楊　斌,薩茹麗,張月梅,達來寶力格,宋　越,宋愛軍,陳　偉,盧　巖,劉　敏,楊　英,趙世華

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院 獸醫(yī)研究所,內(nèi)蒙古 呼和浩特　010031;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院,內(nèi)蒙古 呼和浩特　010018;3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院,內(nèi)蒙古 呼和浩特　010018)

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藍刺頭多糖體外抗氧化及抗菌活性的研究

楊斌1,薩茹麗2,張月梅1,達來寶力格1,宋越1,宋愛軍1,陳偉1,盧巖1,劉敏1,楊英3,趙世華1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院 獸醫(yī)研究所,內(nèi)蒙古 呼和浩特010031;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院,內(nèi)蒙古 呼和浩特010018;3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院,內(nèi)蒙古 呼和浩特010018)

通過研究藍刺頭粗多糖及其洗脫純化組分藍刺頭多糖A、B、C的體外抗氧化和抗菌作用,初步確定藍刺頭多糖的生物活性。結果顯示,添加濃度相同時，藍刺頭粗多糖的總還原能力以及清除DPPH有機自由基能力最強，顯著高于藍刺頭多糖A，極顯著高于藍刺頭多糖B、C。當添加濃度為0.1～0.3 mg/mL時，藍刺頭粗多糖清除羥基自由基的能力略高于藍刺頭多糖A，但差異不顯著；當添加濃度為0.4 mg/mL時，藍刺頭粗多糖清除羥基自由基的能力略高于藍刺頭多糖A，藍刺頭多糖A略高于藍刺頭多糖B，三者差異不顯著，但均極顯著高于藍刺頭多糖C，當添加濃度為0.5 mg/mL時，藍刺頭粗多糖清除羥基自由基的能力顯著高于藍刺頭多糖A、B，極顯著高于藍刺頭多糖C。試驗條件下，藍刺頭粗多糖和藍刺頭多糖A對大腸桿菌為低度敏感，最低抑菌濃度均為0.62 mg/mL，藍刺頭多糖B和C對大腸桿菌不敏感，最小抑菌濃度均為1.25 mg/mL；藍刺頭粗多糖、藍刺頭多糖A、B和C對金黃色葡萄球菌為不敏感，最低抑菌濃度分別為1.25，2.50，2.50，2.50 mg/mL；藍刺頭粗多糖、藍刺頭多糖B、C對銅綠假單胞菌為不敏感，最低抑菌濃度均為5.00 mg/mL，藍刺頭多糖A對銅綠假單胞菌無抑制作用；藍刺頭粗多糖和藍刺頭多糖A、B、C對沙門氏菌均為不敏感，最低抑菌濃度分別為2.50，2.50，1.25，5.00 mg/mL。說明藍刺頭粗多糖的抗氧化能力最強，其次為藍刺頭多糖A，而藍刺頭多糖B和C的抗氧化能力較弱。藍刺頭粗多糖和藍刺頭多糖A具有一定的抗大腸桿菌活性，藍刺頭粗多糖和藍刺頭多糖A、B、C均無抗金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌以及沙門氏菌活性。

藍刺頭;多糖;抗氧化活性;抗菌活性

藍刺頭(EchinopslatifoliusTausch,ET)為菊科藍刺頭屬植物,全球約120余種,中國約有19種,主要分布在東北、西北地區(qū)。中醫(yī)將其根入藥,具有清熱解毒、排膿止血等功效。蒙醫(yī)則將其干燥花序以及種子入藥,用于接骨愈傷、清熱止痛等疾病。除此之外,國外研究者將其用于治療偏頭痛、麻風病、肺結核、梅毒等疾病,均取得了良好的治療效果[1-2]。我國對藍刺頭屬植物研究較多的主要是藍刺頭、砂藍刺頭、華東藍刺頭、新疆藍刺頭等,雖然國外相關報道較多,但多集中于本國或本地區(qū)的代表品種,研究的方向主要集中于對成分的分離鑒定和生物活性研究2個方面[3-4]。本試驗以藍刺頭粗多糖及不同洗脫所得精多糖為研究對象探討不同藍刺頭多糖的總還原能力、體外清除DPPH有機自由基、清除羥基自由基能力以及體外對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌的抗菌活性,目的為確定藍刺頭多糖的活性成分,進一步研究藍刺頭多糖的生物活性提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

藍刺頭粗多糖及藍刺頭精多糖:實驗室自制,方法依據(jù)家畜普通病研究課題組已報道方法進行[5]。菌種:大腸桿菌(ATCC-25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC-25923)、銅綠假單胞菌(27853)和沙門氏菌(50096),所用菌種均由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學病原微生物實驗室提供,使用前均需將菌株復蘇培養(yǎng),選用對數(shù)生長期細菌進行試驗。

清除羥基自由基試劑盒購自南京建成生物科技公司;DPPH、BHT、DMSO、MTT等均購自美國Sigma公司;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥芽糖、蛋白胨、瓊脂等購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司;PBS溶液購自Hyclone公司;鐵氰化鉀、三氯乙酸以及三氯化鐵等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2主要儀器

Synergy H4多功能酶標儀、離心機、恒溫生化培養(yǎng)箱、微量振蕩混勻機等。

1.3試驗方法

1.3.1藍刺頭多糖的提取與分離純化稱取75 ℃烘干至恒重的藍刺頭500 g,加10倍水浸泡12 h,煮沸提取2 h,過濾收集濾液,濾渣再同法煎煮1次,過濾,合并2次濾液,旋轉蒸發(fā)儀濃縮至1 000 mL。邊攪拌邊緩慢加入無水乙醇至乙醇終濃度為80%,4 ℃沉淀24 h,3 000 r/min離心 30 min收集沉淀。沉淀揮去乙醇后用熱水復溶,置于冷凍干燥機中凍干,得藍刺頭粗多糖(Crude polysaccharide ofEchinopslatifoliusTausch,ETCP)。

將所得藍刺頭粗多糖經(jīng)DEAE-52離子交換柱層析后分別使用蒸餾水、0.1,0.2 mol/L氯化鈉溶液進行洗脫,洗脫成分分別命名為藍刺頭多糖A (EchinopslatifoliusTausch polysaccharide A,ETPA)、藍刺頭多糖B(EchinopslatifoliusTausch polysaccharide B,ETPB)、藍刺頭多糖C(EchinopslatifoliusTausch polysaccharide C,ETPC),將各洗脫分離組分濃縮至浸膏狀,冷凍干燥成粉末備用。1.3.2總還原能力的測定在試管中分別加入2.5 mL/管pH值6.6的PBS溶液,再加入0.01 g/mL的鐵氰化鉀溶液1 mL,混勻后分別加入不同的藍刺頭多糖1 mL并充分搖勻,各多糖濃度分別為0.50,1.00,1.50,2.00,2.50,3.00 mg/mL,對照組加入相同濃度的葡萄糖溶液,50 ℃水浴保溫靜置20 min,待冷卻后迅速加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL,搖勻后吸取2 mL于另一試管中,加入0.1 g/mL的三氯化鐵溶液1 mL,混勻靜置10 min后于700 nm處檢測吸光值,總還原能力以吸光度值表示。

1.3.3體外清除DPPH有機自由基的能力參照王華等[6]的報道,略作調整。分別取100 μL的藍刺頭多糖與2×10-4mol/L DPPH液100 μL于96孔板中,各多糖濃度分別為0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/mL,對照組加入相同濃度的葡萄糖溶液,中速混勻5 min,避光反應30 min后測定525 nm處吸光度(Ai)。與此同時也分別測定100 μL 95%乙醇加100 μL DPPH后的吸光度(Ac)和100 μL待測液加100 μL 95%乙醇后的吸光度(Aj)。

結果計算:清除率=(1-(Ai-Aj)/Ac)×100%

1.3.4體外清除羥基自由基的能力按照南京建成試劑盒操作說明執(zhí)行。

結果計算:清除率=(A0-(Ai-Ax))/A0×100%1.3.5體外抗菌試驗抑菌圈直徑的測定:按照常規(guī)方法制備無菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,每個培養(yǎng)皿20 mL,待瓊脂冷卻凝固后,將定植過的1×106cfu/mL的供試菌液取1 mL,均勻涂布在培養(yǎng)基上,后放置4個滅菌牛津杯,各加入10 mg/mL 的多糖溶液200 μL,置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察抑菌效果。游標卡尺測量抑菌環(huán)直徑,并評價其抑菌效果。每個濃度的藥物抑菌試驗重復3次,抑菌結果為3次試驗平均值。判定標準:抑菌圈直徑≤8.0 mm為不敏感,8.1～13.0 mm為低度敏感,13.1～19.0 mm為中度敏感,>19.0 mm為高度敏感[7]。

最小抑菌濃度的測定:采用微量稀釋法進行。96孔細胞培養(yǎng)板中,依次加入用培養(yǎng)基倍比稀釋的各藍刺頭多糖溶液,每孔200 μL,最后一孔僅加培養(yǎng)基和細菌作為對照孔,然后在每孔中加入稀釋菌液50 μL,此時孔中各藍刺頭多糖濃度分別為 5.00,2.50,1.25,0.62,0.31,0.16 mg/mL,置于微型振蕩混勻機上振蕩混勻1 min,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h,眼觀無細菌生長孔所含最低藥物濃度即為最小抑菌濃度。試驗重復3次,求平均值。

藍刺頭多糖體外抑菌率的測定:使用比濁法將供試菌濃度調至1×104cfu/mL的細菌溶液后,用MTT法檢測各藍刺頭多糖的體外抑菌率,試驗方法參照許穎等[8]的方法。

1.3.6數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件進行初步整理后使用SAS 9.0進行統(tǒng)計分析。

2　結果與分析

2.1藍刺頭多糖總還原能力的測定結果

由表1可知，隨著添加濃度的增大，各藍刺頭多糖的總還原能力均逐步增強。在相同濃度條件下，藍刺頭粗多糖的總還原能力顯著高于藍刺頭多糖A(P<0.05)，極顯著高于藍刺頭多糖B、C及對照組(P<0.01)，藍刺頭多糖A顯著高于藍刺頭多糖B、C及對照組(P<0.05)，藍刺頭多糖B、C同對照組比較差異不顯著(P>0.05)。由此看出，在試驗劑量范圍內(nèi)，藍刺頭粗多糖的總還原能力最強，其次為藍刺頭多糖A，藍刺頭多糖B和C的總還原能力最弱。

表1　藍刺頭多糖總還原能力的測定結果

注:同列數(shù)據(jù)注“*”表示差異顯著(P<0.05),“**”表示差異極顯著(P<0.01)。表2-3同。

Note:Date in a column with “*” indicate significant difference (P<0.05),with “**” indicate extremely significant difference(P<0.01).The same as Tab.2-3.

2.2藍刺頭多糖體外清除DPPH有機自由基能力的測定結果

由表2可知，隨著添加濃度的增大，藍刺頭粗多糖和藍刺頭多糖A的體外清除DPPH有機自由基能力均逐漸增加，藍刺頭多糖B和C組無明顯變化。在相同濃度條件下，藍刺頭粗多糖組顯著高于藍刺頭多糖A(P<0.05)，極顯著高于藍刺頭多糖B、C組和對照組(P<0.01)，藍刺頭多糖A組同藍刺頭多糖B、C組和對照組比較差異顯著(P<0.05)，藍刺頭多糖B、C組和對照組比較有增高的趨勢，但組間差異不顯著(P>0.05)。由此看出，在試驗劑量范圍內(nèi)藍刺頭粗多糖具有較好的體外清除DPPH有機自由基的能力，藍刺頭多糖A的體外清除DPPH有機自由基能力較弱，而藍刺頭多糖B和C無顯著的清除DPPH有機自由基的能力。

表2　藍刺頭多糖體外清除DPPH有機自由基能力的測定結果

2.3藍刺頭多糖體外清除羥基自由基能力的測定結果

由表3可知，隨著添加濃度的增大，各藍刺頭多糖的體外清除羥基自由基能力均逐漸增加。當添加濃度為0.1～0.3 mg/mL時，藍刺頭粗多糖和藍刺頭多糖A組同對照組比較差異不顯著(P>0.05)，藍刺頭多糖B組顯著低于對照組(P<0.05)，藍刺頭多糖C組極顯著低于對照組(P<0.01)。當添加濃度為0.4 mg/mL時，藍刺頭多糖C組極顯著低于對照組(P<0.01)，其他各組同對照組比較差異不顯著(P>0.05)。當添加濃度為0.5 mg/mL時，藍刺頭粗多糖顯著高于對照組(P<0.05)，藍刺頭多糖A和B組同對照組比較差異不顯著(P>0.05)，藍刺頭多糖C組顯著低于對照組(P<0.05)。由此可知，在試驗劑量范圍內(nèi)藍刺頭粗多糖體外清除羥基自由基能力最強，其次為藍刺頭多糖A和B，藍刺頭多糖C的體外清除羥基自由基能力最弱。

表3　藍刺頭多糖體外清除羥基自由基能力的測定結果

2.4藍刺頭多糖體外抗菌活性研究

2.4.1藍刺頭多糖抑菌圈直徑測定由表4可知,各多糖添加濃度為10 mg/mL時,藍刺頭粗多糖和藍刺頭多糖A體外對大腸桿菌的低度敏感(抑菌圈直徑≥8 mm),對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和沙門氏菌不敏感(抑菌圈直徑<8 mm)。藍刺頭多糖B和C對上述4種菌均不敏感(抑菌圈直徑<8 mm),其中藍刺頭多糖A對銅綠假單胞菌無抑制作用。

表4　藍刺頭多糖抑菌圈直徑測定結果

2.4.2藍刺頭多糖最小抑菌濃度測定由表5可知,藍刺頭粗多糖與藍刺頭多糖A對大腸桿菌的抑菌作用強于藍刺頭多糖B和C,最低抑菌濃度均為0.62 mg/mL,藍刺頭多糖B和C的最小抑菌濃度均為1.25 mg/mL;藍刺頭粗多糖對金黃色葡萄球菌抑菌作用強于其他多糖,最低抑菌濃度為1.25 mg/mL，其他3種多糖的最低抑菌濃度均為2.5 mg/mL;各藍刺頭多糖組對銅綠假單胞菌抑制作用均較弱,其中藍刺頭多糖A對該菌無明顯抑制作用,其余3種多糖對該菌的最小抑菌濃度為5.00 mg/mL;各藍刺頭多糖中藍刺頭多糖B對沙門氏菌抑制作用最強,最低抑菌濃度為1.25 mg/mL,其次為藍刺頭粗多糖和藍刺頭多糖A對沙門氏菌的抑制作用較低,最低抑菌濃度為2.50 mg/mL,藍刺頭多糖C對沙門氏菌的抑菌作用較弱，最低抑菌濃度為5.0 mg/mL。

表5　藍刺頭多糖最小抑菌濃度測定

3　討論與結論

3.1藍刺頭多糖體外抗氧化活性

自由基,又名“游離基”,是機體組織細胞正常生理代謝過程中產(chǎn)生的一種含有一個不成對電子的原子團,是一種活性氧,化學性質活潑,具有較強的氧化能力,可導致細胞、蛋白以及核酸的氧化損傷。如若不能及時有效地控制自由基的濃度,清除機體內(nèi)游離基,則會使機體氧化應激機制啟動,嚴重者導致各個系統(tǒng)的生理功能紊亂、促使細胞破裂、凋亡、癌變等。許多研究證明,導致人類癌癥、糖尿病、老年癡呆以及帕金森等疾病以及衰老死亡生理過程的罪魁禍首就是活性氧自由基[9-11]。而多糖作為天然植物提取物,許多研究均表明植物多糖具有較強的抗氧化活性,如:張志軍等[12]研究報道,靈芝多糖具有較強的體外清除自由基能力與還原能力,且通過試驗證明靈芝多糖的這種抗氧化能力與其添加計量呈正相關,具有劑量效應關系。羅旭艷等[13]研究報道，楊桃根多糖能夠明顯地抑制羥基自由基和超氧陰離子自由基的生成。尚曉婭等[14]研究報道，絞股藍多糖具有較強的還原能力,能夠有效地清除羥基自由基和DPPH有機自由基。目前研究者們認為多糖類物質的抗氧化機制主要為:多糖碳鏈上的氫原子與機體內(nèi)自由基結合脫水,反應產(chǎn)生的單電子繼續(xù)氧化變成過氧自由基后分解[9]；多糖與機體代謝產(chǎn)生的活性氧或金屬離子螯合,使氧化終止[15]；提高機體內(nèi)自身的抗氧化酶的活性,使其活性增強,從而起到抑制氧化的目的[16]；多糖通過提高機體免疫能力而提高機體的抗氧化、抗衰老作用[17]。本試驗結果顯示,藍刺頭多糖作為天然植物多糖也具有多糖類物質普遍具有的還原性、清除DPPH有機自由基以及清除羥基自由基活性,并且顯示藍刺頭多糖的這些生物活性與其添加量具有劑量效應關系,通過試驗可知，在試驗條件下，藍刺頭粗多糖的體外抗氧化能力要優(yōu)于分離純化后的藍刺頭多糖A、B和C，由此看出，藍刺頭多糖可直接與游離自由基結合,使其活性降低的主要成分在藍刺頭多糖A中,并且證明作為抗氧化劑藍刺頭粗多糖的抗氧化活性更佳。

3.2藍刺頭多糖體外抗菌活性

天然植物提取物抗菌效力的測定對于天然植物活性成分的研究與開發(fā)具有十分重要意義。而藥敏試驗因其直觀、靈敏等優(yōu)點已經(jīng)成為抗菌藥物研究與植物抗菌成分的研究中的經(jīng)典方法,目前所用的藥敏試驗方法包括擴散法、稀釋法和聯(lián)合藥敏試驗等。而此方法中將細菌對試驗藥物的敏感性分為高敏(抑菌圈直徑>19 mm)、中敏(抑菌圈直徑為13 mm

藍刺頭多糖具有較強的還原能力以及清除羥基自由基和DPPH有機自由基的能力。其中以藍刺頭粗多糖的抗氧化能力最強,且呈劑量效應關系。其次藍刺頭多糖A具有較好的抗氧化能力。而藍刺頭粗多糖及其洗脫純化組分藍刺頭多糖A、B、C均無較顯著的體外抗金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌以及沙門氏菌活性,藍刺頭粗多糖和藍刺頭多糖A具有一定的抗大腸桿菌活性。

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Study on Antioxidant and Antibacterial Activity in vitro ofEchinopslatifoliusTausch Polysaccharides

YANG Bin1,SA Ruli2,ZHANG Yuemei1,DALAI Baolige1,SONG Yue1,SONG Aijun1,CHEN Wei1,LU Yan1,LIU Min1,YANG Ying3,ZHAO Shihua1

(1.Institute of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Huhhot010031,China;2.College of Animal Science,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot010018,China;3.College of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China)

In this study antioxidant activity and antibacterial activity ofEchinopslatifoliusTausch polysaccharides was researched.The result showed that when the initial concentrations were same,ETCP has a highest effect of total reducing capacity,clearance of DPPH free radicalinvitro,higher than ETPA,significantly higher than ETPB and ETPC.When the added concentrations were 0.1-0.3 mg/mL,ETCP has a little higher scavenging effects on free radicals than that of ETPA,but no obvious difference;when the added concentrations were 0.4 mg/mL,ETCP has a little higher scavenging effects on free radicals than that of ETPA,ETPA has a little higher scavenging effects than that of ETPB,and difference were not significant,they were significantly higher than that ETPC,when the added concentrations were 0.5 mg/mL,ETCP has a higher scavenging effects on free radicals than that of ETPA,ETPB,significantly higher than ETPC.Experimental condition,ETCP and ETPA were less sensitive toE.coli,the minimal inhibitory concentration(MIC) were 0.62 mg/mL,ETPB and ETPC were insensitive the MIC were 1.25 mg/mL;ETCP,ETPA,ETPB and ETPC were insensitive toStaphylococcusaureus,the MIC were 1.25,2.50,2.50,2.50 mg/mL respectively;ETCP,ETPB and ETPC were insensitive toPseudomonasaeruginosa,the MIC were 5.00 mg/mL,ETPA had no inhibition toPseudomonasaeruginosa;ETCP,ETPA,ETPB and ETPC were insensitive to Salmonella,the MIC were 2.50,2.50,1.25,5.00 mg/mL respectively.It means ETCP has the strongest antioxidant effect and secondly for ETPA,ETPB and ETPC were weak.ETCP and ETPA has a certain resistance to activity ofE.coli,and ETPA,ETPB and ETPC has no antibacterial action toStaphylococcusaureus,PseudomonasaeruginosaandSalmonella.

EchinopslatifoliusTausch;Polysaccharide;Antioxidant activity;Antibacterial activity

2016-01-05

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金項目(2016BS(LH)0301);內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)創(chuàng)新基金項目(2013CXJJM05)

楊斌(1984-),男,內(nèi)蒙古錫林浩特人,助理研究員,博士,主要從事家畜普通病防控研究。

趙世華(1962-),男,內(nèi)蒙古烏蘭察布人,研究員,主要從事動物疫病防控研究。

S853.74

A

1000-7091(2016)04-0233-06

10.7668/hbnxb.2016.04.036