測定值與初始菌數(shù)的比值表示，試驗(yàn)3次重復(fù).

1.2.5數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)分析采用DPS V7. 05和SPSS 17.0系統(tǒng)軟件，樣本平均數(shù)的差異顯著性比較采用LSD法進(jìn)行.

2　結(jié)果與分析

2.1載體濃度對吸附效果的影響

由圖1可見，不同的載體菌體去除率Q均隨載體用量的增加而增大.在載體濃度小于2 g·L-1時(shí)，活性炭的菌體去除率最高(11.2%)；在濃度為4 g·L-1時(shí)，Q值為：硅藻土A(18.5%)>活性炭(14.4%)>硅藻土B(11.7%)>輕石；在濃度大于4 g·L-1時(shí)，菌體去除率為：硅藻土A>硅藻土B>活性炭>輕石.在載體濃度為20 g·L-1時(shí)，4種載體對銅綠假單胞桿菌的去除能力分別為49.60%、41.57%、36.02%、19.40%.

載體負(fù)載量L隨載體濃度的增大而減小(圖1)，在載體濃度小于4 g·L-1時(shí)，L值為：硅藻土A>活性炭>硅藻土B>輕石；在濃度大于4 g·L-1時(shí)，L值為：硅藻土A>硅藻土B>活性炭>輕石；在濃度為20 g·L-1時(shí)，4種載體的L值分別為373.3、217.7、162.3、82.8 mg·g-1.

2.2吸附時(shí)間對吸附效果的影響

由圖2可見，在0～5 min，4種載體對銅綠假單胞桿菌的吸附速率較高，Q值為：活性炭(26.4%)>硅藻土A(21.4%)>硅藻土B(17.4%)>輕石(16.6%)；負(fù)載量L值為：硅藻土A(211.7 mg·g-1)≈活性炭(194.6 mg·g-1)≈硅藻土B(142.3 mg·g-1)>輕石(129.4 mg·g-1)，前三者無顯著差異.隨著吸附時(shí)間的增加，載體的吸附速率明顯下降，負(fù)載量逐漸增大.在處理30 min時(shí)，吸附基本達(dá)到平衡，以硅藻土A的菌體去除率和載體負(fù)載量最大, 硅藻土A、硅藻土B、活性炭及輕石的Q值依次為：48.1%、40.8%、43.0%、33.1%，L值依次是470.6、332.6、294.6、255.4 mg·g-1.

2.3不同載體材料的吸水率和有效菌體釋放率

由表1可見，不同載體的吸水率存在顯著差異，不同載體的吸水能力為:硅藻土A>硅藻土B>輕石>活性炭.活性炭有效菌體的釋放率為19.7%，兩種規(guī)格的硅藻土的有效釋放率沒有顯著差異，分別為27.4%、28. 8%，輕石的有效釋放率為37.1%，輕石、硅藻土均具有良好的釋放作用.

表1　不同載體材料的吸水率和有效菌體釋放率1)

1)小寫字母表示,不同載體材料間,吸水率和有效菌體釋放率的差異水平(P<0.05).

2.4不同菌劑的活菌數(shù)

在室溫條件下,不同菌劑中的銅綠假單胞桿菌存活數(shù)量存在顯著差異，且隨保存時(shí)間的變化而變化(圖3).在試驗(yàn)的保存時(shí)間內(nèi)，菌劑A和菌劑C中的活菌數(shù)小于初始值，菌劑B和菌劑D中的活菌數(shù)大于初始值.由表1可見，不同菌劑接種后的活菌數(shù)量為：菌劑A(2.90×109)>菌劑B(2.08×109)>菌劑D(1.59×109)>菌劑C(1.13×109)，在保存30 d后，菌劑A活菌數(shù)為6.25×108CFU·g-1，減少了78.4%，菌劑B活菌數(shù)為1.12×1010CFU·g-1，是初始值的5.38倍，菌劑C的活菌數(shù)為2.95×108CFU·g-1，減少了73.9%，菌劑D的活菌數(shù)為3.61×109CFU·g-1，增殖了127.0%.

3　結(jié)論與討論

通過比較不同材料及其制備菌劑的性能，發(fā)現(xiàn)3～6 mm硅藻土的吸附與釋放能力均較好，制備的菌劑菌體的存活率高，可用于制備銅綠假單胞菌菌劑.3～6 mm硅藻土制備的菌劑保存30 d時(shí)的存活率高達(dá)540.6%，表明該載體的孔隙結(jié)構(gòu)等有利于菌株的生長，每g菌劑含菌量為1.12×1010CFU，略高于馬榮梅等[26]在最優(yōu)條件下制備的菌劑的含菌量.3～6 mm硅藻土制備的菌劑室溫下保存至30 d的含菌量高于1～3 mm硅藻土的，這可能與較大粒徑的硅藻土具有的微孔、空腔和通道結(jié)構(gòu)，更適合菌體存活與增殖.

本研究篩選的菌劑載體為單一載體，選擇的硅藻土、活性炭及輕石均為常見材料，硅藻土的成本相對也較低，制備的菌劑性能較好，具有一定的應(yīng)用前景.然馬榮梅等[26]研究發(fā)現(xiàn)，對于液體XM菌劑，混合載體比單一載體的吸菌效果更好，更適合微生物的生長繁殖，葉峰等[27]則將具高效降解三苯類物質(zhì)能力的活性污泥，進(jìn)一步在由麥麩、紅木屑、硅藻土組成的特定載體上發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)，制成了復(fù)合菌劑.

本試驗(yàn)對銅綠假單胞菌菌劑載體材料的可行性及其性能進(jìn)行了初步研究，關(guān)于混合載體或?qū)Ｓ幂d體的篩選以及復(fù)合菌劑的制備等還有待深入研究，在本研究的基礎(chǔ)上，有望為進(jìn)一步提高菌劑的性能奠定基礎(chǔ).

[1] KENSUKE F. Biochemical and genetic bases of microbial degradation of polychlorinated biphenyls (PCBs)[J]. The Journal of General and Applied Microbiology, 2002,46(6):283-296.

[2] RON E Z, ROSENBERG E. Biosurfactants and oil bioremediation[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2002,13(3):249-252.

[3] FOSTER L J R, KWAN B H, VANCOV T. Microbial degradation of the organophosphate pesticide, Ethion[J]. FEMS Microbiology Letters, 2006,240(1):49-53.

[4] ROOSA S, WAUVEN C V, BILLON G, et al. ThePseudomonascommunity in metal-contaminated sediments as revealed by quantitative PCR: a link with metal bioavailability. Research in Microbiology[J]. 2014,165:647-656.

[5] RAMOS J L, FILLOUX A.Pseudomonas: Volume 6: Molecular Microbiology, Infection and Biodiversity[M]. Dordrecht: Springer, 2010:255-282.

[6] VULLO D L, CERETTI H M, DANIEL M A, et al. Cadmium, zinc and copper biosorption mediated byPseudomonasveronii2E[J]. Bioresource Technology, 2008,99(13):5 574-5 581.

[7] CYCON M, WOJCIK M, PIOTROWSKA-SEGET Z. Biodegradation of the organophosphorus insecticide daizinon bySerratiasp. andPseudomonassp. and their use in bioremediation of contaminated soil[J]. Chemosphere, 2009,76(4):494-501.

[8] BANO N, MUSARRAT J. Characterization of a newPseudomonasaeruginosastrain NJ-15 as a potential biocontrol agent[J]. Current Microbiology, 2003,46(5):324-328.

[9] RANE M R, SARODE P D, CHAUDHARI B L, et al. Exploring antagonistic metabolites of established biocontrol agent of marine origin[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2008,151(2):665-675.

[10] SINHA S, MUKHERJEE S K. Cadmium-induced siderophore production by a high Cd-resistant bacterial strain relieved Cd toxicity in plants through root colonization[J]. Current Microbiology, 2008,56(1):55-60.

[11] 周麗英.水稻根際土壤耐鎘細(xì)菌的篩選及其耐鎘機(jī)理研究[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2012.

[12] 邱小香,朱海燕.水體重金屬的污染及其處理方法[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,14:34-35.

[13] 關(guān)小桃.突發(fā)性重金屬廢水污染事故處理菌劑的開發(fā)[J].中國化工貿(mào)易,2013,6:325-327.

[14] NENADOVIC S, NENADOVIC M, KOVACEVIC R, et al. Influence of diatomite microstructure on its adsorption capacity for Pb(Ⅱ)[J]. Science of Sintering, 2009,41(3):309.

[15] SELIM A Q, EL-MIDANY A A, IBRAHIM S S. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education[M]. Spain: J. Diaz, 2010:2 174-2 181.

[16] 魯光輝,鄭水林,王騰宇.硅藻土在廢水中的應(yīng)用及研究現(xiàn)狀[J].中國非金屬礦工業(yè)導(dǎo)刊,2012,34(3):39-43.

[17] 徐建軍,張傳順,管繼南.硅藻土的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].廣西輕化工,2011,35(5):23-24.

[18] 盧敬科.改性活性炭的制備及其吸附重金屬性能的研究[D].杭州：浙江工業(yè)大學(xué),2009.

[19] 施紅,努爾東拜,吳云海,等.活性炭吸附法去除廢水中重金屬的研究進(jìn)展[J].江蘇環(huán)境科學(xué),2006,19(2):110-113.

[20] 王慧敏.赤泥改性浮石吸附劑對水體中砷去除規(guī)律的研究[D].云南：昆明理工大學(xué),2014.

[21] 凌靜.硅藻土對廢水中Cd2+和Pb2+的吸附性能研究[D].衡陽：南華大學(xué),2013.

[22] 李慧,王平,肖明.硅藻土和滑石粉作為熒光假單胞菌P13菌劑的載體研究[J].中國生物防治,2009,25(3):239-244.

[23] GABALDON C, MARZAL P, FERRER J, et al. Single and competitive adsorption of Cd and Zn onto a granular activated carbon[J]. Water Research, 1996,30(12):3 050-3 060.

[24] 袁磊.浮石及其載輕基化鋅催化臭氧氧化對氯硝基苯的研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué),2013.

[25] 周鐵海,趙玲,尹平河.La3+和Fe3+共摻雜TiO2/浮石的制備及光催化礦化二級出水效果[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào),2009,18(5):1 721-1 726.

[26] 馬梅榮,陳雷,宣世偉,等.XM固態(tài)菌劑載體選擇的初步研究[J].哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,37(2):259-262.

[27] 葉峰,張麗麗,吳石金,等.降解三苯類復(fù)合微生物菌劑的制備及性能[J].中國環(huán)境科學(xué),2009,29(3):300-305.

(責(zé)任編輯:吳顯達(dá))

Screening of carrier forPseudomonasaeruginosabacterial agent

WANG Wei, LI Yuanping, XIE Huiling, XIAO Qingtie, ZHENG Meiqin, CHEN Shen,HE Xiaosan, ZHENG Xinyu, LIN Ruiyu, LIN Wenxiong

(Institute of Agro-ecology, Collage of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forest University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To optimize the application ofPseudomonasaeruginosain bioremediation of heavy metal-polluted environment, carriers for bacterial agent, including diatomite at two particle sizes (1-3 mm and 3-6 mm), activated carbon and pumice were screened byP.aeruginosato evaluate their performances in bacteria adsorption and release, water absorption, and bacteria survival rate. Results showed that bacteria removal rates increased from 4.90% to 49.60% along with increasing concentrations of carrier from 0 g·L-1to 20 g·L-1. Conversely, loading capacity of carriers decreased from 923.33 to 82.83 mg·g-1when carrier concentrations increased. Diatomite and activated carbon reached the maximum bacteria removal rates 30 minutes after being exposed to bacterial agent. Bibulous rates for diatomite (1-3 mm), diatomite (3-6 mm), activated carbon and pumice were 60.3%, 43.3%, 23.4% and 33.1%, respectively, with living bacteria release rates reaching 27.4%, 28.8%, 19.7% and 37.1% accordingly. After being preserved at room temperature for 30 days, bacteria populations of diatomite (1-3 mm) and activated carbon decreased by 78.4% and 73.9%, reaching at 6.25×108CFU·g-1and 2.95×108CFU·g-1, while those of diatomite (3-6 mm) and pumice were 5.38 and 1.27 times higher than the initial populations, resulting in 1.12×1010CFU·g-1and 3.61×109, respectively. To summarize, carrier concentration and adsorption time significantly affected adsorption efficacy of bacteria carrier. Overally speaking, diatomite at particle size of 3-6 mm has moderate loading capacity, high bacteria survival rate and living bacteria release rate, and was considered an excellent material for carrier ofP.aeruginosaagent.

Pseudomonasaeruginosa; bacterial agent; carrier; diatomite; activated carbon; pumice; adsorption

2015-09-21

2015-10-20

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2009J01056,2013J01083,2015J01081);福建省教育廳基金項(xiàng)目(JA09084);福建省高校服務(wù)海西建設(shè)重點(diǎn)項(xiàng)目(0B08B005);福建農(nóng)林大學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目建設(shè)專項(xiàng)(6112c0604)和科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)(2015FY111300)資助.

王微(1989-)，女，碩士研究生.研究方向：植物生理與分子生物學(xué).Email:wal0713@163.com.通訊作者林瑞余(1968-)，男，教授.研究方向：作物生理生態(tài)與化學(xué)生態(tài).Email:lrylin2004@163.com.

Q89; X5

A

1671-5470(2016)03-0325-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.03.015