周　杰　王　敬　馮　薇

重慶三峽中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科　重慶　404000

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·論著·

地塞米松對(duì)結(jié)核性腦膜炎患者單核細(xì)胞TLR4 MyD88表達(dá)的影響

周杰王敬馮薇

重慶三峽中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科重慶404000

目的分析地塞米松治療結(jié)核性腦膜炎患者的臨床療效及對(duì)單核細(xì)胞TLR4、MyD88表達(dá)的影響。方法60例結(jié)核性腦膜炎患者分為觀察組和對(duì)照組，觀察組36例給予常規(guī)抗結(jié)核聯(lián)合地塞米松治療，對(duì)照組僅給予抗結(jié)核治療，分析臨床療效及2組患者外周血單核細(xì)胞TLR4、MyD88的表達(dá)。結(jié)果聯(lián)合治療組總有效率為91.67%，顯著優(yōu)于對(duì)照組(χ2=5.17，P<0.05)；地塞米松治療能夠顯著降低TLR4、MyD88的表達(dá)水平。結(jié)論抗結(jié)核治療聯(lián)合地塞米松能顯著提高治療有效率，TLR4-MyD88通路在地塞米松治療結(jié)核性腦膜炎過程中有重要作用。

地塞米松；結(jié)核性腦膜炎；單核細(xì)胞；TLR4；MyD88

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是結(jié)核分枝桿菌經(jīng)血行或其他途徑傳播到蛛網(wǎng)膜下腔，累及脊髓膜和腦膜的一種非化膿性炎性疾病，具有極高的致死率和致殘率[1]。近年耐藥株的增加及AIDS流行等導(dǎo)致TBM發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅患者的生命健康，早期診斷并給予積極治療是良好預(yù)后、預(yù)防并發(fā)癥的前提條件。Toll樣受體是固有免疫中一種重要的識(shí)別受體，其中TLR4分布于抗原提呈細(xì)胞，TLR4可以通過下游MyD88依賴途徑進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的分泌[2]。地塞米松對(duì)免疫應(yīng)答起雙向調(diào)節(jié)作用，可以誘導(dǎo)靜息狀態(tài)下T細(xì)胞表達(dá)TLR4，卻抑制活化T細(xì)胞TLR4的表達(dá)[3]。本研究基于TLR4/MyD88信號(hào)通路探討地塞米松減輕結(jié)核性腦膜炎患者過度免疫反應(yīng)的可能機(jī)制，為臨床提供參考。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2013-07—2015-04我院神經(jīng)內(nèi)科住院治療并經(jīng)改良抗酸法確診的60例結(jié)核性腦膜炎患者為研究對(duì)象，觀察組采用常規(guī)抗結(jié)核聯(lián)合地塞米松(西南藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字H50021462，1 mL：5 mg)治療，對(duì)照組采用常規(guī)抗結(jié)核治療，2組患者均簽署知情同意書，在年齡、病程等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。

1.2治療方法對(duì)照組給予抗結(jié)核治療，包括抗結(jié)核化治療，降低顱內(nèi)壓，腦水腫等，利福平1.45～0.6 g/d，異煙肼0.6 g/d，乙胺丁醇 0.75 g/d，吡嗪酰胺 1.0～1.5 g/d，3個(gè)月強(qiáng)化治療后給予12個(gè)月鞏固治療，口服1次/d；根據(jù)患者的體質(zhì)量予以20%甘露醇進(jìn)行治療，于1 h內(nèi)靜滴完畢。觀察組在對(duì)照組治療的基礎(chǔ)上給予地塞米松10 mg/d靜滴。

1.3檢測指標(biāo)與方法外周血單核細(xì)胞分離：在抗結(jié)核治療前、抗結(jié)核治療1周、抗結(jié)核治療2周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集肘靜脈血5 mL，加入肝素抗凝管并混勻，采用HISTOPAQUE-1077淋巴細(xì)胞分離液(Gibco-BRL公司)分離外周血單核細(xì)胞，操作參照試劑說明書。RT-PCR檢測外周血單核細(xì)胞中TLR4 mRNA及MyD88 mRNA表達(dá)水平：按照Trizol Reagent(上海生工生物公司)試劑盒說明書提取外周血單核細(xì)胞總RNA，并應(yīng)用隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Superscript Ⅱ)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，然后以RT-PCR檢測TLR4 mRNA及MyD 88 mRNA表達(dá)水平，采用GAPDH基因作為內(nèi)參。目的基因相對(duì)表達(dá)量=2-△△CT。Western Blot檢測外周血單核細(xì)胞中TLR4及MyD88表達(dá)水平：將收集的單核細(xì)胞加入200 μL細(xì)胞裂解液(50 mM Tris-Hcl pH 8.0，150 mM PMSF，0.1%NP-40，蛋白酶抑制劑)。4 ℃12 000 r/min離心15 min，取上清，采用Bradford法檢測蛋白濃度；取上述制備的蛋白樣品50 μg上樣到15% SDS-PAGE凝膠，電泳完畢后將蛋白電轉(zhuǎn)至NC膜，用5%脫酯奶粉封閉，分別加一抗(美國sigma公司)，37 ℃孵育2 h，經(jīng)0.1%TBST漂洗后加二抗(1：2 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X光膠片定影，掃描后用IPP 6.0進(jìn)行圖像分析。

1.4療效標(biāo)準(zhǔn)臨床療效判斷：顯效：體溫恢復(fù)正常、癥狀緩解，意識(shí)清晰，腦脊液常規(guī)及生化指標(biāo)顯著改善；有效：體溫正常，癥狀部分緩解，腦脊液常規(guī)及生化指標(biāo)好轉(zhuǎn)；無效：上述各指標(biāo)、癥狀無改善或惡化；死亡。

2　結(jié)果

2.12組臨床療效比較觀察組顯效23例，有效10例，總有效率91.67%，顯著優(yōu)于對(duì)照組(χ2=5.17，P<0.05)。見表1。

2.22組外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA及MyD88 mRNA表達(dá)比較采用RT-PCR對(duì)2組患者外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA及MyD88 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示觀察組外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA及MyD88 mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表1　2組臨床療效比較　(n)

表2　2組外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA及MyD88 mRNA表達(dá)分析

注：與對(duì)照組比，*P<0.05

2.32組外周血單核細(xì)胞TLR4及MyD88表達(dá)比較采用Western Blot對(duì)2組患者外周血單核細(xì)胞TLR4及MyD88表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示觀察組患者外周血單核細(xì)胞TLR4及MyD88表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見表3、圖1。

表3　2組外周血單核細(xì)胞TLR4及MyD88表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比，*P<0.05

圖1　2組TLR4及MyD88表達(dá)

3　討論

結(jié)核性腦膜炎是全球范圍內(nèi)公共衛(wèi)生領(lǐng)域的一個(gè)難題，尤其在落后的國家和地區(qū)，流行病學(xué)研究顯示1/3的TBM患者死亡，在合并HIV感染患者中病死率更高[4]。部分患者會(huì)留下如腦梗死、腦積水、顱內(nèi)神經(jīng)損害等嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。早期診斷和及時(shí)對(duì)癥治療對(duì)結(jié)核性腦膜炎患者預(yù)后至關(guān)重要。目前對(duì)于結(jié)核性腦膜炎的治療包括對(duì)癥支持、抗結(jié)核藥物治療及預(yù)防并發(fā)癥等[5]。早期、足量、聯(lián)合及全程用藥是抗結(jié)核藥物的應(yīng)用原則，及早應(yīng)用皮質(zhì)激素治療能夠降低顱內(nèi)壓，減輕腦水腫，抑制纖維化防止粘連，減輕中毒癥狀。劉海梅等[6]研究顯示，在常規(guī)抗結(jié)核治療的基礎(chǔ)上給予鞘內(nèi)給藥加腦脊液置換治療臨床治愈率和有效率明顯提高，患者腦脊液壓力及各項(xiàng)生化指標(biāo)恢復(fù)時(shí)間顯著提前。尹忠平等[7]在常規(guī)抗結(jié)核治療基礎(chǔ)上給予地塞米松沖擊治療能夠在不增加不良反應(yīng)的同時(shí)顯著提高臨床療效，縮短治療時(shí)間。地塞米松是強(qiáng)效的抗炎物質(zhì)，作為主要的免疫調(diào)節(jié)劑一直應(yīng)用至今，能影響炎性級(jí)聯(lián)的多重通路，對(duì)免疫應(yīng)答反應(yīng)起雙向調(diào)節(jié)作用。由于使用地塞米松有導(dǎo)致結(jié)核擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)，因此在嚴(yán)重的結(jié)核感染患者中忌用。

當(dāng)結(jié)核分枝桿菌通過呼吸道傳播途徑進(jìn)入宿主肺泡巨噬細(xì)胞后，細(xì)菌開始復(fù)制并擴(kuò)散進(jìn)入?yún)^(qū)域淋巴循環(huán)系統(tǒng)，在獲得性免疫反應(yīng)啟動(dòng)之前，細(xì)菌可通過血液傳播散播到身體其他器官，引起TBM等肺外結(jié)核的發(fā)生。該過程受到機(jī)體固有免疫反應(yīng)性質(zhì)和程度的影響，Toll樣受體為跨膜信號(hào)傳導(dǎo)受體，通過對(duì)病原微生物表面高度保守的結(jié)構(gòu)PAMPs的識(shí)別發(fā)揮作用[8]，通過激活一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞因子和炎癥因子的產(chǎn)生，在結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮重要的作用。體外研究證實(shí)，地塞米松能夠抑制LPS刺激TLR4的表達(dá)[9]，而TLR4的活化減少會(huì)調(diào)節(jié)下游MyD88的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)[10]。因此本研究基于TLR4-MyD88信號(hào)途徑探討地塞米松治療結(jié)核性腦膜炎的作用機(jī)制，研究顯示，與對(duì)照組比，常規(guī)抗結(jié)核治療聯(lián)合地塞米松能夠顯著提高結(jié)核性腦膜炎的有效率，且能夠抑制患者外周血單核細(xì)胞中TLR4及MyD88的表達(dá)，提示TLR4/MyD88信號(hào)通路可能在結(jié)核性腦膜炎的發(fā)生發(fā)展及地塞米松的作用過程中有重要的作用。

[1]湯海燕，談鷹，張栗，等.腦脊液與血漿生化指標(biāo)比值對(duì)結(jié)核性腦膜炎與化膿性腦膜炎的鑒別意義[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(14)：1 705-1 707；1 710.

[2]趙乃倩，王冬青，榮青峰，等.軟脂酸增加血管內(nèi)皮細(xì)胞Toll樣受體4表達(dá)及活化TLR4炎癥信號(hào)通路[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33(12)：1 775-1 777；1 800.

[3]王志，計(jì)國義，李揚(yáng)，等.地塞米松對(duì)內(nèi)毒素休克大鼠腦皮質(zhì)TLR4、IκBα和IL-18 mRNA表達(dá)的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2007，33(5)：841-844.

[4]毛霖，雷素云，楊欣平，等.126例HIV/AIDS合并結(jié)核病臨床分析[J].中國老年保健醫(yī)學(xué)，2015，13(2)：47-48；49.

[5]閔麗，熊小平，王榮耀，等.腦脊液置換加鞘內(nèi)給藥治療結(jié)核性腦膜炎的臨床療效評(píng)價(jià)[J].中國藥業(yè)，2013，22(15)：35-36.

[6]劉海梅，韓麗，張成輝，等.鞘內(nèi)給藥加腦脊液置換治療結(jié)核性腦膜炎的臨床分析[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2015，17(2)：125-126；129.

[7]尹忠平，鄧?yán)酌?，羅昌菊，等.結(jié)核性腦膜炎患者地塞米松沖擊治療的臨床研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2014，24(15)：3 736-3 738.

[8]Thapa S，Nagy E，Abdul-Careem MF.In ovo delivery of Toll-like receptor 2 ligand，lipoteichoic acid induces pro-inflammatory mediators reducing post-hatch infectious laryngotracheitis virus infection[J].Vet Immunol Immunopathol，2015，164(3/4)：170-8.

[9]Bonin CP，Baccarin RY，Nostell K，et al.Lipopolysaccharide-induced inhibition of transcription of tlr4 in vitro is reversed by dexamethasone and correlates with presence of conserved NFκB binding sites[J].Biochem Biophys Res Commun，2013，432(2)：256-261.

[10]Ding Y，Yang H，Xiang W，et al.CD200R1 agonist attenuates LPS-induced inflammatory response in human renal proximal tubular epithelial cells by regulating TLR4-MyD88-TAK1-mediated NF-κB and MAPK pathway[J].Biochem Biophys Res Commun，2015，460(2)：287-294.

(收稿2015-09-17)

Effects of dexamethasone on the expressions of TLR4 and MyD88 in peripheral blood monocytes in tuberculous meningitis patients

ZhouJie，WangJing，F(xiàn)engWei

DepartmentofNeurology，theCentralHospitalofThreeGorges，Chongqing404000，China

ObjectiveTo analyze the effects of dexamethasone on the expressions of TLR4 and MyD88 in peripheral blood monocytes in tuberculous meningitis patients.MethodsSixty cases with tuberculous meningitis were divided into observation group and control group，and 36 cases in the observation group were treated with conventional anti-TB therapy in combination with dexamethasone，the control group only received anti-TB treatment.Then clinical efficacy and the expressions of TLR4 as well as MyD88 in peripheral blood monocytes were analyzed.ResultsTotal effective rate in the observation group was 91.67%，and was significantly better than that in the control group (χ2=5.17，P<0.05)；Dexamethasone treatment could significantly reduce the levels of TLR4 and MyD88 expressions.ConclusionsAnti-TB therapy plus dexamethasone can significantly improve clinical efficacy.And dexamethasone via TLR4-MyD88 pathway may play an important role in tuberculous meningitis.

Dexamethasone；Tuberculous meningitis；Monocytes；TLR4；MyD88

重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目，編號(hào)：2013-2-172

R529.3

A

1673-5110(2016)17-0001-02