柳昭君,郭培紅,2,徐　樂(lè),付監(jiān)貴,肖蘭瑩,宋學(xué)宏

(1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,江蘇蘇州　215123;2.昆山貝瑞康生物科技有限公司,江蘇昆山　215345)

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抗黃顙魚(yú)“紅頭病”功能性蛋粉的制備及其應(yīng)用

柳昭君1,郭培紅1,2,徐樂(lè)1,付監(jiān)貴1,肖蘭瑩1,宋學(xué)宏1

(1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,江蘇蘇州215123;2.昆山貝瑞康生物科技有限公司,江蘇昆山215345)

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用黃顙魚(yú)購(gòu)自蘇州吳江某養(yǎng)殖場(chǎng),規(guī)格(35±5)g,于3 %的食鹽水中浸洗5 min后放入蘇州大學(xué)養(yǎng)殖試驗(yàn)室玻璃鋼水族箱中暫養(yǎng),暫養(yǎng)期間投喂普通黃顙魚(yú)商品飼料,待用。

1.2試驗(yàn)方法

將制備好的菌懸液按體積比例添加0.5 %的甲醛,放入水浴振蕩器中,28 ℃振蕩48 h滅活[9]。取0.1 mL滅活菌苗接種到綿羊鮮血胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)平板上,28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h,觀察平板上是否有病原菌生長(zhǎng),以確定菌苗中是否含有未滅活完全的病原菌。將確定滅活的菌液6 000 r/min離心30 min,用滅菌PBS沖洗2次,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),調(diào)節(jié)菌濃度為1×109CFU/mL,于-20 ℃下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3蛋雞免疫

選擇生物安全隔離條件好、飼養(yǎng)管理科學(xué)規(guī)范、雞群健康的吳江市某雞場(chǎng),500羽具有高免疫應(yīng)答能力的正在產(chǎn)蛋的無(wú)特定病原體攜帶的健康產(chǎn)蛋雞(海蘭蛋雞,112日齡)作為試驗(yàn)雞群,飼養(yǎng)管理按照海蘭蛋雞產(chǎn)蛋期飼養(yǎng)管理要求進(jìn)行。蛋雞首次免疫采用弗氏完全佐劑苗(弗氏佐劑購(gòu)自Sigma公司),此后免疫采用弗氏不完全佐劑苗,滅活菌苗與佐劑1∶1混合,雞胸肌與頸部皮下注射免疫,劑量為0.9 mL/只[10]。同樣劑量和方法免疫三次,第一次與第二次間隔7 d,第二次與第三次間隔20 d。第一次接種后從第20 d開(kāi)始抽檢雞蛋中抗體滴度。

1.2.5功能性蛋粉中IgY效價(jià)測(cè)定

1.2.6功能性蛋粉對(duì)黃顙魚(yú)“紅頭病”的預(yù)防試驗(yàn)

免疫保護(hù)率=(對(duì)照組死亡率-試驗(yàn)組死亡率)/對(duì)照組死亡率×100%

1.2.7 功能性蛋粉對(duì)感染“紅頭病”黃顙魚(yú)的治療試驗(yàn)

2　結(jié)果

表1　　愛(ài)德華氏菌對(duì)黃顙魚(yú)的致病力Tab.1　The pathogenicity of E.ictaluri on P.fulvidraco

2.1功能性蛋粉中IgY效價(jià)

2.2功能性蛋粉對(duì)黃顙魚(yú)“紅頭病”的預(yù)防效果

給健康黃顙魚(yú)進(jìn)行攻毒1 d后,試驗(yàn)潑灑組、口服組分別共有5尾和12尾注射部位出現(xiàn)紅腫癥狀,3 d后分別共有8尾和18尾出現(xiàn)鰭條基部、鰓蓋和下頜充血,5 d后病魚(yú)頭頂皮下發(fā)紅死亡;對(duì)照潑灑組和口服組在3 d內(nèi)均出現(xiàn)明顯癥狀,7 d后對(duì)照潑灑組共55尾死亡,對(duì)照口服組共58尾死亡。功能性蛋粉對(duì)黃顙魚(yú)“紅頭病”的預(yù)防結(jié)果見(jiàn)表3。上述試驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)本法所制備的功能性蛋粉潑灑或投喂的試驗(yàn)組黃顙魚(yú)能產(chǎn)生顯著抵抗“紅頭病”的能力,免疫保護(hù)率分別達(dá)到85.5%和70.0%,而對(duì)照組的發(fā)病率則接近100%。

表2　抗體效價(jià)檢測(cè)時(shí)的OD值Tab.2　The OD value of antibody titer test

表3　含抗　愛(ài)德華氏菌IgY的功能性蛋粉 對(duì)黃顙魚(yú)“紅頭病”的預(yù)防結(jié)果Tab.3　The prevention results of the functional egg powder that containing specific IgY against E.ictaluri on red-head disease in P.fulvidraco

2.3 功能性蛋粉對(duì)感染“紅頭病”的黃顙魚(yú)的治療效果

感染病原菌并開(kāi)始治療1 d后,試驗(yàn)潑灑組、口服組分別死亡5尾和9尾,2 d后又分別死亡8尾,3 d后試驗(yàn)潑灑組死亡6尾,試驗(yàn)口服組死亡10尾,4 d后試驗(yàn)潑灑組停止死亡,試驗(yàn)口服組死亡5尾,5 d 后試驗(yàn)口服組死亡3尾,6 d停止死亡;而對(duì)照組每天均有死亡。14 d后功能性蛋粉對(duì)感染“紅頭病”的黃顙魚(yú)的治療情況如表4。試驗(yàn)結(jié)果表明,本法制備的特異性免疫蛋粉對(duì)感染“紅頭病”的黃顙魚(yú)有很好的治愈效果,其中潑灑組治愈率達(dá)到67.2%,投喂組達(dá)到40.7%,而對(duì)照組感染“紅頭病”的黃顙魚(yú)病情基本沒(méi)有得到任何改善。

表4 　含抗　愛(ài)德華氏菌IgY的功能性蛋粉對(duì) 黃顙魚(yú)“紅頭病”的治療情況Tab.4　The treatment results of the functional egg powder that containing specific IgY against E.ictaluri on red-head disease in P.fulvidraco

3　討論

1893年Klemperer發(fā)現(xiàn)母雞血清中的抗體可以通過(guò)卵向幼雛轉(zhuǎn)移抗體。此后,國(guó)內(nèi)外對(duì)各種抗原(細(xì)菌、病毒、蛋白質(zhì))在蛋雞產(chǎn)生抗體的機(jī)制,以及特異性卵黃抗體在動(dòng)物疾病感染防治中的作用進(jìn)行了大量研究[11-16]。與接種滅活菌苗、弱化的疫苗或類毒素宿主所獲得的主動(dòng)免疫相比,卵黃抗體(IgY)屬于被動(dòng)免疫,使宿主肌體直接獲得抗體,增強(qiáng)特異性免疫能力。其特點(diǎn)是效應(yīng)快,不需經(jīng)過(guò)潛伏期,一經(jīng)輸入,立即可獲得免疫力;同時(shí),卵黃抗體性質(zhì)穩(wěn)定(可常溫長(zhǎng)期保存)、產(chǎn)量高、成本低,且具有動(dòng)物種系發(fā)生學(xué)距離優(yōu)勢(shì);其次,卵黃抗體因其以營(yíng)養(yǎng)全面、特殊腥味的雞蛋為載體,具有較強(qiáng)的誘食作用。因此,抗病原體的特異性卵黃抗體具有保持期長(zhǎng)、無(wú)需提純、制備與使用方法簡(jiǎn)單、效價(jià)高等優(yōu)點(diǎn),在水產(chǎn)動(dòng)物疾病的防治中發(fā)揮重要的作用,具有較好的應(yīng)用前景。本研究制備的抗黃顙魚(yú)“紅頭病”的抗體效價(jià)達(dá)1∶5 120，制成粉劑后可全池潑灑或作為飼料添加劑或預(yù)混料直接投喂,克服了其他疫苗只能注射或浸泡才能有效的缺點(diǎn),使用方便,大大降低了勞動(dòng)強(qiáng)度,這為預(yù)防和治療黃顙魚(yú)“紅頭病”提供了一種簡(jiǎn)單有效的方法。

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(責(zé)任編輯：鄧薇)

Preparation and application of the functional egg powder against the red-head disease in Chinese yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco)

LIU Zhao-jun1,GUO Pei-hong1,2,XU Le1,FU Jian-gui1,XIAO Lan-ying1,SONG Xue-hong1

(1.SchoolofBiologyandBasicMedicalSciences,SoochowUniversity,Suzhou215123,Jiangsu,China;2.KunshanBestcareBio-TechCo.,Ltd,Kunshan215345,Jiangsu,China)

To evaluate the prevention and healing effects of functional egg powder containingEdwardsiellaictaluri-specific IgY on red-head disease in Chinese yellow catfish (Pelteobagrusfulvidraco),the inactivatedE.ictaluri(The type culture collection number:CTCC NO:M2012024) was used to immunize laying hens,and then the functional egg powder was prepared by film-coating and high-speed centrifugal spray drying techniques.After treatment with the functional egg powder by splashing and/or oral administration,the relative percent survival for the catfish was detected.The results showed that the antibody titer of the functional egg powder achieved 1∶5120.The relative survival rate of catfish was 85.5% or 70.0%,by re-challenge with pathogenicE.ictaluriat 2.0×107CFU/mL after splashing for 3 d with egg powder at 2 mg/L,or after oral administration for 14 d at 0.2% body weight,respectively.On the other hand,the relative survival rate of those artificially-infected withE.ictaluriwas 67.2% or 40.7%,after splashing for 5 d,or after oral administration for 14 d.This observation proved the prevention and healing effects of the functional egg powder on red-head disease in Chinese yellow catfish.

functional egg powder;specific IgY;Edwardsiellaictaluri;Chinese yellow catfish (Pelteobagrusfulvidraco);immune protection

2015-11-12；

2016-03-28

昆山市農(nóng)業(yè)科技計(jì)劃項(xiàng)目(KN1204)；江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2013344)

柳昭君(1990-),女,碩士研究生,專業(yè)方向?yàn)樗锝】叼B(yǎng)殖。E-mail:876191046@qq.com

宋學(xué)宏。 E-mail:songxh@suda.edu.cn

S963.73

A

1000-6907-(2016)05-0070-05