姚德冬，張曉雁，羅靜波，柴　毅

(1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州　434025；2.北京信沃達(dá)海洋科技有限公司(北京海洋館)，北京　100081)

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外源性17-β雌二醇對(duì)養(yǎng)殖中華鱘血液若干生化指標(biāo)的影響

姚德冬1，張曉雁2，羅靜波1，柴毅1

(1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025；2.北京信沃達(dá)海洋科技有限公司(北京海洋館)，北京100081)

通過對(duì)12尾雌性中華鱘(Acipensersinensis)背部肌肉注射不同濃度(0、0.1、0.2、0.4 mg/kg·BW)17-β雌二醇(estradiol)，并在0、60、120和180 d尾部靜脈采血，測(cè)定血清中鈣(Ca2+)、雌二醇(E2)、睪酮(T)、白蛋白(ALB)、卵黃蛋白原(VTG)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)以及膽堿酯酶(CHE)的含量。結(jié)果顯示，注射雌二醇后，Ca2+和VTG含量均先上升后下降，E2和ALP含量不斷上升，T和CHE則含量不斷下降。ALT和ALB含量上下波動(dòng)。此結(jié)果表明，雌二醇對(duì)養(yǎng)殖中華鱘卵巢發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用，但濃度過高會(huì)對(duì)其肝臟造成損傷，0.1 mg/kg·BW是較為適宜的濃度。

17‐β雌二醇；中華鱘(Acipensersinensis)；血液；生化指標(biāo)

外源性雌二醇對(duì)魚類性腺發(fā)育有較大影響。在性腺未分化時(shí)期，外源性雌二醇刺激能夠誘導(dǎo)魚類性腺分化，使其發(fā)育為雌性；在卵黃生成期，雌二醇刺激肝臟合成并分泌卵黃蛋白原，促進(jìn)卵細(xì)胞生長(zhǎng)。但是，外源性雌二醇進(jìn)入魚體后能干擾其內(nèi)分泌系統(tǒng)，如血糖、膽固醇降低，抑制魚體生長(zhǎng)，還可能對(duì)魚體的肝、腎等器官造成損傷[1]。

中華鱘(Acipensersinensis)隸屬于鱘形目(Acipenseriformes)鱘科(Acipenseridae)鱘屬(Acipenser)，是大型溯河洄游產(chǎn)卵魚類。由于長(zhǎng)江涉水工程建設(shè)阻隔其洄游路線以及長(zhǎng)江水域污染加劇等原因，野生中華鱘數(shù)量急劇減少，自然繁殖能力大幅下降，自然種群嚴(yán)重衰退，短時(shí)間內(nèi)種群數(shù)量難以恢復(fù)[2]。全人工繁殖是物種保護(hù)的重要措施之一，但是作為全人工繁殖親本的子一代養(yǎng)殖中華鱘性腺難以發(fā)育到Ⅲ或Ⅳ期，性成熟成為其大規(guī)模全人工繁殖的主要障礙[3]。近年來有關(guān)中華鱘的研究報(bào)道有很多且較為深入[4-6]，但是與性腺發(fā)育相關(guān)的研究較少[7-9]，還需要進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)人工養(yǎng)殖至5齡(性腺發(fā)育至Ⅱ期)的中華鱘背部肌肉注射不同濃度的17-β雌二醇，并對(duì)其部分血液生化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，旨在探索17-β雌二醇對(duì)中華鱘性腺發(fā)育及肝功能的影響，探尋大型化親魚性腺發(fā)育誘導(dǎo)技術(shù)，為中華鱘全人工繁殖技術(shù)提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將實(shí)驗(yàn)魚分為A(0 mg/kg·BW)、B(0.1 mg/kg·BW)、C(0.2 mg/kg·BW)、D(0.4 mg/kg·BW) 4個(gè)組，每組3尾實(shí)驗(yàn)魚。雌二醇先用無水乙醇配制成2 mg/mL 溶液，備用。4組實(shí)驗(yàn)魚分別背部肌肉多點(diǎn)注射不同濃度的17-β雌二醇，每2個(gè)月注射一次，共計(jì)4次。

1.3試驗(yàn)樣本采集及測(cè)定

首次注射17-β雌二醇記為0 d，在0、60、120、180 d用5 mL一次性注射器尾部靜脈采血4 mL，血樣置于4 ℃條件下靜置30 min，再于4 000 r/min離心30 min，取上層血清后，放入干冰中保存帶回實(shí)驗(yàn)室，待測(cè)。

本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定的生化指標(biāo)包括鈣(Calcium,Ca2+)、卵黃蛋白原(Vitellogenin,VTG)、雌二醇(Estradiol,E2)、睪酮(Testosterone,T)、白蛋白(Albumin,ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、膽堿酯酶(Cholinesterase,CHE)。其中Ca2+、ALB、 ALT、ALP、CHE用Beckman全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，VTG用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定，E2和T用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定。

1.4數(shù)據(jù)處理

用Excel和SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。同一注射時(shí)間不同組血液參數(shù)的差異顯著性用方差分析(one-way ANOVA)檢驗(yàn)，用S-N-K法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

基于上述分析，景區(qū)為維護(hù)自身的文明形象，并為其他游客塑造一個(gè)更好的景區(qū)體驗(yàn)氛圍，需要主動(dòng)對(duì)游客的行為進(jìn)行管理，具體的管理思路如下：

2　結(jié)果

2.1中華鱘血清中Ca2+、VTG、E2和T含量變化

如圖1所示，Ca2+、VTG含量先下降后上升，B、C、D 3組血清中Ca2+和VTG含量先上升后下降，在120天達(dá)到最大值。第60和120天，B、C、D 3組中血清中Ca2+含量與A組有顯著差異，C、D 2組與B組有顯著差異，但C組與D組無顯著差異；第180天，C、D 2組與A、B 2組有顯著差異，C組與D組無顯著差異，B組與A組無顯著差異。

A組血清中E2含量先下降后上升，B、C、D 3組不斷上升，180天達(dá)到最大值。第60、120和180天，B、C、D 3組血清中E2含量與A組有顯著差異，且B、C、D 3組之間有顯著差異。

A組血清中T含量略有下降，B、C、D 3組則持續(xù)下降。試驗(yàn)期間B、C、D 3組與A組一直存在顯著差異。第60天，D組與B、C 2組有顯著性差異，B組與C組無顯著差異；第120天，B、C、D 3組之間均存在顯著差異；第180天，C組與D組無顯著差異，但C、D與B組之間有顯著差異。

2.2血清中ALT、ALB、ALP、CHE含量變化

如圖2所示，A、B、C、D 4組血清中ALT含量上下波動(dòng)，變化趨勢(shì)基本一致。第60天，血清中ALT含量下降，B、C、D 3組與A組有顯著差異，且高于A組；第120天和180天，血清ALT含量上升后下降，B組與A組無顯著差異，C、D 2組與A、B組有顯著差異。

A組血清中ALB含量基本穩(wěn)定，B組血清中ALB含量先上升后下降，C、D 2組血清中ALB含量先稍稍下降，恢復(fù)后再次下降。第60天，B、C、D 3組血清中ALB含量與A組有顯著差異，且各組之間有顯著差異；第120天B組與A、C、D 3組均有顯著差異，A、C、D 3組之間無顯著差異；第180天，C、D 2組與A組有顯著差異，C組與D組之間無顯著差異，B組與A組無顯著差異，B組與C、D 2組有顯著差異。

圖1　注射雌二醇后血清中Ca2+、VTG、E2和T含量變化Fig.1　Variations in serum Ca2+,VTG,E2 and T concentrations in A.sinensisinjected with E2 for 0,60,120 and 180 days 圖中有一個(gè)字母相同則表示同一時(shí)間不同組間無顯著性差異(P>0.05)，反之，則有顯著性差異(P<0.05)。下同。

A組血清中ALP含量先上升后下降，B、C、D 3組血清中ALP含量不斷上升。注射雌二醇后，B、C、D 3組血清中ALP含量與A組有顯著差異；第60天和120天， B、C、D 3組之間均有顯著性差異；第180天，C組與D組無顯著差異，C、D 2組與B組有顯著差異。

A組血清中CHE含量先上升后下降，波動(dòng)幅度較小，B、C、D 3組中血清中CHE含量不斷下降。注射雌二醇后，C、D 2組血清中CHE含量與A組出現(xiàn)顯著性差異時(shí)間(第60天)早于B組(第120天)，C、D 2組與B組有顯著差異；第60天和120天，C組與D組有顯著差異，第180天，C組與D組無顯著差異。

3　討論

3.1注射雌二醇對(duì)中華鱘性腺發(fā)育的影響

VTG是含有磷、脂、糖的高分子蛋白，是卵黃蛋白的前體。在雌魚卵巢的卵黃發(fā)生期，除了卵母細(xì)胞自身合成卵黃蛋白原外，卵母細(xì)胞還大量攝取血液中外源性卵黃蛋白原，促進(jìn)卵巢發(fā)育。因此，血清中VTG含量成為判斷雌魚卵巢發(fā)育成熟度的重要指標(biāo)[11]。血清中Ca2+能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育和蛋白吸收，在卵黃生成期血清中Ca2+濃度隨著卵巢發(fā)育時(shí)期的變化而變化[12-13]。雄性瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachelli)在注射17-β雌二醇后，血清中Ca2+含量上升，其原因是卵黃蛋白原是鈣結(jié)合蛋白，合成需要大量的鈣[14]。E2是魚體內(nèi)重要的雌激素，卵黃生成期，血清中E2含量的增加能夠誘導(dǎo)肝臟生成卵黃蛋白原[15]。張濤等[16]對(duì)西伯利亞鱘投喂經(jīng)過雌二醇處理的飼料后，血清中E2含量上升，肝臟中VTG基因被顯著表達(dá)。本次試驗(yàn)對(duì)中華鱘注射17-β雌二醇后，B、C、D 3組前120天血清中E2、VTG、Ca2+含量不斷上升，表明雌二醇對(duì)其卵巢發(fā)育有一定的促進(jìn)作用。張穎等[17]認(rèn)為外源性雌二醇破壞魚體內(nèi)分泌平衡，使得魚體血液內(nèi)E2含量上升，T含量下降。本次試驗(yàn)結(jié)果中中華鱘血清E2和T含量變化與之一致，表明外源性雌二醇對(duì)魚體內(nèi)T生成可能有一定的抑制作用。

圖2　注射雌二醇后血清中ALT、ALB、ALP和CHE的含量變化Fig.2　Variations in serum ALT、ALB、ALP and CHE concentrations in A.sinensisinjected with E2 for 0,60,120 and 180 days

3.2注射雌二醇對(duì)中華鱘肝臟的影響

ALB和CHE主要在肝臟中合成，血清中ALB和CHE含量的變化能夠比較準(zhǔn)確地反映肝臟的合成能力，而ALT和和ALP主要存在于肝臟中，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，血清中ALT和ALP含量上升[18]。本次試驗(yàn)中中華鱘注射17-β雌二醇后，B組血清中ALB含量先上升后下降，C、D 2組血清中ALB含量先下降后恢復(fù)，而后急劇下降；B、C、D 3組血清中CHE含量均不斷下降，B組下降幅度較小。此結(jié)果說明B組中華鱘肝臟的合成功能受雌二醇刺激影響較小，C、D 2組中華鱘肝臟合成功能受到雌二醇刺激后影響較大。在120天后，由于中華鱘體內(nèi)雌二醇不斷積累，嚴(yán)重影響肝臟的合成功能，導(dǎo)致ALB合成受阻，進(jìn)而導(dǎo)致第180天血清中卵黃蛋白原含量降低。同時(shí)，本次試驗(yàn)中，B、C、D 3組血清中ALT含量在一定范圍內(nèi)波動(dòng)，變化趨勢(shì)基本一致，但B、C、D 3組血清中ALP含量不斷上升。在莫桑比克羅非魚(Tilapiamossambica)的研究中發(fā)現(xiàn)其血清中ALP活性升高可能由于石油污染對(duì)肝臟造成了損傷[19]。實(shí)驗(yàn)組血清中ALP的含量變化也表明，雌二醇可能對(duì)中華鱘肝臟造成一定程度的損傷。

劉濤等[8]研究中依據(jù)血清中卵黃蛋白原和卵巢發(fā)育所需其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(蛋白質(zhì)、膽固醇、甘油三脂等)的含量變化，證實(shí)雌二醇能夠促進(jìn)中華鱘卵巢發(fā)育，本次試驗(yàn)主要通過卵黃蛋白原和固醇類激素的含量變化來判斷雌二醇對(duì)中華鱘卵巢發(fā)育的影響，雖然判斷指標(biāo)不同，但與劉濤等的研究結(jié)果一致。劉濤等試驗(yàn)過程中，中華鱘血清中VTG和ALB含量不斷上升，本次試驗(yàn)得出與之不同的結(jié)果，主要是因?yàn)橹腥A鱘肝臟受損，這可能跟雌二醇刺激方式有關(guān)，埋植法與持續(xù)注射法相比，雌二醇釋放緩慢，魚類應(yīng)激反應(yīng)小，也可能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)魚的年齡有關(guān)，不同年齡階段實(shí)驗(yàn)魚的抗應(yīng)激能力不同，劉濤等研究中所用11齡實(shí)驗(yàn)魚比本次試驗(yàn)中5齡實(shí)驗(yàn)魚的抗應(yīng)激能力要強(qiáng)，具體原因有待進(jìn)一步研究。本次試驗(yàn)設(shè)立了不同的雌二醇刺激濃度，將卵巢發(fā)育指標(biāo)與肝臟部分功能指標(biāo)結(jié)合，篩選出外源性雌二醇對(duì)中華鱘適宜的注射濃度，對(duì)完善中華鱘的全人工繁殖技術(shù)和物種保護(hù)具有參考意義。

3.3雌二醇的適宜注射濃度

本次試驗(yàn)結(jié)果表明，外源性17-β雌二醇對(duì)養(yǎng)殖中華鱘卵巢發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用，但是會(huì)對(duì)其肝臟造成損傷。因此，在盡可能不影響中華鱘健康的條件下，0.1 mg/kg·BW是17-β雌二醇較為適宜的注射濃度。Zhang等[20]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)0.5 mg/kg·BW的雌二醇注射濃度使得中華鱘血液紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白含量均減少，對(duì)中華鱘健康產(chǎn)生較大影響，0.1 mg/kg·BW是較為適宜的注射濃度。本次試驗(yàn)17-β雌二醇適宜注射濃度與之一致。

本次試驗(yàn)由于實(shí)驗(yàn)材料珍貴且難以取得，所以實(shí)驗(yàn)樣本較少。今后可以參考本次試驗(yàn)結(jié)果，加大檢測(cè)樣本數(shù)量進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

Effects of exogenous 17-β estradiol on blood biochemical indexes of cultured Acipenser sinensis

YAO De-dong1,ZHANG Xiao-yan2,LUO Jing-bo1,CHAI Yi1

(1.CollegeofAnimalScience,YangtzeUniversity,Jingzhou434025,Hubei,China;2.BeijingXinwodaMarineTechnologyCo.Ltd(BeijingAquarium),Beijing100081,China)

In this study,12 femaleAcipensersinensiswere injected of 17-β estradiol (0,0.1,0.2 and 0.4 mg/kg·BW) in back muscle and blood was collected from the fish tail at 0,60,120 and 180 days.The contents of serum calcium (Ca2+),estradiol (E2),testosterone (T),albumin (ALB),vitellogenin (VTG),alanine aminotransferase (ALT),alkaline phosphatase (ALP) and cholinesterase(CHE) were examined at 0,60,120 and 180 days respectively.Results showed that the concentrations of both Ca2+and VTG increased firstly and then decreased.Both E2and ALP increased continuously,while both T and CHE decreased.The changes of concentrations of both ALT and ALB were fluctuant.Results implied that E2could promote the ovaries of cultured Chinese sturgeon,while high concentrations could result in injury to the liver.

17-β estradiol;Acipensersinensis;blood ；biochemistry indices

2015-11-17；

2016-05-17

香港海洋館保育基金項(xiàng)目(4040000027)。

姚德冬(1989-)，男，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)轸~類生理學(xué)。E-mail:yaodong369@126.com

柴毅(1978-)。E-mail:chaiyi123456@126.com

S917.4

A

1000-6907-(2016)05-0014-05