任麗君，郭玉娟，姚　軍，李新霞，陳　堅

(1.昌吉職業(yè)技術(shù)學院，昌吉　831100；2.新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊　830054)

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伊維菌素緩釋注射液的制備工藝及在綿羊體內(nèi)藥代動力學研究

任麗君1，2，郭玉娟2，姚軍2*，李新霞2，陳堅2

(1.昌吉職業(yè)技術(shù)學院，昌吉831100；2.新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊830054)

目的制備伊維菌素緩釋注射液，采用HPLC法測定綿羊血漿中伊維菌素的質(zhì)量濃度并進行藥代動力學研究。方法(1)以伊維菌素為原料，用質(zhì)量分數(shù)為2%的硬脂酸鋁蓖麻油作為溶劑，制備伊維菌素緩釋注射液。(2)采用HPLC法檢測血漿中伊維菌素的質(zhì)量濃度。色譜柱：ZirchromC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-水(92∶8)；流速：1.0mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測波長：245nm；蘇丹Ⅲ為內(nèi)標。結(jié)果(1)制備得到黃色、澄明油狀的伊維菌素緩釋注射液。(2)伊維菌素質(zhì)量濃度在2.0～20.0 和20.0～200.0ng·mL-1范圍內(nèi)線性良好(r分別為0.997 7和0.999 3)。最低檢測質(zhì)量濃度為1.8ng·mL-1。樣品平均回收率為101.8%。日內(nèi)、日間精密度的RSD值均小于5%。綿羊皮下注射伊維菌素10mg·kg-1后，其主要藥動學參數(shù)：tmax=8.0d，Cmax=82.3ng·mL-1，AUC=3 642ng·d·mL-1，MRT=45.9d。結(jié)論(1)采用生物體較難吸收的蓖麻油作為溶劑，可以起到長期緩釋的目的，緩釋作用達4個月。(2)HPLC法簡單、準確、可靠，適用于伊維菌素的血藥質(zhì)量濃度分析及藥代動力學研究。

伊維菌素緩釋注射液；血藥質(zhì)量濃度；藥代動力學；高效液相色譜法

伊維菌素(ivermectin，IVM)是一種十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，為白色結(jié)晶性粉末，無味，性質(zhì)穩(wěn)定。Merck公司采用Wilkinson′s均相催化還原法將阿維菌素(avermecti-n，AVM)B1氫化，使碳的22位與23位的雙鍵變?yōu)閱捂I，合成22，23-二氫AVMB1，即伊維菌素(Ivermectins，IVM)，見圖1。和阿維菌素相比，伊維菌素在低濃度時即可發(fā)揮藥效，殺滅動物體內(nèi)、體表的寄生蟲，且伊維菌素的毒性和不良反應較低，高效、廣譜、對環(huán)境影響小，在防治全球性畜禽寄生蟲方面發(fā)揮著重要的作用[1-2]。

1985年P(guān)opeDG等[3]采用滲透泵技術(shù)研制出伊維菌素緩釋劑，用于防治牛的腸道線蟲和外寄生蟲感染，緩釋效果可達35d左右。1998年ForbesAB等[4]采用Lady的專利技術(shù)研制出緩釋作用長達100d左右的伊維菌素緩釋巨丸劑。該緩釋巨丸劑能有效治療羊體外癢螨(psoroptesovis)的感染，治療后羊的體質(zhì)量和皮毛有極大改善。張艷偉等[5]采用空心多孔納米ZrO2載體材料進行了阿維菌素緩釋劑的制備。這些制劑雖然達到了長效、緩釋的目的，但仍存在制造工藝復雜及給藥不便等問題。新疆牧區(qū)牲畜數(shù)量多、放牧存在轉(zhuǎn)場及偏遠分散等特點，因此給藥方便、生產(chǎn)工藝可行和緩釋時間長的伊維菌素緩釋劑的研制成為一項迫切的任務。

圖1伊維菌素的結(jié)構(gòu)式

Fig.1StructureofIVM

本課題組前期進行了中性油凝膠伊維菌素緩釋劑的研究，但緩釋時間有限[6-7]。本實驗制備新型的硬脂酸鋁蓖麻油伊維菌素緩釋注射液，緩釋時間長，1次給藥即可防治寄生蟲3～4個月，采用反相高效液相色譜法進行了伊維菌素緩釋注射液在綿羊體內(nèi)的藥代動力學研究。

1　儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(SCM1000，P2000，UV100，美國熱電集團)；ZirchromC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm,美國ZirChromSeparations公司)；高速臺式離心機(長沙市鑫奧儀器儀表有限公司)；旋渦混合器(上海喬躍電子有限公司)；微量移液器(鄭州澤銘科技有限公司)。

1.2試藥伊維菌素原料藥，伊維菌素對照品(質(zhì)量分數(shù)均為95%，河北恩威有限公司)；蓖麻油(分析純，天津市博迪化工有限公司)；乙酸乙酯(分析純，天津市化學試劑一廠)；單硬脂酸鋁(分析純，天津市河北區(qū)海晶精細化工廠)；蘇丹Ⅲ內(nèi)標(分析純，北京化工廠)；甲醇為色譜純；水為高純水。

2　方法與結(jié)果

2.1伊維菌素緩釋注射液的制備

2.1.1配方伊維菌素：50.0g；乙酸乙酯：85.0mL；質(zhì)量分數(shù)為2%的硬脂酸鋁蓖麻油油膠：適量。

2.1.2伊維菌素緩釋注射液的制備工藝

2.1.2.1硬脂酸鋁蓖麻油油膠制備取適量蓖麻油放入容器中，加熱至50 ℃，稱取適量單硬脂酸鋁置于蓖麻油中，用玻璃棒進行攪拌，直至成白色均勻糊狀，溶脹2～4h，繼續(xù)邊攪拌邊加熱至120～125 ℃，至樣品完全透明，停止加熱，樣品放冷至約50 ℃，采用垂熔漏斗進行抽濾，得質(zhì)量分數(shù)為2%的硬脂酸鋁蓖麻油膠A液，顏色呈黃色透明油狀。

2.1.2.2伊維菌素乙酸乙酯溶液的制備按照2.1.1項下配方稱取伊維菌素原料藥適量，加入相應量的乙酸乙酯，充分振蕩，采用水浴回流溶解，得B液。

2.1.2.3混合與分裝在無菌環(huán)境條件下將A液加入到B液中，攪勻，西林瓶密閉分裝，即得伊維菌素緩釋注射液。

2.2色譜條件色譜柱：ZirchromC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-水(92∶8)；流速：1.0mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測波長：245nm；進樣量：20μL。

2.3溶液的制備對照品溶液：精密稱取伊維菌素對照品0.100 3g，置于100mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，再稀釋成質(zhì)量濃度為4.0mg·mL-1的對照品儲備液，置于4 ℃冰箱中備用。

供試品溶液:同法配制20.0ng·mL-1的蘇丹Ⅲ甲醇溶液，作為內(nèi)標溶液，置于4 ℃冰箱中備用。

2.4血漿樣品的提取分離綿羊靜脈取全血10mL，肝素抗凝，以4 000r·min-1離心20min，精密吸取血漿樣品2.0mL，加內(nèi)標溶液20.0μL，旋渦混合2min，再加入2.0mL乙酸乙酯，渦旋2min，離心10min，轉(zhuǎn)速為12 000r·min-1，取上層有機相。同上操作共3次(乙酸乙酯用量分別為2.0，1.5和1.5mL)，合并上層液，50 ℃水浴，N2流吹干。測定前殘存物加100.0μL甲醇，渦旋2min，以12 000r·min-1離心10min，取上清液過0.22μm微孔濾膜，進樣20.0μL。

2.5專屬性考察該色譜條件下，血漿中的伊維菌素與對照品保留時間一致，血漿樣品中的雜質(zhì)峰及所選內(nèi)標分離良好，峰形好，且樣品峰與雜質(zhì)峰分離度關(guān)于1.5，見圖2。

2.6線性關(guān)系考察取綿羊空白血漿9份，每份2.0mL，精密加入伊維菌素對照品儲備液1.0，2.0，3.0，5.0，10.0，20.0，40.0，75.0和100.0μL，分別加入內(nèi)標溶液20.0μL，渦旋混合2min，加入乙酸乙酯2.0mL，按照2.4項下方法進行操作，伊維菌素的質(zhì)量濃度分別為2.0，4.0，6.0，10.0，20.0，40.0，80.0，150.0和200.0ng·mL-1。分別進樣，進樣量20.0μL，以伊維菌素峰面積與內(nèi)標峰面積之比Y對伊維菌素血漿質(zhì)量濃度X (ng·mL-1)進行線性回歸，在2.0～20.0和20.0～200.0ng·mL-1范圍內(nèi)回歸方程分別為：Y= 0.006 X +0.009 8 (r= 0.997 7)；Y=0.004 9 X+0.030 4 (r=0.999 3)。表明伊維菌素血漿質(zhì)量濃度分別在2.0～20.0和20.0～200.0ng·mL-1范圍呈良好線性關(guān)系。其最低檢測質(zhì)量濃度(S/N=3)可達1.8ng·mL-1。

2.7回收率實驗吸取伊維菌素對照品儲備液5.0，10.0和15.0μL，分別加入本底血漿2.0mL，內(nèi)標溶液20.0μL，渦旋混合2min，加入乙酸乙酯2.0mL，其伊維菌素加入質(zhì)量濃度分別為10.0，20.0和30.0ng·mL-1， 每個質(zhì)量濃度做5份，不加伊維菌素的本底血漿做3份，按照2.4項下方法進行操作，低、中、高回收率(n=5)分別為107%，95.5%和103%；RSD值分別為3.8%，4.4%和2.3%；平均回收率為101.8%。

圖2HPLC圖

A.空白血漿；B.對照品血漿；C.給藥2周后血漿樣品；1.內(nèi)標；2.伊維菌素

Fig.2HPLCchromatograms

A.blankplasma；B.referencesubstanceplasma；C.plasmasampleof2weeksafteradministration；1.internalstandard；2.ivermectin

2.8精密度實驗用空白血漿配制含伊維菌素質(zhì)量濃度為100.0ng·mL-1的標準血樣，按照2.4項下方法進行操作，連續(xù)進樣5次，測定峰面積，RSD值為1.6%。用空白血漿配制含伊維菌素質(zhì)量濃度為100.0ng·mL-1的標準血樣，按照2.4項下方法進行操作，在1d中不同時間點進樣，測得標準血漿的日內(nèi)RSD值為3.2%(n=5)，在5d內(nèi)的日間RSD值為4.5%(n=5)。

2.9藥代動力學參數(shù)測定6只綿羊，體質(zhì)量35～40kg，以10mg·kg-1頸部皮下注射伊維菌素緩釋注射液，分別在給藥1，2，4，8，15，22，29，36，43，50，57，64，71，78，85，92，99，106，113，120和127d后靜脈取血，按照2.4項下方法進行操作，測定血漿藥物質(zhì)量濃度，結(jié)果見圖3。

圖3綿羊皮下注射質(zhì)量濃度為10mg·kg-1的伊維菌素緩釋注射液后平均血藥質(zhì)量濃度-時間曲線

Fig.3Meandrugplasmaconcentration-timecurveaftersingledoseof10mg·kg-1IvermectinSustained-releaseInjectionsinsheep

根據(jù)血藥質(zhì)量濃度-時間曲線圖進行藥動學參數(shù)計算AUC，MRT，Cmax和tmax的使用實測值。藥動學參數(shù)為：tmax=8.0±1.8d，Cmax=82.3±28.9ng·mL-1，AUC=3 642±982ng·d·mL-1，MRT=45.9±5.1d。

3　討論

伊維菌素為脂溶性化合物，極性較小，選擇甲醇-水(92∶8)為流動相，分離度好，伊維菌素峰形較好，內(nèi)標蘇丹Ⅲ與伊維菌素分離較好，靈敏度高，適合于伊維菌素的藥物質(zhì)量濃度檢測。本實驗建立了HPLC-UV法測定綿羊體內(nèi)伊維菌素血藥質(zhì)量濃度的方法，與HPLC熒光法[8]以及酶聯(lián)免疫吸附測定法[9]進行比較，該法的特點是預處理成本低，操作簡單；檢測限達到1.8ng·mL-1；采用內(nèi)標法定量，誤差小，因質(zhì)量濃度范圍跨度大，可分別在2.0～20.0和20.0～200.0ng·mL-1范圍內(nèi)提高測定準確性及靈敏度。

油類溶劑與動物體液不易混合，因此油性注射劑比《中國獸藥典》[10]收載的水性注射劑藥物釋放更加緩慢，可以達到長效的目的。橄欖油、豆油等植物油是常用的注射用油，而本實驗采用動物體不易吸收的蓖麻油作為溶劑，藥物的釋放更緩慢；硬脂酸鋁的加入會使油溶液黏度增加，大大延長藥物在動物體內(nèi)的釋放和擴散過程；乙酸乙酯作為伊維菌素溶劑，同時亦作為藥物促吸收劑。調(diào)節(jié)緩釋劑與促吸收劑兩者的比例，可使制劑達到緩釋3～4個月的要求?！吨袊F藥典》[10]收載的伊維菌素注射液在綿羊體內(nèi)的作用時間為2～7d左右，哈斯蘇榮等[11]測定伊維菌素注射液在細毛綿羊體內(nèi)的藥動學參數(shù)為：tmax=31.20±6.57h， Cmax=67.62±9.067ng·mL-1，AUC=7 125.08±908.52ng·h·mL-1，MRT=113.39±9.00h，與本實驗制備的伊維菌素緩釋注射液的藥動學參數(shù)進行比較，本實驗制備的伊維菌素緩釋注射液較伊維菌素注射液的緩釋作用大大增強。雖然本實驗伊維菌素緩釋注射液在綿羊體內(nèi)的藥動學用房室模型不能準確描述其藥動學特征，但伊維菌素血藥質(zhì)量濃度檢測結(jié)果表明,綿羊皮下注射伊維菌素緩釋注射液可以達到長效緩釋近4個月，給藥方式較為簡便，非常適合作為新疆牧區(qū)牲畜抗寄生蟲藥物的長效制劑。

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Study on preparation and pharmacokinetics of Ivermectin Sustained-release Injections in sheep

REN Lijun1,2，GUO Yujuan2，YAO Jun2*，LI Xinxia2，CHEN Jian2

(1.Changji Professional Technology College，Changji 831100， China；2.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China)

ObjectiveTostudythepreparationprocessofIvermectins(IVM)Sustained-releaseInjections,todevelopanHPLCmethodforthedeterminationofivermectinconcentrationinsheepplasma,andtostudyitspharmacokineticsinsheep.Methods(1)Sustained-releaseInjectionswerepreparedbyusingcastoroilasthesolvent.(2)ThecontentofIVMinIVMSustained-releaseInjectionswasdeterminedbyHPLC-UV.Theplasmasampleswereextractedwithethylacetate.TheanalysisinvolvedaZirchromC18column(250mm×4.6mm，5μm)andmethanol-water(92∶8)asmobilephase.Theflowratewas1.0mL·min-1;thecolumntemperaturewas40 ℃，andtheUVdetectionwavelengthwas245nm.SudanⅢwasusedastheinternalstandard.Results(1)IVMSustained-releaseInjectionswereobtained.(2)Thecalibrationcurvewaslinearovertherangesof2.0-20.0ng·mL-1and20.0-200.0ng·mL-1withcorrelationcoefficientsof0.997 7and0.999 3;thelimitofdetectionwas1.8ng·mL-1;themeanrecoverywas101.8%;theRSDsofintra-dayandinter-daywerelessthan5%;theHPLCmethodofdeterminationofivermectininplasmawasestablished.Aftersingledoseof10mg·kg-1insheep，themainpharmacokineticsparameterswereestimatedtobeasfollows：tmax=8.0d，Cmax=82.3ng·mL-1，AUC= 3 642ng·d·mL-1，MRT=45.9d.Conclusion(1)Byusingthemoredifficultabsorbsolvent,castoroil，along-termsustainedreleasepurposewasachievedwhosesustainedactionwasover4months.(2)HPLCmethodissimple，preciseandreliable，andissuitableforthedeterminationofivermectininplasma.

IvermectinSustained-releaseInjections；drugconcentrationinplasma；pharmacokinetics；HPLC

任麗君，女，碩士，高級講師

姚軍，男，副教授，碩士研究生導師

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.017

R944

A

1004-2407(2016)05-0497-04

2016-03-21)