劉星云，王慧玲，彭麗華，成金樂*

(1.廣州中醫(yī)藥大學 中藥資源科學與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點實驗室，廣東 廣州 510006；2.國家中醫(yī)藥管理局 中藥破壁飲片技術與應用重點研究室，廣東 中山 528437；3.中山市中智藥業(yè)集團有限公司，廣東 中山 528437)

菊花破壁飲片的HPLC指紋圖譜研究△

劉星云1，2，3，王慧玲2，3，彭麗華2，3，成金樂1，2，3*

(1.廣州中醫(yī)藥大學 中藥資源科學與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點實驗室，廣東 廣州 510006；2.國家中醫(yī)藥管理局 中藥破壁飲片技術與應用重點研究室，廣東 中山 528437；3.中山市中智藥業(yè)集團有限公司，廣東 中山 528437)

目的：建立菊花破壁飲片HPLC指紋圖譜，并分析破壁飲片成品與其中間品、原料的化學成分相關性，為菊花破壁飲片整體質量評價提供依據。方法：采用高效液相色譜法，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.5%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，檢測波長：348 nm，柱溫：35 ℃。結果：建立了菊花破壁飲片的HPLC指紋圖譜，得到了15個共有特征峰，11批樣品的相似度達0.98以上，方法學考察結果符合指紋圖譜技術要求。結論：所建立的方法穩(wěn)定、可靠、重復性好，可用于菊花破壁飲片質量控制和綜合評價。

菊花；破壁飲片；指紋圖譜；HPLC

菊花來源于菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序，具有散風清熱、平肝明目、清熱解毒的功能。該藥材按產地和加工方法不同，分為“滁菊”、“亳菊”、“貢菊”、“杭菊”等品種[1]。菊花破壁飲片是將符合《中華人民共和國藥典》要求的杭白菊粉碎至D90<45 μm的粉體，不添加成型劑制成的30～100目的干燥顆粒狀飲片，可直接沖泡服用。與傳統(tǒng)飲片相比，菊花破壁飲片具有全成分保留，成分利用率高，質量均一，應用方式簡單、快捷和靈活等特點[2]。由于外觀性狀及顯微特征均被破壞，傳統(tǒng)飲片的質量評價標準已不能滿足菊花破壁飲片質量控制要求，而基于整體化學表征基礎上的中藥HPLC指紋圖譜能反映中藥組分全貌，能對破壁飲片的內在質量進行綜合評價[3]，所以課題組對菊花破壁飲片首次開展HPLC指紋圖譜研究。為進一步考察破壁飲片制備過程對菊花傳統(tǒng)飲片中化學成分的影響，本課題組還比較、分析了菊花破壁飲片(成品)-菊花破壁粉體(中間品)-菊花傳統(tǒng)飲片(原料)三者的相關性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1200RRLC快速液相色譜儀(配有G1315C型號DAD檢測器、G4218A的ELSD檢測器、G1312B二元泵、G1329B自動進樣器、G1322A脫氣機、G1316B柱溫箱，Agilent ChemStation色譜工作站)；明澈TM-D24UV純水系統(tǒng)，KQ-400KOE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋DK-S24(上海森信實驗儀器有限公司)；萬分之一電子天平AB204-S(METTLER TOLEOD)、十萬分之一電子天平AUW220D(島津公司)。

1.2 試藥和試劑

菊花破壁飲片共10批(批號分別為S1：021311501；S2：0212092701；S3：20131002；S4：20130903；S5：20130902；S6：20130901；S7：20130802；S8：20130801；S9：20120902；S10：20120901；S11：20120701)；杭白菊3批(批號分別為Ⅰ：0212092701；Ⅱ：0213011501；Ⅲ：20131201)，均由中山市中智藥業(yè)集團有限公司提供，經中山市中智藥業(yè)集團有限公司賈世清中藥師鑒定為ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序，憑證標本保存于廣州中醫(yī)藥大學。將3批杭白菊(批號：0212092701，0213011501，20131201)分別按照法定炮制工藝制成相對應批次的菊花傳統(tǒng)飲片、菊花破壁粉體和菊花破壁飲片(均由中山市中智藥業(yè)集團有限公司制備)。

綠原酸對照品(批號：110753-201314)、異綠原酸A對照品(批號：111782-201204)，木犀草苷對照品(批號：111720-200905)，均購于中國食品藥品檢定研究院；色譜甲醇(瑞典Oceanpak公司)，色譜乙腈(安徽時聯特種溶劑有限公司)，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(250 mm×4.6mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)，梯度洗脫程序見表1；柱溫：35 ℃；檢測波長：348 nm；流速：0.6 mL·min-1。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 供試品溶液的制備

取菊花破壁飲片約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲提取40 min(功率320 W，頻率4200 Hz)，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A對照品適量，加70%甲醇溶解配成質量濃度分別為0.173、0.152、0.249 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 精密吸取空白溶劑(甲醇)10 μL注入液相色譜儀，按照2.1項下色譜條件進行測定，在相應保留時間處無色譜峰，表明甲醇對測定結果無干擾。

2.4.2 精密度試驗 取菊花破壁飲片(批號：20131002)樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，按2.1項下色譜條件進行測定，記錄圖譜。經計算，6次進樣譜圖的相似度達0.999以上，共有峰相對峰面積的RSD<3.4%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 取同一批次菊花破壁飲片(批號：20131002)樣品6份，精密稱定，按2.2項下方法分別制備供試品溶液6份，按2.1項下色譜條件進行測定，記錄圖譜。6份樣品所得指紋圖譜的相似度均高于0.999；各主要色譜峰的峰面積RSD<2.0%，表明本方法的重復性符合指紋圖譜控制技術的要求。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取菊花破壁飲片(批號：20131002)樣品，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液。分別于0、3、6、9、12、16、24 h測定，計算24 h內各主要色譜峰峰面積RSD及所得圖譜的相似度。結果7張譜圖的相似度達0.999以上，主要色譜峰峰面積RSD<3.0%，說明該樣品在24 h內性質穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 指紋圖譜采集 取11批次菊花破壁飲片，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，取供試品溶液20 μL及對照品溶液5 μL，按2.1項下色譜條件進行分析，以6號峰(異綠原酸A)為參照峰，計算各批菊花破壁飲片指紋圖譜中的相對保留時間和相對峰面積。結果見表2和表3。

表2 11批菊花破壁飲片共有指紋圖譜共有峰的相對保留時間(n=11)

表3 11批菊花破壁飲片共有指紋圖譜共有峰的相對峰面積(n=11)

2.5.2 共有模式的建立及相似度的測定 將11批菊花破壁飲片樣品的指紋圖譜導入 《中智藥業(yè)集團中藥指紋圖譜數據庫軟件》(中智藥業(yè)集團與中南大學合作開發(fā))，結果見圖1，以中位數法生成菊花破壁飲片指紋圖譜共有模式，共標定15個共有峰，并將共有模式的保留時間與對照品進行比對，指認出1號峰為綠原酸，3號峰為木犀草苷，6號峰為異綠原酸A，結果見圖2和圖3。6號峰高度適中，分離度好，保留時間適中，可作為參照峰。以共有模式為對照圖譜，測得樣品與對照指紋圖譜之間的相似度，結果見表4。由表可知相似度均在0.984以上，說明各批次間菊花破壁飲片質量均一、穩(wěn)定。

圖1 11批菊花破壁飲片指紋圖譜圖

圖2 菊花破壁飲片指紋圖譜共有模式

圖3 菊花破壁飲片混合對照品溶液(a)和共有模式(b)的HPLC對比圖

表4 11批菊花破壁飲片指紋圖譜的相似度

3 菊花破壁飲片(成品)-破壁粉體(中間體)-傳統(tǒng)飲片(原料)的相關性分析

本研究收集3批菊花傳統(tǒng)飲片及其對應批次的破壁粉體和破壁飲片，按2.2項下方法制備供試品溶液，2.1項下色譜條件進行分析，記錄圖譜中樣品的相對保留時間和相對峰面積，菊花傳統(tǒng)飲片、破壁粉體和破壁飲片的指紋圖譜見圖4。分別分析各批次的原料-中間品-成品之間的相似度，結果見表5。分析可知，同批次樣品的原料、破壁粉體及破壁飲片之間相似度在0.990以上，表明菊花傳統(tǒng)飲片經超微粉碎再制成破壁飲片的工藝流程中有效成分基本沒有改變，各主要成分相關性良好。

注：Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅰ3依次表示批號為20131201的傳統(tǒng)飲片、破壁粉體、破壁飲片；Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅱ3依次表示批號為0213011501的傳統(tǒng)飲片、破壁粉體、破壁飲片；Ⅲ1、Ⅲ2、Ⅲ3依次表示批號為0212092701的傳統(tǒng)飲片、破壁粉體、破壁飲片。圖4 菊花破壁飲片原料-中間品-成品的指紋圖譜

表5 各批次菊花破壁飲片的原料-中間品-成品間相關性分析(n=3)

4 討論

在選擇檢測波長過程中，采用二極管陣列檢測器對菊花樣品進行全波長掃描，由三維譜圖得出，在348 nm處樣品出峰數量多，峰分布均勻且基線平穩(wěn)，反應信息量較大，故選取348 nm作為指紋圖譜最佳檢測波長。同時在有關文獻的基礎上[4-8]，考察不同流動相(乙腈-水，乙腈-0.5%磷酸溶液，乙腈-0.3%磷酸溶液，乙腈-0.1%磷酸溶液)，選擇乙腈-0.5%磷酸溶液作為流動相并對洗脫梯度進行優(yōu)化，以達到較好的峰形及分離效果。同時比較了不同流速(0.6、0.8、1.0、1.2 mL·min-1)、不同柱溫(25、30、35 ℃)、不同色譜柱[Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Waters Symmetry C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)，Phenomenex Synergi 4u Fusion-RP 80A(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Thermo ODS HPERSIL C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)]的效果，最終確定了該方法的色譜條件。

本研究同時對同來源的菊花破壁飲片-中間體-傳統(tǒng)飲片進行指紋圖譜研究并分析三者之間的相關性，結果顯示三者之間全譜相似度均大于0.99，各色譜峰的保留時間幾乎一致，但存在一定的含量差異。結果表明菊花傳統(tǒng)飲片經破壁粉碎并制成破壁飲片的過程中，化學成分組成無明顯的變化，破壁技術未造成主成分流失以及新化學成分的轉化或生成。圖4中，保留時間20 min和80 min處，由批號為20131201杭白菊制備的樣品Ⅰ1～Ⅰ3相對應的色譜峰遠遠小于其他兩批制成的樣品(Ⅱ1～Ⅱ3、Ⅲ1～Ⅲ3)。參考相關文獻[9-10]，推測：由于菊花采收時間及開放狀態(tài)的不同，故3批菊花本身所含的化學成分和含量存在差異，故其制成的相應破壁粉體和破壁飲片的組成成分和含量也存在相應差異，因此可以體現該指紋圖譜對菊花破壁飲片能起到源頭的控制，確保菊花破壁飲片的質量穩(wěn)定、均一，也提示了選材時應采用同產地、同采收時間、同開放狀態(tài)的杭白菊。

本研究建立的指紋圖譜方法精密度、重復性、穩(wěn)定性良好，可為菊花破壁飲片質量控制標準的制定、品質評價、活性成分的藥理藥效學提供科學依據和指導作用。為更全面、科學地評價菊花破壁飲片的內在質量，后續(xù)仍需在本指紋圖譜研究的基礎上結合氣相色譜和液相色譜等多手段對菊花中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A等重要指標成分進行含量差異分析，為菊花破壁飲片和傳統(tǒng)飲片之間的劑量換算和服用方式提供參考。

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StudyonHPLCFingerprintofCellWall-BrokenDecoctionPiecesofChrysanthemiFlos

LIU Xingyun1，2，3，WANGHuiling2，3，PENGLihua2，3，CHENGJinle1，2，3*

(1.ResearchCenterofChineseHerbalResourceScienceandEngineering，GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine，KeyLaboratoryofChineseMedicinalResourcefromLingnan，MinistryofEducation，Guangzhou510006，China；2.KeyLaboratoryofCell-brokenDecoctionPiecestechnologyandApplicationofstateAdministrationofTraditionalChineseMedicine，Zhongshan528437，China；3.ZEUSPharmaceuticalgroup，Zhongshan528437，China)

Objective：To establish the HPLC fingerprint of Cell Wall-Broken Decoction Pieces of Chrysanthemi Flos，and analyze the relativity between its decoction pieces，broken powder and broken particle，helping to evaluate its quality comprehensively.Methods：RP-HPLC method was performed on an Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)column with a gradient elution composed of acetonitrile-aqueous solution containing 0.5% phosphoric acid.The column temperature was set at 35 ℃，while the detective wavelength was set at 348 nm.Results：The chromatographic fingerprint common pattern was established.Fifteen mutual peaks were obtained from the chromatograms of eleven batches of samples.Conclusion：The method with good reproducibility is reliable and stable，which is feasible for quality control of cell wall-broken decoction pieces of Chrysanthemi Flos.

Chrysanthemi Flos；fingerprint；cell wall-broken decoction pieces；HPLC

2015-09-25)

中山市科技計劃項目(2013A3FC0253)

*

成金樂，教授，研究方向：破壁飲片及產業(yè)化，創(chuàng)新中藥研究與開發(fā)；Tel：(0760)85312928，E-mail： gdcjl9@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.025