劉永政，邊 爽，孫立杰，宋佳宇，董 慧，張玉琦，趙靜博，肖佳雷

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

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大豆疫霉病拮抗內(nèi)生真菌的鑒定與篩選

劉永政，邊 爽，孫立杰，宋佳宇，董 慧，張玉琦，趙靜博，肖佳雷*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

[目的]篩選出拮抗致病大豆疫霉的真菌菌株，為深入研發(fā)生物菌劑提供依據(jù)。[方法]采用平板對(duì)峙法測(cè)定40 株野生大豆真菌對(duì)疫霉菌的抑制作用。[結(jié)果]供試的40 株菌株，不同菌株間菌落型態(tài)差異較大。從光滑程度分析，36份菌落表面不光滑，3份表面光滑并顯淺黃色；從菌落顏色分析，正面以白色為主，其次是黃色和粉色；反面則以紫色為主，其次為黑色和綠色；從菌落生長(zhǎng)型態(tài)分析，大多數(shù)菌落呈白色絮狀突起或羊毛狀菌絲；11株野生大豆內(nèi)生真菌的抑菌率變化幅度為62%～81%，80%以上共1株Y4-S(Ⅰ)，75%～80%共2株，70%～75%共3株，其余5株均低于70%。抑菌率從大到小依次為Y4-S(Ⅰ)、Y5-r(Ⅱ)-1、Y6R-15-1、Y1-r-3和Y5R4、Y6S-26、Y5LB、Y5r-12、Y2-5(Ⅱ)、Y2-S、Y5R18-2-1。 [結(jié)論]最強(qiáng)拮抗菌株Y4-S(Ⅰ)、Y5-r(Ⅱ)-1、Y6R-15-1顯微型態(tài)相似，呈枝狀，有隔，初步判斷可能來(lái)源同一屬，具體屬種需要進(jìn)一步判斷。

大豆疫霉??；野生大豆；內(nèi)生真菌；拮抗菌株

大豆疫霉根腐病是嚴(yán)重影響世界大豆生產(chǎn)的毀滅性病害之一[1-2]。該病害危害面積大，毀滅性強(qiáng)，每年使大豆減產(chǎn)10%左右，且嚴(yán)重降低大豆的品質(zhì)[3]。目前，由于大豆疫霉具有很高的小種變異性，單一抗性品種的有效期短，對(duì)大豆疫霉根腐病的危害不能達(dá)到較高的防治效果；化學(xué)防治殺菌劑不能對(duì)所有的小種有效，農(nóng)藥殘留大、污染環(huán)境；各種栽培措施雖可減輕損失但不能完全控制該病害[4]。采用微生物菌劑，研發(fā)生物農(nóng)藥的生物防治則是目前解決大豆疫霉病的重要措施。野生大豆內(nèi)生真菌相對(duì)于栽培大豆附生內(nèi)生真菌具有更穩(wěn)定的生存環(huán)境，具有豐富的抗逆資源，因此，把拮抗性野生大豆內(nèi)生真菌作為生防菌及外源基因載體更易于發(fā)揮作用，創(chuàng)造出新的可利資源[5-6]。鑒于此，筆者選用原生境野生大豆中分離的40株內(nèi)生真菌，采用平板對(duì)峙法進(jìn)行了大豆疫霉病的拮抗內(nèi)生真菌菌株鑒定與篩選，以期為研發(fā)生物菌劑提供重要的內(nèi)生真菌資源。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。 大豆疫霉病菌為生理1號(hào)小種，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供；野生大豆內(nèi)生真菌40株，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生物工程研究室提供，主要分布黑龍江省不同區(qū)、市及縣，菌株名稱及來(lái)源見(jiàn)表1。

1.1.2培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。將土豆去皮切成小塊，用蒸餾水煮沸30 min，經(jīng)紗布過(guò)濾，收集濾液，將稱量好的蔗糖加入，用攪拌器攪拌均勻，加入定量的稀釋好的含有蔗糖的土豆汁，121 ℃、0.1 kPa滅菌20 min。

加富 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯塊 200 g，葡萄糖 10 g，牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，氯化鈉5 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。

1.2方法

1.2.1菌株活化。將得到的內(nèi)生真菌接種到PDA平板培養(yǎng)基上，于26 ℃下培養(yǎng)，24 h后開(kāi)始不斷觀察直到有明顯的菌落形態(tài)，及時(shí)進(jìn)行照片記錄和菌落形態(tài)描述(包括菌落顏色、菌絲形態(tài)等一系列特征)。真菌菌落外觀形態(tài)特征采集采用日本佳能 60D相機(jī)(18～200 mm IS)，技術(shù)參數(shù)為：APS-C規(guī)格數(shù)碼單反，1 800萬(wàn)有效像素，10倍光學(xué)變焦。

1.2.2對(duì)峙試驗(yàn)。采用平板對(duì)峙法檢測(cè)野生大豆內(nèi)生真菌對(duì)病原真菌的拮抗效果。第1步，篩選對(duì)病原真菌有拮抗作用的菌株，挑取內(nèi)生真菌菌絲接種于平板中央，然后將4種不同的致病真菌接種于四周，28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d。觀察有無(wú)拮抗作用。第2步，檢測(cè)具有拮抗作用的內(nèi)生真菌對(duì)病原真菌作用的強(qiáng)弱，挑取病原真菌接種于中央，內(nèi)生真菌接種于兩側(cè)，28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后測(cè)量抑菌圈大小[7]。

表1　野生大豆內(nèi)生真菌名稱及來(lái)源

1.2.3指標(biāo)測(cè)定。

1.2.3.1抑菌圈直徑。在對(duì)峙法中形成明顯抑菌現(xiàn)象后，測(cè)量?jī)删渲行倪B線上病原菌的菌落直徑，求各重復(fù)的平均值，以此評(píng)價(jià)拮抗菌對(duì)各個(gè)被測(cè)菌的抑菌效果。

1.2.3.2拮抗菌株直徑。垂直于大豆內(nèi)生真菌中心連線上的病原菌落直徑，求各重復(fù)的平均值，以此作為對(duì)照病原菌的菌落直徑。

1.2.3.3抑菌率。拮抗真菌對(duì)于病原菌的拮抗程度。抑菌率=(對(duì)照病原菌的菌落直徑-處理病原菌的菌落直徑) /對(duì)照病原菌的菌落直徑[8]。

1.2.4顯微觀察。 將挑選出的具有拮抗效果的內(nèi)生真菌進(jìn)行繼代培養(yǎng)。接種活化的對(duì)應(yīng)內(nèi)生真菌到PDA平板上，26 ℃下培養(yǎng)3～4 d，將滅過(guò)菌的載玻片斜插入到已活化菌株平板的培養(yǎng)基上，26 ℃下培養(yǎng)48 h，讓菌絲自然爬到載玻片上后取出載玻片進(jìn)行顯微觀察。應(yīng)用正立生物顯微鏡Axioskop 2 plus FL(德國(guó)蔡司公司)，在40倍放大倍數(shù)下觀察菌絲形態(tài)。

2　結(jié)果與分析

2.1不同內(nèi)生真菌菌落特征表2統(tǒng)計(jì)分析表明，不同菌株間菌落型態(tài)差異較大。從光滑程度分析，40份材料中有36份菌落表面不光滑，3份表面光滑并顯淺黃色，1份污染；從菌落顏色分析，正面以白色為主，其次為黃、粉色；反面則以紫色為主，其次為黑、綠色；從菌落生長(zhǎng)型態(tài)分析，大多數(shù)菌落呈白色絮狀突起或羊毛狀菌絲。菌株Y2-L(Ⅲ)和y6s-8表面分泌淺黃色蠟狀物質(zhì)，疑是油，具體成分待定。

表2　不同菌株菌落型態(tài)特征統(tǒng)計(jì)

接下表

續(xù)表2

2.2大豆疫霉病拮抗內(nèi)生真菌菌株鑒定與篩選將40株已活化的內(nèi)生真菌分別接種了單對(duì)排布的對(duì)峙培養(yǎng)基，共有11種表現(xiàn)出了對(duì)大豆疫霉的拮抗作用。表3表明，11株野生大豆內(nèi)生真菌的抑菌率變化幅度為62%～81%，80%以上共1株Y4-S(Ⅰ)，75%～80%共2株，70%～75%共3株，其余5株均低于70%。抑菌率從大到小依次為Y4-S(Ⅰ)、Y5-r(Ⅱ)-1、Y6R-15-1、Y1-r-3和Y5R4、Y6S-26、Y5LB、Y5r-12、Y2-5(Ⅱ)、Y2-S、Y5R18-2-1。從來(lái)源地分析，牡丹江寧安縣野生大豆內(nèi)生真菌具有拮抗功能的菌株較多，其次為同江市和遜克縣，進(jìn)一步表明黑龍江省大豆主產(chǎn)區(qū)的野生大豆具有較好的抗大豆疫霉病作用。

2.3拮抗菌株的菌落特征及顯微觀察圖1表明，3株具有拮抗作用野生大豆內(nèi)生真菌不僅來(lái)源地不同，而且來(lái)自于野生大豆的不同器官。Y4-S(Ⅰ)菌株分離器官為葉片，菌落正面不光滑，為淺紫色絨毛狀，反面中央為深紫色，向周圍放射性生長(zhǎng)，顏色逐漸變淺；Y5-r(Ⅱ)-1菌株分離器官根，表面不光滑，菌絲為棉花狀，正面為白色，反面為乳白色；Y6R-15-1分離器官莖，表面不光滑，有白色針狀突起，正面為白色，反面為紫紅色，培養(yǎng)基為紫色。顯微結(jié)構(gòu)分析，3株拮抗內(nèi)生真菌的型態(tài)相似，呈枝狀、有隔，初步判斷可能來(lái)源統(tǒng)一屬，具體屬種需要進(jìn)一步判斷。

表3　拮抗菌株的相關(guān)測(cè)量數(shù)據(jù)

圖1　拮抗菌株型態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)特征(40×)Fig.1　Morphology and microstructure of antagonistic strains(40×)

3　結(jié)論

從不同地區(qū)采集野生大豆根、莖、葉器官，分離獲得內(nèi)生真菌，對(duì)大豆疫霉病進(jìn)行拮抗篩選，篩選出拮抗菌11株，即Y4-S(Ⅰ)、Y5-r(Ⅱ)-1、Y6R-15-1、Y1-r-3和Y5R4、Y6S-26、Y5LB、Y5r-12、Y2-5(Ⅱ)、Y2-S、Y5R18-2-1，菌株間菌落生長(zhǎng)型態(tài)差異較大，而菌株的顯微結(jié)構(gòu)極為相似，可能屬于同一種屬。這些拮抗真菌具有遺傳多樣性，為大豆生產(chǎn)中病害的生物防治提供了新的菌種來(lái)源。

[1] 馬淑梅，邵紅濤，韓新華.黑龍江大豆栽培品種和新品系對(duì)疫霉病抗性評(píng)價(jià)及抗病基因分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29(30)：191-196.

[2] 王偉威，魏崍，丁俊杰，等.大豆品種(系)對(duì)不同疫霉菌生理小種的抗性研究[J].大豆科學(xué)，2014，33(4)：559-562.

[3] 徐鵬飛，姜良宇，李文濱，等．黑龍江省大豆品種對(duì)大豆疫霉根腐病抗性評(píng)價(jià)及抗性基因推導(dǎo)[J]．中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2011，33(5)：521-526．

[4] 王光華，周克琴，張秋英，等.拮抗細(xì)菌BRF-1對(duì)幾種植物病原真菌的抗生效果[J].中國(guó)生物防治，2003，19(2)：73-77.

[5] 張淑珍，徐鵬飛，靳立梅，等． 野生大豆對(duì)大豆疫霉根腐病抗感反應(yīng)及聚類分析[J]．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40(11)：1-6．

[6] 李麗艷，蔣繼志，郭文.致病疫霉拮抗細(xì)菌的篩選及抑菌作用研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(24)：14671-14675.

[7] 高同國(guó)，李術(shù)娜，張冬冬，等.大豆根腐病生防細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌株的篩選、鑒定及生防效果驗(yàn)證[J].大豆科學(xué)，2015，34(4)：661-665.

[8] 謝晶.植物病原菌拮抗微生物的篩選、鑒定及拮抗機(jī)理研究[D].成都：四川大學(xué)，2004.

Identification and Screening of Endophytic Fungi againstPhytophthorasojae

LIU Yong-zheng, BIAN Shuang, SUN Li-jie, XIAO Jia-lei*et al

(College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150030)

[Objective] Screening of antagonistic phytophthora pathogenic fungal strains provide the basis for further research and development of biological agents. [Method] Forty strains of fungus were tested. The inhibitory effect of wild soybean fungi on the wild soybean was determined by the method of plate confrontation. [Result] Among the tested 40 strains colony morphology are quite different from each other. On the analysis of smoothness, there are thirty-six colonies whose surface is not smooth, while three colonies appear smooth and pale yellow; On the analysis of colony colors, the front side is mainly white, followed by yellow and pink while, and the back side is mainly purple, followed by black and green; On the analysis of colony growth pattern, most of the colonies appear white flocculent protrusions or wool like hyphae.The inhibitory rates of 11 strains of wild soybean endophytic fungus are 62%-81%, with one strain of Y4-S (I)more than 80%, two strains in 75%-80%, three strains in 70%-75%, and the remaining five strains are less than 70%.Inhibition rate in descending order is Y4-S(Ⅰ), Y5-r(Ⅱ)-1,Y6R-15-1,Y1-r-3,Y5R4, Y6S-26, Y5LB, Y5r-12, Y2-5(Ⅱ),Y2-S,Y5R18-2-1. [Conclusion] The strongest antagonistic effect of strains are Y4-S (Ⅰ), Y5-r(Ⅱ)-1 and Y6R-15-1.They have similar microscopic form as dendritic, and they have separated. After a preliminary judgment, they may be a genus of unity, but their specific species require further judgment.

Phytophthorasojae; Wild soybean; Endophytic fungi; Antagonistic strains

黑龍江省自然基金項(xiàng)目(C2015008)；黑龍江省哈爾濱市人才專項(xiàng)(2015RQQXJ019)；國(guó)家青年基金項(xiàng)目(31101171)；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新項(xiàng)目SPIT(201610224154)。

劉永政(1994- )，男，黑龍江牡丹江人，本科生，專業(yè)：生物工程。*通訊作者，副研究員，博士，從事作物遺傳育種及高產(chǎn)栽培生理研究。

2016-06-20

S 565.1

A

0517-6611(2016)22-166-03