張　琛,楊長(zhǎng)庚,文　華,蔣　明,劉　偉,喻麗娟,田　娟,吳　凡

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,武漢　430070;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所,武漢　430223)

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飼料中添加紅景天對(duì)吉富羅非魚耐低溫特性的影響

張琛1,2,楊長(zhǎng)庚2,文華2,蔣明1,2,劉偉2,喻麗娟2,田娟2,吳凡2

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,武漢430070;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所,武漢430223)

實(shí)驗(yàn)采用高山紅景天(Rhodiolasachalinensis)作為飼料添加劑，探究其對(duì)低溫脅迫下的吉富羅非魚(Oreochromisniloticus，GIFT)的影響。將0.1%、0.2%、0.4%的高山紅景天水煎劑粗提干粉分別添加到基礎(chǔ)飼料(對(duì)照組)，用4種實(shí)驗(yàn)飼料投喂吉富羅非魚54 d，然后進(jìn)行低溫脅迫處理并于30、25、20、15和10 ℃時(shí)分別取樣。結(jié)果顯示：水溫為10 ℃時(shí)，添加組的成活率為100%，顯著高于對(duì)照組，添加組血清中的血糖、高密度脂蛋白膽固醇、一氧化氮濃度和肝臟中的丙二醛水平較對(duì)照組顯著降低；肝臟中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的酶活性水平較對(duì)照組顯著升高，并且添加水平越高，效果越明顯。以上結(jié)果說(shuō)明，飼料中添加0.1%的高山紅景天粗提干粉即能對(duì)提高羅非魚的抗低溫能力起到一定的積極作用，添加0.2%和0.4%的效果更好。

吉富羅非魚(GIFT，Oreochromisniloticus)；高山紅景天(RhodiolasachalinensisA.Bor.)；低溫脅迫；添加劑

羅非魚屬于溫水魚類，其生長(zhǎng)溫度為16～38 ℃，適溫為22～35 ℃，耐低溫能力較差[1]。近年來(lái)，由于極端寒潮的影響，我國(guó)羅非魚主產(chǎn)區(qū)經(jīng)常發(fā)生羅非魚大面積凍死凍傷的情況，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。如何提高羅非魚耐低溫能力已成為羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展所面臨的重要問(wèn)題之一。高山紅景天(RhodiolasachalinensisA.Bor.)是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用植物，含有40余種化學(xué)成分，其主要藥理成分為紅景天苷(salidroside，C14H20O7)、苷元酪醇(tyrosol，C6H10O2)和紅景天多糖(R.SachalinensisPolysaccaride，RSP)等[2]。研究表明，紅景天苷具有提高機(jī)體寒冷耐受性[3]，提高特異性免疫及非特異性免疫的功能[4]，高山紅景天多糖具有降血糖、血脂[5]的作用， 高山紅景天醇提取物具有良好的抗氧化和抗應(yīng)激功能[6]。

吉富羅非魚(Oreochromisniloticus，GIFT)是經(jīng)過(guò)遺傳性狀改良的羅非魚新品系，由尼羅羅非魚(O.niloticus)的亞洲品系與非洲品系選育而成，生長(zhǎng)速度快、魚體高、背厚、出肉率高、遺傳性狀穩(wěn)定，而耐低溫能力較差[7]。已有研究表明，吉富羅非魚在水溫為15～16 ℃時(shí)表現(xiàn)出攝食減少的現(xiàn)象，致死溫度范圍為8.4～11 ℃[8]。本實(shí)驗(yàn)以吉富羅非魚作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，投喂含不同濃度的高山紅景天粗提干粉的實(shí)驗(yàn)飼料，在不同的溫度下采樣，通過(guò)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)魚的成活率、血液生理生化指標(biāo)以及抗氧化指標(biāo)評(píng)估高山紅景天對(duì)吉富羅非魚耐低溫脅迫的影響，為開(kāi)發(fā)提高吉富羅非魚耐低溫能力的飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1高山紅景天粗提干粉的制備

高山紅景天的水煎劑粗提干粉制作方法如下：將300 g高山紅景天與雙蒸水按100 g∶1 000 mL的比例置于燒杯中，浸泡1 h，隨即煮沸，煎制30 min，用紗布過(guò)濾，取濾液，剩下的濾渣繼續(xù)加雙蒸水，與雙蒸水的比例為100 g∶800 mL，煎制的時(shí)間為煮沸后40 min，用紗布過(guò)濾，取濾液，將其與第1次的濾液混合，將得到的濾液經(jīng)過(guò)冷凍干燥機(jī)除去水分，即得水煎劑粗提干粉51 g。

1.2實(shí)驗(yàn)飼料

以豆粕、菜粕、棉粕為蛋白源，玉米油和大豆油為脂肪源，面粉為糖源制作基礎(chǔ)飼料(表1)，在基礎(chǔ)飼料中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%(NC)、0.1%(NP 0.1)、0.2%(NP 0.2)、0.4%(NP 0.4)的高山紅景天水煎劑粗提干粉。按表1的配比將以上原料粉碎過(guò)60目篩，準(zhǔn)確稱量后逐級(jí)混勻，加適量水用絞肉機(jī)加工成直徑2.0 mm條狀，電風(fēng)扇吹干后，破碎成長(zhǎng)約4.0 mm圓柱形顆粒料，于-20 ℃冰柜中保存。

表1　基礎(chǔ)飼料配方及其常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分組成Tab.1　Formulation and proximate analysis of the basal diet

注：1.維生素預(yù)混料由下列成分組成(mg/kg飼料)：鹽酸硫胺素，5；核黃素，20；泛酸鈣，10；煙酸，120；生物素，0.1；VB6，10；葉酸，1；肌醇，400；L-維生素C-2-磷酸鎂，120； α-維生素E醋酸酯，60；VK3，5；視黃醇醋酸酯，5 000(IU)和VD3，2 000(IU)。

2.礦物鹽預(yù)混料由下列成分組成(mg/kg飼料)：乳酸鈣，6 540；硫酸亞鐵，42.5；硫酸鎂，1 340；磷酸二氫鈉，1 744；氯化鈉，870；氯化鋁，3；碘酸鉀，2.5；氯化鉀，1 500；氯化銅，2；硫酸錳，16；氯化鈷，20;硫酸鋅，60。

1.3實(shí)驗(yàn)魚與實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)魚由廣西羅非魚國(guó)家級(jí)育種實(shí)驗(yàn)場(chǎng)提供，在長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所的室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中馴養(yǎng)，投喂基礎(chǔ)飼料。馴養(yǎng)2周后挑選體格健壯、大小均勻的吉富羅非魚(初始平均體質(zhì)量為21.0 g±0.5 g)，隨機(jī)分配于12個(gè)500 L桶中，每桶30尾，隨機(jī)分成4個(gè)組，每組3個(gè)重復(fù)，分別投喂4組實(shí)驗(yàn)飼料。每天分3次投喂(8：30，12：30，16：30)，表觀飽食投喂，養(yǎng)殖周期為54 d。每日11：00進(jìn)行一次系統(tǒng)反沖洗，每3 d換水1次(換水量占總體積約1/3)、觀察記錄水溫、實(shí)驗(yàn)魚攝食及死亡情況。養(yǎng)殖前兩周通過(guò)循環(huán)水加熱系統(tǒng)控制水溫在30 ℃，隨后使用制冷機(jī)將水溫從30 ℃降至10 ℃，每2 d降低1 ℃，降溫期間保持正常投喂。養(yǎng)殖期間水體pH 7.2～7.5，溶解氧高于5.0 mg/L、總氨氮低于0.5 mg/L。

1.4樣品采集、測(cè)定與計(jì)算

在水溫為30、25、20、15和10 ℃時(shí)進(jìn)行采樣，并在30 ℃和10 ℃時(shí)測(cè)定每個(gè)桶的實(shí)驗(yàn)魚總重量并記錄尾數(shù)。從每個(gè)桶隨機(jī)取3尾魚，測(cè)量其體長(zhǎng)、體質(zhì)量；從尾靜脈采血后進(jìn)行解剖，在冰盤上迅速分離內(nèi)臟和肝臟，并稱重，計(jì)算肝體比；肝臟樣品置-40 ℃冰箱中保存?zhèn)錅y(cè)肝臟谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)水平。血液在4 ℃靜置2 h后，3 000 r/min離心15 min，取上清液(血清)用于血糖(Glu)、一氧化氮(NO)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量的檢測(cè)。

相關(guān)計(jì)算公式如下：

成活率=100%×Nt/N0

增重率=100%×(FBW-IBW)/IBW

肝體比=100%×HW/W

臟體比=100%×VW/W

式中，Nt為終末尾數(shù)，N0為初始尾數(shù)，IBW為初始體質(zhì)量(g)，F(xiàn)BW為終末體質(zhì)量(g)，W為魚體質(zhì)量(g)，HW為肝臟質(zhì)量(g)，VW為內(nèi)臟質(zhì)量(g)。

采用Sysmex全自動(dòng)生化分析儀(Chemix-800)測(cè)定血清中Glu、HDL-C含量；采用碧云天生物技術(shù)有限公司測(cè)試盒測(cè)定血清中的NO含量；采用南京建成生物技術(shù)有限公司測(cè)試盒測(cè)定肝臟GSH-Px和SOD活性及MDA含量。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件中One Way ANOVA方差分析和Duncan氏多重比較法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著水平為P<0.05。

2　結(jié)果

2.1高山紅景天對(duì)低溫脅迫下的吉富羅非魚生長(zhǎng)性能和成活率的影響

在養(yǎng)殖過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，20 ℃時(shí)，對(duì)照組攝食量開(kāi)始減少，至16 ℃時(shí)基本停止進(jìn)食；添加組攝食量于18 ℃時(shí)開(kāi)始減少，15 ℃時(shí)停止攝食。由表2可知，在溫度為10 ℃時(shí)，添加組的成活率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，添加組的增重率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，并隨著添加水平的提高而提高。在水溫為10 ℃時(shí)，添加0.1%和0.4%組的肝體比顯著大于對(duì)照組(P<0.05)(表3)，而添加0.2%組的肝體比與對(duì)照組無(wú)顯著差異。

2.2高山紅景天對(duì)低溫脅迫下的吉富羅非魚血液生理生化指標(biāo)的影響

隨著溫度的下降，血清中HDL-C，NO和Glu的濃度均呈現(xiàn)出先下降后回升的趨勢(shì)(圖1，圖2，圖3)；在水溫為30 ℃時(shí)，添加0.4%高山紅景天粗提干粉組血清中Glu和NO的濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；在10 ℃時(shí)，對(duì)照組的HDL-C，NO，Glu的濃度顯著高于添加組(P<0.05)，并且添加0.2%組NO濃度顯著低于其它兩個(gè)添加組(P<0.05)。

2.3高山紅景天對(duì)低溫脅迫下的吉富羅非魚抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

水溫為30 ℃時(shí)，對(duì)照組肝臟中SOD的酶活力顯著高于各添加組(P<0.05，圖4)，而在10 ℃時(shí)顯著低于添加組(P<0.05)；隨著溫度的下降，對(duì)照組肝臟中MDA的濃度均顯著高于添加組(P<0.05，圖5)，GSH-Px的酶活力均顯著低于添加組(P<0.05，圖6)。

表2　高山紅景天對(duì)低溫脅迫下的吉富羅非魚成活率和增重率的影響Tab.2　Effect of R.sachaliensis on the survive rate and weight gain rate of GIFT tilapia under low temperature stress

注：同行各數(shù)據(jù)肩標(biāo)中有一個(gè)相同小寫字母者表示差異不顯著(P>0.05，Duncan's法)。表3同。

表3　高山紅景天對(duì)低溫脅迫的吉富羅非魚肝體比的影響Tab.3　Effect of R.sachaliensis on the hepatosomatic of GIFT tilapia under low temperature stress

圖1　添加不同濃度的高山紅景天后血清中 HDL-C濃度的變化Fig.1　Effect of R.sachaliensis on HDL-C level of GIFT tilapia

注： a，b，c，d表示相同水溫下各添加組具有顯著性差異(P<0.05)；A，B，C，D，E表示相同添加量在不同水溫下具有顯著性差異(P<0.05)。圖2-圖6同。

圖2　添加不同濃度的高山紅景天后血清中NO濃度的變化Fig.2　Effect of R.sachaliensis on NO level of GIFT tilapia

圖3　添加不同濃度的高山紅景天后血清中Glu含量的變化Fig.3　Effect of R.sachaliensis on blood glucosel level of GIFT tilapia

圖4　添加不同濃度的高山紅景天后 肝臟中SOD濃度的變化Fig.4　Effect of R.sachaliensis on SOD level of GIFT tilapia

圖5　添加不同濃度的高山紅景天后 肝臟中MDA含量的變化Fig.5　Effect of R.sachaliensis on MDA level of GIFT tilapia

圖6　添加不同濃度的高山紅景天后 肝臟中GSH-Px含量的變化Fig.6　Effect of R.sachaliensis on GSH-Px level of GIFT tilapia

3　討論

3.1高山紅景天粗提干粉的主要活性成分

高山紅景天的活性成分主要是紅景天苷、苷元酪醇、紅景天多糖等，還有一部分脂肪、甾醇、酚類化合物、有機(jī)酸以及多種氨基酸[2]。對(duì)本實(shí)驗(yàn)中添加的高山紅景天水煎劑粗提干粉進(jìn)行成分分析，發(fā)現(xiàn)紅景天苷含量最高，紅景天多糖含量次之，故推測(cè)在本實(shí)驗(yàn)中起主要作用的可能是紅景天苷和紅景天多糖。

3.2添加高山紅景天對(duì)低溫脅迫下的吉富羅非魚生長(zhǎng)性能的影響

溫度作為一個(gè)重要的環(huán)境因子，對(duì)魚類的生長(zhǎng)發(fā)育起著十分重要的作用，低溫會(huì)降低金錢魚幼魚[9]和大黃魚[10]的成活率，使其攝食量減少，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與以上文獻(xiàn)報(bào)道一致。本實(shí)驗(yàn)添加組的成活率顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明高山紅景天能顯著提高低溫脅迫的吉富羅非魚的成活率，降低其最低攝食溫度，在吉富羅非魚應(yīng)對(duì)低溫脅迫時(shí)起到積極作用。

有研究表明，紅景天素能夠抑制紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[11]和D-半乳糖胺誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性[12]，表現(xiàn)出保護(hù)肝臟的功能。本研究中，在水溫為10 ℃時(shí)，添加組肝體比顯著高于對(duì)照組，可能是由于高山紅景天中的紅景天素具有保護(hù)肝臟的作用，減緩了肝臟的萎縮，此結(jié)果與Nan 等[13]用紅景天提取粉處理肝損傷大鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3.3添加高山紅景天對(duì)低溫脅迫狀態(tài)下的吉富羅非魚生理生化相關(guān)指標(biāo)的影響

魚類在受到低溫脅迫時(shí)，血糖和血脂的濃度會(huì)發(fā)生變化。隨著溫度的下降，魚體耗能降低，血糖濃度也降低，當(dāng)溫度處于吉富羅非魚的致死溫度范圍[8]時(shí)，在應(yīng)激作用下，血糖濃度升高[14]。 Hsieh等[15]用低溫處理遮目魚(Chanoschanos)，發(fā)現(xiàn)其血清中Glu水平呈現(xiàn)出先下降后緩慢回升至初始水平的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)中各實(shí)驗(yàn)組血清中Glu的濃度隨著溫度的下降呈現(xiàn)出先下降后緩慢回升至初始水平的趨勢(shì)，與以上文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類似。此外，本實(shí)驗(yàn)中，水溫為10 ℃時(shí)，各添加組的血糖濃度均顯著低于對(duì)照組，可能是由于紅景天能夠減緩肝臟受到的氧化損傷，維持了羅非魚在低溫脅迫下的正常生理功能[16]。低溫不僅影響魚體的糖類代謝，還影響了脂質(zhì)代謝，導(dǎo)致血清中HDL-C濃度升高[17]。本研究中，血清HDL-C的濃度隨溫度的下降而顯著升高，這是由于在溫度降低時(shí)，生物體會(huì)通過(guò)提高體內(nèi)不飽和脂肪酸的濃度，改變細(xì)胞膜的膜脂結(jié)構(gòu)，從而對(duì)低溫進(jìn)行適應(yīng)[18-20]。此外，在水溫為10 ℃時(shí)，添加組HDL-C濃度低于對(duì)照組，推測(cè)可能是由于高山紅景天減弱了皮質(zhì)醇應(yīng)激性升高的幅度，避免了HDL-C的過(guò)量升高。

NO是一種能介導(dǎo)多種生化反應(yīng)的生物信息分子，當(dāng)其過(guò)量時(shí)，可介導(dǎo)細(xì)胞毒作用，與體內(nèi)活性氧反應(yīng)生成過(guò)氧亞硝酸鹽，對(duì)機(jī)體造成損傷[21]；還可誘發(fā)體內(nèi)一系列脂質(zhì)氧化連鎖反應(yīng)，造成生物膜的損傷[22]。在長(zhǎng)期的低溫脅迫下，雛雞下丘腦中NO濃度會(huì)升高[23]。高山紅景天中的紅景天苷具有清除氧自由基的功能，可抑制血清中NO濃度的升高[24]，導(dǎo)致在水溫為10 ℃時(shí)，本實(shí)驗(yàn)中添加組NO濃度顯著低于對(duì)照組，從而減少細(xì)胞毒作用的產(chǎn)生，使機(jī)體抗病力上升，添加0.2%高山紅景天粗提干粉組的效果略優(yōu)于其它添加組。

在低溫脅迫狀態(tài)下，魚體肝臟的抗氧化功能也會(huì)發(fā)生改變，誘發(fā)氧化脅迫，導(dǎo)致體內(nèi)自由基增多，造成損傷[25]。SOD可以清除自由基，減少脂質(zhì)過(guò)氧化損傷[26]。MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化物的主要分解產(chǎn)物，可造成蛋白質(zhì)和酶類失活，降低細(xì)胞膜流動(dòng)性，對(duì)機(jī)體造成損傷[27]。紅景天苷能夠提高機(jī)體抗氧化水平，降低肝臟MDA濃度[28]。高山紅景天醇提物(RSAE)能顯著增高低溫脅迫過(guò)程中紅細(xì)胞膜的SOD活性，抑制紅細(xì)胞膜MDA濃度的增加[29]。本實(shí)驗(yàn)中，水溫為10 ℃時(shí)，添加組肝臟中的SOD水平顯著高于對(duì)照組，MDA水平顯著低于對(duì)照組，并且MDA水平隨著添加水平的升高而降低，與石曉峰[30]關(guān)于小鼠的研究結(jié)論一致，證明了高山紅景天具有提高吉富羅非魚抗低溫脅迫能力的作用，并且在本實(shí)驗(yàn)的添加濃度范圍內(nèi)，添加水平越高，效果越明顯。

GSH-Px能與過(guò)氧化氫發(fā)生還原反應(yīng)，清除細(xì)胞內(nèi)的自由基，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整，進(jìn)而使機(jī)體免受損傷。有研究表明，在低溫脅迫狀態(tài)下，小鼠腦和小腸中的GSH-Px活性會(huì)降低[31]。本實(shí)驗(yàn)中，水溫為10 ℃時(shí)，添加組肝臟中的GSH-Px活性顯著高于對(duì)照組，并且隨著添加水平的升高而升高。推測(cè)是由于高山紅景天提取物提高了肝臟中GSH-Px的活性，提高了機(jī)體抗自由基的能力，從而提高了機(jī)體低溫耐受性[32]。

4　小結(jié)

在飼料中添加高山紅景天，能提高吉富羅非魚抗低溫能力，提高成活率。

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(責(zé)任編輯：張紅林)

Effects of Rhodiola sachaliensis on improving low-temperature tolerance characteristics of Tilapia (Oreochromis niloticus)

ZHANG Chen1,2,YANG Chang-geng2,WEN Hua2,JIANG Ming1,2,LIU Wei2,YU Li-juan2,TIAN Juan2,WU Fan2

(1.CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China;2.YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuhan430223,China)

An experiment was conducted to study the effect ofRhodiolasachaliensisaqueous extract powder on the tilapia under low-temperature.The fishes were divided into four groups:no additives group(control group,NC),R.sachaliensislow dose group(0.1%),R.sachaliensismid dose group (0.2%) andR.sachaliensishigh dose group (0.4%).And the fishes were fed at 30 ℃ for 2 weeks followed by the experimental temperature dropped from 30 ℃ to 10 ℃ with the rate of 0.5 ℃/d.The survival rate,blood biochemical indexes and antioxidant indexes of the fishes in four groups were determined at 30 ℃,25 ℃,20 ℃,15 ℃ and 10 ℃.The results showed that the survival rates of the all addingR.sachaliensisgroups were significantly higher than that of the control group.At 10 ℃,compared with the control group,high density lipoprotein-cholesterol,glucose,nitric oxide,malonaldehyde content of fishes inR.sachaliensissupplement groups were significantly reduced,meanwhile superoxide dismutase levels and glutathione peroxidase activities in liver of fishes were significantly increased with the increasingR.sachaliensislevel.In conclusion,R.sachaliensiscan play a positive role in resisting low temperature in tilapia.

Oreochromisniloticus;Rhodiolasachalinensis;low temperature stress;additives

2016-03-16；

2016-05-31

國(guó)家自然科學(xué)基金 (31402290);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-49)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201003020)；中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所所長(zhǎng)基金(SZ2012-04)。

張琛(1992-)，女，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)轸~類營(yíng)養(yǎng)與飼料學(xué)。 E-mail:444280354@qq.com

文華。 E-mail:wenhua.hb@163.com

S963.73

A

1000-6907-(2016)05-0075-06