潘曉峰　張細(xì)六　張　媚

1)武漢市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科　武漢　430050　2)武漢市第五醫(yī)院　武漢　430050

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臍血干細(xì)胞移植對小鼠腦梗死后神經(jīng)功能的影響

潘曉峰1)張細(xì)六1)張媚2)△

1)武漢市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢4300502)武漢市第五醫(yī)院武漢430050

目的探討臍血干細(xì)胞移植對小鼠腦梗死后神經(jīng)功能的影響，以期為臨床治療提供依據(jù)。方法先對小鼠進(jìn)行模型，隨機(jī)分成阿司匹林組、生理鹽水組和臍血干細(xì)胞移植組，分別造模后1 d灌胃生理鹽水、阿司匹林、臍血干細(xì)胞移植，觀察在血清NGF和神經(jīng)功能變化情況。結(jié)果治療前3組間NGF水平、生理鹽水組和阿司匹林組治療28 d后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；余3組治療前后和治療后7、14、21、28 d比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療前神經(jīng)功能均為0，治療后和治療前在神經(jīng)功能評分上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；生理鹽水組組、阿司匹林組、臍血干細(xì)胞移植組治療后7、14、21、28 d神經(jīng)功能評分兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論臍血干細(xì)胞移植能改善小鼠腦梗死后神經(jīng)功能。

臍血干細(xì)胞移植；小鼠；腦梗死；神經(jīng)功能

腦梗死是神經(jīng)內(nèi)科常見病和多發(fā)病，致殘率和致死率較高，其原因是神經(jīng)元再生困難。研究[1]稱，神經(jīng)突觸是神經(jīng)元信息傳遞和加工重要結(jié)構(gòu)，如何促進(jìn)神經(jīng)突觸再生是促進(jìn)損傷神經(jīng)修復(fù)的重要環(huán)節(jié)。而臍血干細(xì)胞能將干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至缺血邊緣地帶，分化成膠質(zhì)神經(jīng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞，能促進(jìn)新血管形成。本次研究通過觀察臍血干細(xì)胞移植對小鼠腦梗死后神經(jīng)功能的影響，以期提高臨床診治水平。

1　資料與方法

1.1動物隨機(jī)選取75只小鼠為研究對象，分成3組，每組25只，均為雄性，平均體質(zhì)量(45±5)g，入選動物均符合動物實(shí)驗(yàn)要求，均飼養(yǎng)1周。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑試劑有胎牛血清、人淋巴細(xì)胞分離液、終止液、青鏈霉素、24孔培養(yǎng)板、CO培養(yǎng)箱、定量ELISA試劑盒，均由上海陽光生物科技有限公司。

1.3動物分組和模型制備隨機(jī)將所有小鼠分成阿司匹林組、生理鹽水組和臍血干細(xì)胞移植組，每組25只。

1.4觀察指標(biāo)和方法先進(jìn)行臍血干細(xì)胞分離，均取自自愿提供的孕婦中，排除攜帶病毒性肝炎、艾滋病和梅毒等感染，在采集12 h后進(jìn)行單個核細(xì)胞分離，肝素抗凝后將臍血和PBS按1：1混勻后和5 g/L甲基纖維素按4：1混勻，吸取上層清液，棄除上層清液，用PBS制成單個細(xì)胞懸液，疊加淋巴細(xì)胞分離液上進(jìn)行梯度離心，然后洗滌、反復(fù)吹打，制備成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞調(diào)整成1×108/L保存，2 h內(nèi)對小鼠進(jìn)行細(xì)胞移植。對所有小鼠進(jìn)行腦梗死模型制備，用水合氯醛腹腔注射麻醉，按照文獻(xiàn)[2]相關(guān)方法在大腦中動脈進(jìn)行局限向栓塞。在頸中切開，結(jié)扎頸外動脈，用多聚賴氨酸處理尼龍線至大腦前動脈起始處，阻塞大腦中動脈主干起始部，1 d內(nèi)觀察小鼠神經(jīng)功能。所有模型均制備成功。然后對各組進(jìn)行相應(yīng)藥物治療，阿司匹林組組阿司匹林1 mg灌胃，生理鹽水組予3 mg/kg靜脈注射，1次/d，臍血干細(xì)胞移植組則在小鼠尾靜脈處注射3 mL人臍血干細(xì)胞1 mL磷酸緩沖液。

1.5觀察指標(biāo)分別在實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)后7 d、14 d、21 d、28 d，采集靜脈血2 mL，以4 000 r/min離心后分離血清，采用雙抗體夾心測定標(biāo)本中神經(jīng)生長因子(NGF)水平，觀察神經(jīng)功能評分，包括運(yùn)動、感覺、反射、平衡試驗(yàn)，從0～18進(jìn)行分級，正常為0分，最嚴(yán)重為功能缺損為18分[3]。

2　結(jié)果

2.13組血清NGF水平比較對3組血清NGF水平進(jìn)行比較，治療前3組間NGF水平、生理鹽水組和阿司匹林組治療28 d后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；余3組治療前后和治療后7、14、21、28 d比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　3組血清NGF水平比較

注：A組、B組、C組分別代表生理鹽水組組、阿司匹林組、臍血干細(xì)胞移植組

2.23組神經(jīng)功能比較對3組神經(jīng)功能進(jìn)行比較，治療前3組神經(jīng)功能評分均為0，治療后和治療前神經(jīng)功能評分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，生理鹽水組組、阿司匹林組、臍血干細(xì)胞移植組治療后7、14、21、28 d神經(jīng)功能評分兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　3組神經(jīng)功能比較

注：A組、B組、C組分別代表生理鹽水組組、阿司匹林組、臍血干細(xì)胞移植組

3　討論

目前用于中樞神經(jīng)移植的供體細(xì)胞主要有胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及臍血干細(xì)胞等。臍血干細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有骨髓干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞有相同多向分化潛能的原始祖細(xì)胞，能在特定因子的影響和誘導(dǎo)下向多種細(xì)胞或組織分化，能對腦梗死缺血及受損組織進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)。且其自我更新能力強(qiáng)，具有高度未分化性和多向分化潛能，能替代死亡細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)再生，能釋放神經(jīng)保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)作用，其中臍血干細(xì)胞具有來源豐富、采集方便、抗原性弱、不受病毒和腫瘤污染特點(diǎn)。研究[4]稱，臍血干細(xì)胞中CD3、CD4細(xì)胞群占95%以上，能通過免疫調(diào)節(jié)多種血管活性物質(zhì)，達(dá)到控制干細(xì)胞命運(yùn)，且調(diào)節(jié)新生細(xì)胞數(shù)量和種類。

研究[5]稱，臍血干細(xì)胞移植治療腦卒中的機(jī)制是減輕炎癥反應(yīng)，增加營養(yǎng)物質(zhì)吸收，促進(jìn)血管再生和神經(jīng)纖維重塑，其中減輕炎癥反應(yīng)主要是抑制淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等浸潤、減少星形細(xì)胞等激活，腦梗死后會發(fā)生一系列炎癥反應(yīng)，而臍血細(xì)胞則能通過影響炎癥級聯(lián)反應(yīng)達(dá)到降低免疫反應(yīng)，增加神經(jīng)功能效果。研究[6-8]稱，臍血干細(xì)胞移植有以下幾個方面作用：(1)能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，如神經(jīng)生長因子、膠質(zhì)神經(jīng)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等，而這些因子中以神經(jīng)生長因子最為重要，該因子能促進(jìn)腦梗死后腦組織分化形成神經(jīng)細(xì)胞，且能抑制病灶區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腦梗死神經(jīng)細(xì)胞軸突生長和修復(fù)，在本次研究中得到明顯體現(xiàn)，和阿司匹林相類似。(2)能促進(jìn)新血管生長，研究稱臍血干細(xì)胞能通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子直接和間接作用，促進(jìn)梗阻的微血管修復(fù)和再生能力，對神經(jīng)修復(fù)有一定恢復(fù)作用。(3)能減少腦梗死區(qū)域炎癥水腫，縮短治療時(shí)間，研究稱，臍血干細(xì)胞能增強(qiáng)血液通透性，能抑制血小板聚集，降低白細(xì)胞介素1等炎癥因子反應(yīng)。(4)臍血干細(xì)胞移植能減少損傷后局部神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而起到保護(hù)神經(jīng)功能作用。研究[9]稱，臍血干細(xì)胞移植后小鼠脊髓損傷組織內(nèi)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞等Fas表達(dá)受到抑制，會造成有些神經(jīng)信號傳導(dǎo)通路下調(diào)，促使XIAP表達(dá)增加，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

但需指出的是，臍血干細(xì)胞移植具有兩面性，其再生潛能修復(fù)組織能治療臨床上很多疾病，但其又具有復(fù)制性和克隆性，若不受控制生長則會演變?yōu)椴豢煽刂频哪[瘤，故在臨床上要運(yùn)用恰當(dāng)，如何調(diào)節(jié)臍血干細(xì)胞量化分離純化，擴(kuò)增和貯存，調(diào)控細(xì)胞和宿主之間特定細(xì)胞分化而不過度增殖也是研究重點(diǎn)[10]。另外有學(xué)者稱，臍血干細(xì)胞能促進(jìn)GDNF在損傷脊髓中局部表達(dá)，在損傷局部能分泌突膠質(zhì)細(xì)胞分泌的BDNFNT-3，故能提高神經(jīng)功能。

[1]唐映，楊萬章，胡國恒，等.臍血干細(xì)胞移植治療腦卒中的研究現(xiàn)狀[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2013，11(46)：9 361-9 364.

[2]潘鳳華，李曉波，丁新生，等.人臍血干細(xì)胞移植治療大鼠腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究[J].臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2012，19(2)：121-123.

[3]潘鳳華.人胚神經(jīng)干細(xì)胞及人臍血干細(xì)胞移植治療大鼠腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究[D].南京：南京醫(yī)科大學(xué)，2012.

[4]王清勇，楊松林，朱德茂，等.臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦梗死大鼠腦內(nèi)NGF、BDNF表達(dá)的影響[J].中國誤診學(xué)雜志，2012，12(16)：4 122-4 124.

[5]劉海英，李建峰，李洪均，等.人臍血CD34+細(xì)胞移植對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2013，12(3)：451-455.

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[7]丁潔，程焱.臍血間充質(zhì)干細(xì)胞及其在腦梗死治療中的作用[J].國際腦血管病雜志，2012，15(8)：607-611.

[8]馬建華，吳月奎，易波，等.臍血源神經(jīng)干細(xì)胞移植改善局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能障礙[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2014，13(4)：353-357.

[9]歐雅莉，余國龍.經(jīng)體循環(huán)臍血細(xì)胞移植治療腦梗死機(jī)制及其療效影響因素[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2012，31(5)：733-735.

[10]劉劍宇.銀杏達(dá)莫聯(lián)合臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠腦梗死[J].醫(yī)學(xué)信息，2013，26(4)：234-235.

(收稿2015-08-10)

張媚，E-mail：420663068@qq.com

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1673-5110(2016)17-0021-03