田莉莉,牛　良

(中國農(nóng)業(yè)科學院 鄭州果樹研究所,河南 鄭州　450009)

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蘋果抗ASPV病毒 RNAi載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化砧木M26的研究

田莉莉,牛良

(中國農(nóng)業(yè)科學院 鄭州果樹研究所,河南 鄭州450009)

為獲得抗病毒的轉(zhuǎn)基因植物新材料,采用同源重組法構(gòu)建了抗蘋果莖痘病毒的植物表達載體,并對蘋果砧木材料M26進行了遺傳轉(zhuǎn)化,成功獲得了轉(zhuǎn)基因陽性植株。首先以感病的皇家嘎拉葉片為材料,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,采用PCR方法克隆獲得了489 bp的ASPV外殼蛋白基因的保守片段,通過TOPO克隆技術(shù)將該基因片段連接進入載體pENTR/SD/D,構(gòu)建了入門克隆載體pEN-ASPV,再通過LR反應(yīng)置換該片段連接進入目標載體pHellsgate12,構(gòu)建了RNAi植物表達載體Phe-ASPV,并采用凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中,獲得了可用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的工程菌EH-ASPV。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化蘋果砧木M26葉盤,經(jīng)抗生素篩選和脫菌培養(yǎng)獲得了Kan抗性芽,進一步進行生根培養(yǎng)后獲得了完整的Kan抗性植株,對生根植株提取總RNA后RT-PCR檢測結(jié)果顯示,RNAi表達載體上攜帶的外源基因片段(489 bp)已成功轉(zhuǎn)入蘋果砧木材料M26中,并在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)RNA水平上得到表達。獲得的轉(zhuǎn)基因新材料,為進一步通過病毒接種進行抗病性評價及抗病毒分子育種奠定了基礎(chǔ)。

蘋果莖痘病毒;CP基因;RNAi載體;遺傳轉(zhuǎn)化

蘋果是我國果樹的主栽樹種之一,栽培面積和產(chǎn)量均居于世界之首。但是,近年來隨著果樹產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展和苗木調(diào)運日益頻繁,病毒病的傳播日益嚴重。蘋果莖痘病毒(Applestempittingvirus,ASPV)是一種潛隱性病毒,廣泛存在于各大主要產(chǎn)區(qū)。樹體受到侵染之后樹勢衰弱,并引起產(chǎn)量、品質(zhì)等明顯下降,部分植株表現(xiàn)為葉片反卷、木質(zhì)部莖痘斑、果實凹陷等,使果樹生產(chǎn)損失嚴重。目前生產(chǎn)上還沒有較為有效的化學藥劑,采用基因工程的方法培育抗病新材料,不失成為蘋果抗病毒育種的有效方法。

近年來,RNA干擾(RNA interference,RNAi)[1-2]技術(shù)得到了迅速發(fā)展,利用這種高效、特異的基因沉默技術(shù)進行植物抗病毒基因工程育種的研究越來越廣泛,尤其是通過RNAi沉默病毒CP基因在多種作物上獲得了良好的抗病效果,但這方面的研究在蘋果上的應(yīng)用還不多見。本試驗通過克隆蘋果莖痘病毒(ASPV)外殼蛋白(Coat protein,CP)基因的保守區(qū)段,構(gòu)建含該干擾片段正反向連接的RNA干擾表達載體并進行遺傳轉(zhuǎn)化,旨在獲得抗病的轉(zhuǎn)基因蘋果新材料。

1　材料和方法

1.1試驗材料

RNA提取所用植物試材為7年生蘋果品種皇家嘎拉,轉(zhuǎn)基因所用植物材料為蘋果砧木M26,均取自中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所。

1.2試驗方法

1.2.1目標基因片段的克隆依據(jù)NCBI在線數(shù)據(jù)庫已公布的全長基因序列(Acc No.HM12156.1),選擇ASPV病毒CP基因的保守區(qū)序列,設(shè)計合成引物 ASPV-F(序列為5′-CACCAGTTGCATTGATTGGGAT-3′,CACC為TOPO克隆所必需的序列接頭)和ASPV-R(序列為5′-TCCAATTTTTCCCCCAGTGACT-3′)。用EASYspin 植物RNA快速提取試劑盒(北京博凌科為生物科技有限公司)從感病的蘋果葉片中提取植物總RNA,紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度。取1 μg RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒tansScript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金有限公司)說明書操作,合成cDNA第1鏈,-20 ℃保存?zhèn)溆?。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA第1鏈為模板,用pfu DNA聚合酶(Fermentas公司)進行PCR擴增,將PCR產(chǎn)物切膠連接到PMD19-T vector(TaKaRa公司),委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定,運用DNAMAN軟件進行核苷酸序列比對分析。

1.2.2入門克隆載體的構(gòu)建入門克隆載體的構(gòu)建按照pENTRTM/SD/D-TOPO?TOPO Cloning Kit(美國Invitrogen公司)說明書并參照文獻[3-5]進行,取1 μL含有目標基因片段的PCR回收產(chǎn)物(步驟1.2.1獲得),構(gòu)建TOPO Cloning 6 μL反應(yīng)體系,25 ℃條件下反應(yīng)30 min后,熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞(北京康為世紀生物科技有限公司),在含有50 mg/L卡那霉素(Kanamycin,Kan)的LB平板培養(yǎng)基上均勻涂布,37 ℃溫箱培養(yǎng)16 h后,挑取部分單克隆至成分相同的 LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)(37 ℃,200 r/min)14 h后,對陽性克隆用2對引物進行菌液PCR鑒定,所用引物分別為:M13-F(序列為5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′)& ASPV-R和ASPV-F&ASPV-R。陽性菌液委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序,序列正確的陽性克隆命名為入門克隆載體pEN-ASPV。

1.2.3重組RNAi載體的構(gòu)建取步驟1.2.2獲得的質(zhì)粒pEN-ASPV 2 μL,構(gòu)建20 μL反應(yīng)體系,具體按照Gateway?LR Clonase?Ⅱ Enzyme Mix(美國Invitrogen公司)說明書并參照文獻進行LR反應(yīng)構(gòu)建RNAi載體[4-5],骨架質(zhì)粒pHellsgate12由澳大利亞CSIRO公司惠贈。反應(yīng)終止后用熱激法將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞后,在含有100 mg/L 壯觀霉素(Spectinomycin,Spc)的LB平板培養(yǎng)基上均勻涂布,37 ℃倒置培養(yǎng)16 h后單克隆挑至成分相同的LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)(200 r/min 14 h)后提取質(zhì)粒,先用ASPV-F和ASPV-R作引物進行PCR擴增,再將陽性質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和XhoⅠ(TaKaRa產(chǎn)品)進行單酶切,鑒定正確的質(zhì)粒命名為pHe-ASPV(圖1)。將質(zhì)粒pHe-ASPV用凍融交替法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞(果樹生物技術(shù)課題組制備)后,在添加100 mg/L Spc和50 mg/L利福平(Rif)的YEB平板培養(yǎng)基上均勻涂布,倒置培養(yǎng)48 h(28 ℃),取部分單克隆接種至成分相同的YEB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)36 h后用3對引物進行菌液PCR擴增。所用引物分別為:ASPV-F&ASPV-R,P35S-F(序列為5′-GACGCACAATCCCACTATCC-3′)& ASPV-R,NPTⅡ-F(序列為5′-ACAATCGGCTGCTCTGATG-3′) &NPTⅡ-R(序列為5′-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3′),陽性克隆命名為EH-ASPV。

圖1　RNAi載體pHe-ASPV結(jié)構(gòu)圖

1.2.4轉(zhuǎn)基因植株的獲得及檢測春季(4-5月)采集當年生幼嫩枝條,用流水沖洗 2～4 h,剪成約1.0～2.0 cm 長的莖段,先用75%的酒精進行表面消毒,0.1% HgCl2浸泡10 min,無菌水漂洗4～5次,接種在MS+BA 0.5 mg/L培養(yǎng)基上,每4～5周繼代1次。取繼代培養(yǎng)15～20 d的M26無菌苗,無菌條件下將頂部幼嫩葉片從中部劃傷成部分連在一起的葉盤,在MS+BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2 d,將EH-ASPV菌液28 ℃振蕩培養(yǎng)至OD值0.5左右,離心后收集菌體,用同樣體積的MS液體培養(yǎng)基重懸,浸泡侵染葉盤10 min后,用滅過菌的吸水紙吸干附著的菌液后,在MS+BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3 d,然后轉(zhuǎn)接到MS+BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+Cef 250 mg/L培養(yǎng)基上,7 d后轉(zhuǎn)至MS+BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+Kan 50 mg/L+Cef 250 mg/L培養(yǎng)基上,切取獲得的抗性芽接種在MS+BA 0.5 mg/L+Kan 50 mg/L+Cef 250 mg/L培養(yǎng)基上,每14 d繼代1次,連續(xù)繼代3～4次后,發(fā)育良好的抗性芽轉(zhuǎn)至1/2 MS +NAA 0.2+Kan 50 mg/L+Cef 250 mg/L培養(yǎng)基中。選取發(fā)育良好的生根植株(以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的再生苗作對照),用1.2.1所述的方法提取植物總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈,用內(nèi)參基因Actin(Acc No.GQ339778.1)上、下游引物Actin-F(序列為CTTGACTTAGCAGGTCGTGA)&Actin-R(序列為TCGTATGTGGTCTCGTGAAT)(目標片段308 bp)及干擾片段引物ASPV-F&ASPV-R進行RT-PCR擴增,1.0% 瓊脂糖進行凝膠電泳。

2　結(jié)果與分析

2.1ASPV基因片段的克隆

將本試驗獲得的陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入PMD19-T 載體后，經(jīng)測序測得的核苷酸序列長度為489 bp(圖2 )。經(jīng)與NCBI公布的目的基因全長序列(登錄號為HM12156.1)進行同源性比對分析后，其核酸序列與全長序列(HM12156.1)的一致性為91.1%，結(jié)果表明該片段位于目的基因上。

圖2　克隆獲得的ASPV外殼蛋白基因片段序列

2.2入門載體pEN-ASPV的構(gòu)建

TOPO 克隆反應(yīng)后,陽性菌液PCR鑒定的結(jié)果顯示(圖3):以引物ASPV-F和ASPV-R進行PCR擴增后,電泳出現(xiàn)了489 bp大小的目標條帶,和陽性對照擴增結(jié)果一致;而以通用引物M13F和ASPV-R進行PCR擴增后,所得片段明顯大于插入的干擾片段。結(jié)果說明,通過TOPO 克隆,將靶基因片段已連接進入到pENTR/SD/D-TOPO載體。結(jié)合陽性克隆的測序結(jié)果(干擾片段部分序列與目的基因片段的堿基序列完全一致),進一步說明在本試驗所構(gòu)建的入門克隆載體pEN-ASPV上,其干擾片段在載體上插入的方向也是正確的。

2.3RNAi載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

RNAi表達載體酶切鑒定結(jié)果如圖 4,重組質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ和XhoⅠ酶切后,切出的片段在大小上明顯有別于空載體的酶切結(jié)果。顯然，LR反應(yīng)后的重組質(zhì)粒酶切片段的大小約為600 bp,而未反應(yīng)的空載pHellsgate12酶切出的片段則分別為1 419,1 429 bp,與預(yù)期結(jié)果相符合。這說明在所構(gòu)建的RNAi載體上,干擾片段與內(nèi)含子形成了正確的發(fā)卡狀結(jié)構(gòu),成功完成了該載體的構(gòu)建。將pHe-ASPV質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105后,分別用ASPV-F&ASPV-R、P35S-F&ASPV-R和NPTⅡ-F&NPTⅡ-R 3對引物進行PCR擴增后,目標條帶與預(yù)期結(jié)果一致(圖5),表明所構(gòu)建的RNAi表達載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

M.DL2000 Marker;1.以ASPV-F&ASPV-R為引物陽性對照的PCR擴增結(jié)果;2.以M13-F&ASPV-R作引物PCR陽性克隆的PCR擴增結(jié)果;3.以ASPV-F&ASPV-R作引物陽性克隆的PCR擴增結(jié)果。

M.DL2000 Marker;1.PCR results of the positive control when using ASPV-F&ASPV-R as primers;2.PCR results of a positive clone when using primers of M13-F&ASPV-R as primers;3.PCR results of a positive clone when using ASPV-F&ASPV-R as primers.

圖3入門克隆載體pEN-ASPV的PCR鑒定

Fig.3PCR identification of pEN-ASPV

A.pHe-ASPV質(zhì)粒XbaⅠ酶切;B.pHe-ASPV質(zhì)粒XhoⅠ酶切;M.DL2000 Marker;1.陽性克隆酶切結(jié)果,2.pHellsgate12空載酶切結(jié)果。

A.Restriction enzyme identification ofXbaⅠ;B.Restriction enzyme identification ofXhoⅠ;M.DL2000 Marker;1.Enzyme identification of a positive clone;2.Enzyme identification of the pHellsgate12 empty vector.

圖4RNAi表達載體pHe-ASPV的酶切鑒定

Fig.4Identification of the RNAi vector pHe-ASPV by restriction enzyme

M.DL2000 Marker;1.ASPV-F&ASPV-R作引物的PCR產(chǎn)物;2.P35S-F&ASPV-R作引物的PCR產(chǎn)物;3.NPTⅡ-F&NPTⅡ-R作引物的PCR產(chǎn)物。

M.DL2000 Marker;1.PCR results of EH-ASPV when using ASPV-F&ASPV-R as primers;2.PCR results of EH-ASPV when using P35S-F&ASPV-R as primers;3.PCR results of EH-ASPV when usingNPTⅡ-F&NPTⅡ-R as primers.

圖5RNAi表達載體pHe-ASPV轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105陽性克隆的PCR鑒定

Fig.5PCR results of the positive clones of the transformed pHe-ASPV into theAgrobacteriumstrain of EHA105

2.4轉(zhuǎn)基因植株的獲得及檢測

對無菌培養(yǎng)的M26葉盤進行轉(zhuǎn)化之后(圖 6-A),將經(jīng)篩選和脫菌培養(yǎng)后獲得的Kan抗性芽(圖 6-B)進行生根培養(yǎng),獲得了生根良好的Kan抗性植株(圖 6-C)。提取部分植株的總RNA進行RT-PCR檢測的結(jié)果顯示(圖7),在以Actin-F&Actin-R作引物時,轉(zhuǎn)基因植株和對照植株均能擴增出308 bp的預(yù)期片段(內(nèi)參基因),而以ASPV-F&ASPV-R作引物時,對照植株(未經(jīng)轉(zhuǎn)化的再生苗)沒有出現(xiàn)電泳條帶,轉(zhuǎn)基因植株則出現(xiàn)了和干擾片段大小一致(489 bp)的片段,符合預(yù)期結(jié)果。這說明位于RNAi載體上的外源基因片段,通過轉(zhuǎn)化已進入蘋果砧木M26中,整合到受體基因組中并在RNA水平上獲得表達。

3　討論

在我國蘋果生產(chǎn)中,多數(shù)品種和砧木普遍帶毒,其中,ASPV危害最嚴重的潛隱性病毒之一[6]。直接利用ASPV外殼蛋白基因轉(zhuǎn)化煙草的研究前人已有報道[7],近年來，隨著RNAi機理的不斷闡明,其在植物抗病毒基因工程中的研究和應(yīng)用也越來越受到重視[3-4,5,8-12]。

A.農(nóng)桿菌侵染的M26葉盤;B.Kan抗性芽;C.Kan抗性植株。

M.DL2000 Marker;1.對照植株以Actin-F&Actin-R作引物的RT-PCR檢測結(jié)果;2.對照植株以ASPV-F&ASPV-R作引物的RT-PCR檢測結(jié)果;3,5,7,9,11,13.轉(zhuǎn)基因植株以Actin-F&Actin-R作引物RT-PCR結(jié)果;4,6,8,10,12,14.轉(zhuǎn)基因植株以ASPV-F&ASPV-R作引物RT-PCR結(jié)果。

M.DL2000 Marker;1.RT-PCR results of the control plants when usingActin-F&Actin-R as primers;2.RT-PCR results of the the control plants when using ASPV-F&ASPV-R as primers;3,5,7,9,11,13.RT-PCR results of a transformed plants when usingActin-F&Actin-R as primers;4,6,8,10,12,14.RT-PCR results of a transformed plants when using ASPV-F& ASPV-R as primers.

圖7M26轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR檢測的結(jié)果

Fig.7RT-PCR results of the transformed plants of the rootstock M26

通常認為,RNAi介導(dǎo)的病毒抗性是一種序列依賴性的基因沉默[13],其獲得抗病性的主要原理是:利用植物體的RNAi機制,通過合成與病毒自身基因同源的雙鏈RNA,對入侵病毒的遺傳物質(zhì)(RNA)進行特異性地切割和降解反應(yīng),從而保護植物不受危害[2]。在實際應(yīng)用中,多數(shù)學者以選擇病毒外殼蛋白基因最為多見[14-21]。應(yīng)用這一策略,無需轉(zhuǎn)化基因全長序列,只需轉(zhuǎn)化部分片段就可獲得抗病的轉(zhuǎn)基因植株。在構(gòu)建載體所用干擾片段的選擇上,序列長度一般以90～1 800 bp為宜[22],序列位置可以是靶基因開放閱讀框的全部或部分序列,也可以是3′或5′端的非翻譯區(qū),目前還沒有固定的規(guī)則或理論依據(jù)。本試驗選擇了位于目的基因中后部保守區(qū)域的489 bp的基因片段,采用Gateway技術(shù)的同源重組法構(gòu)建了包含靶片段的RNAi表達載體,經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入蘋果砧木M26中,希望轉(zhuǎn)基因植株通過發(fā)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默,干涉入侵病毒的外殼蛋白合成提高抗病性。

自從1986年James等[23]采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法首次獲得綠袖的轉(zhuǎn)基因植株以來,與其他多年生果樹植物相比,蘋果轉(zhuǎn)基因取得了尤為突出的進展,經(jīng)過近30年的研究和應(yīng)用,目前在多數(shù)品種上已建立起比較成熟的葉片再生不定芽技術(shù)體系,并已在金冠、綠袖、皇家嘎拉、富士、M26等多個品種和砧木上獲得了轉(zhuǎn)基因植株,根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法,也成為蘋果遺傳轉(zhuǎn)化最重要的方法之一[24]。本試驗以蘋果砧木M26為試材,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化的近葉盤,抗性芽再生獲得的植株表現(xiàn)為RT-PCR陽性,轉(zhuǎn)化條件尚待進一步優(yōu)化。但通過本研究,筆者將RNAi這一分子生物學策略應(yīng)用于多年生木本植物基因工程,成功構(gòu)建了RNAi載體并轉(zhuǎn)入蘋果砧木,為今后進行病毒抗性評價及選育抗病毒的新材料奠定了基礎(chǔ)理論。

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Construction of Apple stem pitting virus Resistant RNAi Vector and Genetic Transformation into the Rootstock of M26

TIAN Lili,NIU Liang

(Zhengzhou Fruit Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou450009,China)

In order to develop novel disease-resistant transgenic plant materials against ASPV,a virus resistant RNAi plant expression vector was constructed by the method of homologous recombination.With theMalusrootstock of M26,genetic transformation was conducted and positive transgenic plantlets were obtained successfully.Firstly,a conserved segment of coat protein gene of ASPV (489 bp) was cloned by PCR from cDNA of the virus-infective leaves of Royal gala.Then the fragment was inserted into the vector pENTR/SD/D by TOPO cloning technology to form the intermediate vector of pEN-ASPV.After this fragment was replaced and connected into the destination vector pHellsgate12 by LR reaction,the RNAi plant expression vector Phe-ASPV was obtained.And the engineering bacteria EH-ASPV for plant transformation was obtained after the constructed RNAi vector was transformed intoAgrobacteriumstrain EHA105 by alternate freezing and thawing method.By theAgrobateriummediated method,transformation was conducted with the leaf discs of theMalusrootstock of M26.After culture and subculture for antibiotics screening,bacteria elimination and rooting,compact kanamycin resistant plantlets formed from buds were obtained.After total RNA extracted from the well rooted plantlets,RT-PCR test was conducted and the result showed that the gene fragment of 489 bp carried on the RNAi structure had been transformed into the material of M26,which was expressed in plants on the level of RNA.Through this study,novel transgenic materials were obtained successfully,which laid foundation for disease-resistance evaluation by pathogen inoculation and virus-resistant molecular breeding in the near future.

Applestempittingvirus;Coat protein gene;RNAi vector;Transgenosis

2016-03-10

國家“863”項目(2011AA100204)

田莉莉(1971-),女,河北衡水人,副研究員,博士,主要從事果樹生物技術(shù)研究。

牛良(1975-),男,河南信陽人,副研究員,碩士,主要從事果樹育種方面的研究。

Q78；S432.4+1

A

1000-7091(2016)04-0100-06

10.7668/hbnxb.2016.04.017