李煥娟， 張 聰， 郝 潔

(國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心/洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司，河南洛陽(yáng) 471000)

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黃芪甲苷提取方法優(yōu)化

李煥娟， 張 聰， 郝 潔

(國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心/洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司，河南洛陽(yáng) 471000)

[目的]優(yōu)化黃芪藥材中黃芪甲苷提取方法。[方法]采用單因素試驗(yàn)對(duì)提取方式、提取溶劑、提取次數(shù)進(jìn)行考察，采用HPLC-ELSD法測(cè)定黃芪甲苷含量。[結(jié)果]黃芪藥材中黃芪甲苷最優(yōu)提取方法為每次用50倍的50%甲醇加熱回流提取2次，每次1 h。[結(jié)論]該試驗(yàn)所建立的方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，為黃芪飲片及制劑中黃芪甲苷的提取及含量測(cè)定提供參考。

黃芪；黃芪甲苷；提取方法；優(yōu)化

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根[1]。黃芪甲苷是黃芪藥材及其制劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪藥材中以原形形式存在的黃芪甲苷含量很低，在對(duì)其進(jìn)行制劑研究時(shí)，以黃芪甲苷為母核的皂苷類成分極易轉(zhuǎn)化成黃芪甲苷[3]。另外，由于藥材的處理方法不同，所測(cè)得的黃芪甲苷含量也有很大的不同?！吨袊?guó)藥典》2010年版所用樣品前處理方法耗時(shí)較長(zhǎng)，測(cè)得含量偏低[4]。一些學(xué)者對(duì)黃芪中黃芪甲苷的提取方法進(jìn)行了研究，但結(jié)果仍不太理想[5-7]。該研究采用單因素試驗(yàn)對(duì)提取方式、提取溶劑、提取次數(shù)進(jìn)行考察，優(yōu)化黃芪藥材中黃芪甲苷提取方法，并采用HPLC-ELSD法測(cè)定黃芪甲苷含量，為黃芪藥材及制劑中黃芪甲苷的檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

1　 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器。Waters高效液相色譜儀(型號(hào)Alliance e2695)、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(型號(hào)2424)，美國(guó)沃特世公司；Kromasil 100-5C18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，瑞典NOBEL公司；AB265-S型電子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；HH-WO型智能數(shù)顯多功能水浴鍋、SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵，鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；JK-3200B型超聲清洗器，合肥金尼克機(jī)械制造有限公司；TQ-2000Y型高速多功能粉碎機(jī)，永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司。

1.1.2試藥。3批黃芪飲片，購(gòu)自洛陽(yáng)康鑫中藥飲片有限公司，產(chǎn)地及批號(hào)分別為山西20140421、河北20140912、山西20150416；黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)110781-200613，含量100%)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；正丁醇(AR，批號(hào)20140916)、甲醇(AR，批號(hào)20150605)，天津富宇精細(xì)化學(xué)品有限公司；氨水(AR，批號(hào)20140306)，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；乙腈(色譜純，批號(hào)151124)，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；水為純化水和超純水，自制。

1.2方法

1.2.1對(duì)照品溶液的制備。精密稱取黃芪甲苷10.79 mg，置25 mL量瓶，甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2供試品溶液的制備。

1.2.2.1提取方式考察。

(1)索氏提取。取黃芪中粉約2 g，精密稱定，置索氏提取器中，加100 mL甲醇，加熱回流4 h，提取液減壓回收溶劑至干，殘?jiān)?0 mL水溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次40 mL，棄去洗液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)眠m量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得[1]。

(2)回流提取。取黃芪中粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加100 mL甲醇加熱回流1 h，抽濾，濾渣和濾餅加入100 mL甲醇加熱回流1 h，共提取2次，合并濾液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)?0 mL水溶解，其余步驟同“1.2.2.1”中索氏提取。

(3)超聲提取。取黃芪中粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加100 mL甲醇超聲1 h，抽濾，濾渣和濾餅加入100 mL甲醇超聲1 h，共提取2次，合并濾液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)?0 mL水溶解，其余步驟同“1.2.2.1”中索氏提取。

1.2.2.2提取溶劑考察。取黃芪中粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加100 mL甲醇、100 mL水、100 mL 50%甲醇加熱回流1 h，抽濾，濾渣和濾餅分別加100 mL甲醇、100 mL水、100 mL 50%甲醇加熱回流1 h，共提取2次，合并濾液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)?0 mL水溶解，其余步驟同“1.2.2.1”中索氏提取。

1.2.2.3提取次數(shù)考察。取黃芪中粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加100 mL 50%甲醇，加熱回流1 h，每個(gè)樣品分別共提取1、2、3次，抽濾，分別合并濾液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)?0 mL水溶解，其余步驟同“1.2.2.1”中索氏提取。

1.2.2.4供試品溶液的制備。取黃芪中粉2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加100 mL 最優(yōu)溶劑采用最優(yōu)提取方式提取1 h，抽濾，濾渣和濾餅加入100 mL 最優(yōu)溶劑采用最優(yōu)提取方式提取1 h，共提取最優(yōu)次數(shù)，合并濾液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)?0 mL水溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次40 mL，棄去洗液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)眠m量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3色譜分析條件。色譜柱為Kromasil 100-5C18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，流動(dòng)相為乙腈-水(35∶65)，柱溫30 ℃，Waters 2424 ELSD檢測(cè)條件，增益50 LSU，漂移管溫度60 ℃，氮?dú)鈮毫?5 Psi，霧化器溫度36 ℃。

1.2.4方法學(xué)考察。

1.2.4.1線性關(guān)系的考察。分別精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液3、5、8、10和15 μL注入液相色譜儀，以對(duì)照品峰面積對(duì)數(shù)(y)為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量對(duì)數(shù)(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程。

1.2.4.2 精密度試驗(yàn)。按“1.2.2”方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)得黃芪甲苷峰面積，計(jì)算RSD值，要求該值小于3%。

1.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取“1.2.2”方法制備供試品溶液，于室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)得黃芪甲苷峰面積，計(jì)算RSD值，要求該值小于3%。

1.2.4.4重復(fù)性試驗(yàn)。取同一黃芪中粉2 g，按“1.2.2”方法平行制備供試品溶液6份，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)得黃芪甲苷含量，計(jì)算RSD值，要求該值小于3%。

1.2.4.5加樣回收率試驗(yàn)。取已知含量的同一黃芪中粉1 g，精密稱定，加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液(0.431 6 mg/mL)5 mL，平行6份，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，測(cè)得黃芪甲苷含量，計(jì)算加樣回收率和RSD。

1.2.5樣品含量測(cè)定。取市售3批黃芪藥材樣品，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，按照“1.2.3”色譜分析條件，測(cè)定黃芪甲苷的峰面積，計(jì)算含量。

2　 結(jié)果與分析

2.1供試品溶液的制備方法按“1.2.2.1”方法操作，結(jié)果顯示，索氏提取、回流提取和超聲提取測(cè)得黃芪甲苷含量分別為0.178%、0.180%和0.159%，表明回流提取所得黃芪甲苷含量較高。按“1.2.2.2”方法操作，100 mL甲醇、100 mL水和100 mL 50%甲醇作為溶劑進(jìn)行加熱回流提取，測(cè)得黃芪甲苷含量分別為0.179%、0.203%和0.236%，表明提取溶劑為50%甲醇時(shí)所得黃芪甲苷含量較高。按“1.2.2.3”方法操作，結(jié)果顯示，提取次數(shù)分別為1、2和3次所測(cè)得黃芪甲苷含量分別為0.197%、0.242%和0.235%，表明提取2次即可將黃芪中的黃芪甲苷提取完全。由此可見，黃芪藥材中黃芪甲苷最優(yōu)提取方法為每次用50倍的50%甲醇加熱回流提取2次，每次1 h。

2.2色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)從圖1可以看出，在相同的色譜條件下，供試品與對(duì)照品在相同的保留時(shí)間(7.7 min)出峰，且分離度較大，說明此條件適合該樣品測(cè)定黃芪甲苷。

圖1　供試品溶液(a)和對(duì)照品溶液(b)的HPLC圖譜Fig. 1　HPLC of tested solution (a) and reference solution (b)

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系的考察。以對(duì)照品峰面積對(duì)數(shù)(y)為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量對(duì)數(shù)(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為Y=1.571 9x+5.407 9(r=0.999 5)，表明黃芪甲苷進(jìn)樣量在1.26～6.31 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量對(duì)數(shù)與峰面積對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2精密度試驗(yàn)。按“1.2.4.2”方法操作，計(jì)算得峰面積的RSD為1.3%，表明精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.4.3”方法操作，計(jì)算得峰面積的RSD為2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.4.4”方法操作，計(jì)算得平均含量為0.242%，RSD為2.1%，表明重復(fù)性良好。

2.3.5加樣回收率試驗(yàn)。由表1可見，平均回收率為99.4%，RSD為2.2%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于黃芪藥材中黃芪甲苷的含量測(cè)定。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4樣品含量測(cè)定方法確定并驗(yàn)證后，取市售3批黃芪藥材樣品進(jìn)行藥材中的黃芪甲苷含量測(cè)定。由表2可見，3批黃芪藥材中黃芪甲苷含量分別為0.242%、0.118%和0.209%，其含量均遠(yuǎn)大于《中國(guó)藥典》2010年版中黃芪藥材中的黃芪甲苷含量標(biāo)準(zhǔn)(0.040%)。

表2　3批樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3　小結(jié)

(1)通過對(duì)提取方式、提取溶劑、提取次數(shù)3個(gè)因素進(jìn)行考察，黃芪藥材中黃芪甲苷最優(yōu)提取方法為每次用50倍的50%甲醇加熱回流提取2次，每次1 h。

(2)與《中國(guó)藥典》2010年版相比，改進(jìn)后的方法，簡(jiǎn)化了樣品的制備過程，簡(jiǎn)便、省時(shí)，可作為黃芪藥材及其制劑中黃芪甲苷的檢測(cè)方法。該試驗(yàn)采用的方法測(cè)得黃芪甲苷的含量高于藥典方法，若以此法測(cè)定黃芪中黃芪甲苷的含量，其含量限度的制訂尚待進(jìn)一步深入研究。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010:283-284.

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Improvement in Extraction Method of Astragaloside IV

LI Huan-juan, ZHANG Cong, HAO Jie

(National Research Center for Veterinary Medicine / Luoyang Huizhong Animal Medicine Co. , Ltd., Luoyang, Henan 471000)

[Objective] The aim was to improve the extraction method of astragaloside IV from Astragali Radix. [Method] Three factors including extraction method, extraction solvent and extraction times were studied through single-factor test. HPLC-ELSD method was adopted to analyze the determination results of astragaloside IV. [Result] The best extraction method of astragaloside IV in Astragali Radix was as follows: 50 times of 50% methanol was added, heated reflux extraction was adopted for two times with 1 hours for each extraction. [Conclusion] The improved method is simple, accurate and reproducible, which can supply a reference for extraction and determination of Astragali Radix.

Astragali Radix; Astragaloside IV; Extraction method; Optimization

李煥娟(1989- )，女，河南平頂山人，碩士，從事中藥制劑工藝研究。

2016-06-24

S 567

A

0517-6611(2016)22-125-03