彭曉明，霍仕霞，竇　勤，閆　明，阿不都熱依木·肉孜，高　莉

(新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所,新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實驗室，烏魯木齊　830049)

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·藥理·

苦豆子對大鼠學(xué)習和記憶的損傷作用

彭曉明，霍仕霞，竇勤，閆明，阿不都熱依木·肉孜，高莉

(新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所,新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實驗室，烏魯木齊830049)

目的 探討苦豆子對大鼠學(xué)習和記憶的影響。方法將48只SD大鼠隨機分為正常組及苦豆子低、中、高劑量組。除正常組外，其余大鼠以80，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子粉連續(xù)灌胃給藥30d。給藥完成后，利用Morris水迷宮、穿梭避暗測試儀和跳臺記錄儀測定大鼠的學(xué)習和記憶能力，化學(xué)比色法測定大鼠腦組織中的AchE活性。結(jié)果與正常組相比，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子可使水迷宮實驗中大鼠的潛伏期顯著延長，穿越平臺的次數(shù)明顯減少(P<0.05或P<0.01)；避暗實驗中大鼠的錯誤次數(shù)明顯增多，潛伏期顯著縮短(P<0.05或P<0.01)；穿梭實驗給藥組大鼠的主動回避反應(yīng)次數(shù)顯著減少，主動回避潛伏期明顯延長(P<0.05或P<0.01)；跳臺實驗給藥組大鼠的下臺潛伏期明顯縮短，錯誤次數(shù)顯著增加(P<0.01)。此外，苦豆子給藥組大鼠腦組織中AchE活性也明顯升高(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論120和160g·kg-1·d-1的苦豆子對大鼠學(xué)習和記憶具有損傷作用。

苦豆子；學(xué)習記憶；損傷

苦豆子(Sophora alopecuroidesL.)是豆科槐屬多年生草本藥用植物，維吾爾語名為布牙，藥用根、莖、全草及種子，主要分布在內(nèi)蒙古、新疆、寧夏、甘肅和青海等干旱荒漠地區(qū)?？喽棺铀幮匀壐珊?，味苦，具有生干生寒、清熱燥濕、止瀉止痢和消炎鎮(zhèn)痛等作用[1]。目前國內(nèi)以苦豆子為原料研制開發(fā)的制劑有克瀉靈片、婦炎栓、苦豆子總堿直腸栓、苦參素注射液、復(fù)方苦豆子口腔潰瘍復(fù)合膜、苦豆子油擦劑和苦豆子乳膏劑等[2-3]。研究表明，苦豆子總生物堿和單體生物堿對實驗動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抑制作用[4]。曹曉東[3]發(fā)現(xiàn)，苦豆子總堿可引起小鼠腦組織神經(jīng)細胞凝固性壞死。本實驗利用不同濃度的苦豆子粉作用于健康大鼠，研究其對大鼠學(xué)習和記憶的影響，為苦豆子的臨床安全用藥提供依據(jù)。

1　儀器與材料

1.1儀器IVC獨立送風隔離籠具(IVC-Ⅱ，蘇州馮氏實驗動物設(shè)備有限公司)；跳臺記錄儀(YLS-3TB，濟南益延科技發(fā)展有限公司)；分析天平(BS224S，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；避暗穿梭測試儀(YLS-17B，北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司)；Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(ZS-001，北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司)。

1.2試藥苦豆子購自于新疆本草堂中藥飲片有限公司，將藥材粉碎，過120目篩。羧甲基纖維素鈉為天津光復(fù)精細化工研究所產(chǎn)品。

1.3動物健康SD大鼠48只，雌雄各半，SPF級，體質(zhì)量180～220g，購自新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物中心。2方法

2.1動物給藥全部大鼠在IVC盒中適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，稱取體質(zhì)量，隨機分成4組，即正常組及苦豆子粉低、中、高劑量組，每組12只。正常組大鼠灌胃40mL·kg-1·d-1質(zhì)量濃度為5g·L-1的CMCNa，給藥組分別給予80，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子粉，連續(xù)給藥30d。

2.2Morris水迷宮實驗第26天，大鼠給藥2h后選取每組6只大鼠進行水迷宮實驗。水迷宮為一黑色圓形水池，直徑120cm，高60cm，水深40cm，水溫25±1 ℃，分為4個象限，其中一象限內(nèi)水面下1.5cm處設(shè)置1個直徑為20cm的平臺。實驗前在水中加入墨汁，避免動物直接發(fā)現(xiàn)平臺。Morris水迷宮實驗分為定位航行和空間搜索兩部分：(1)定位航行實驗：連續(xù)進行4d，每天訓(xùn)練4次。訓(xùn)練時，將大鼠面向池壁從4個入水點分別放入水池，記錄大鼠從入水到找到水下隱蔽平臺并站立于其上所需時間，作為潛伏期(latency)。大鼠找到平臺后，讓其在平臺上站立5s。若入水后90s大鼠未能找到平臺，則將其輕輕從水中拖上平臺，并停留15s，然后進行下一次訓(xùn)練。(2)空間搜索實驗：定位航行實驗結(jié)束后，撤去平臺，從4個入水點放入水中，測其第1次到達原平臺位置的時間(潛伏期)和穿越原平臺的次數(shù)(crossingtimes)。

2.3避暗實驗第25天，給藥2h后選取每組6只大鼠進行避暗實驗。將大鼠背對洞口放入明室，暗室內(nèi)電柵通電。大鼠天生喜暗怕明，其隨后會進入暗室。但會受到暗室電擊而退出，因此而產(chǎn)生暗室有電的短暫記憶。避暗實驗將記錄大鼠第1次進入暗室的時間為潛伏期，以及300s內(nèi)進入暗室遭受電擊的次數(shù)為錯誤次數(shù)，作為學(xué)習成績。24h后重復(fù)測定1次，作為記憶成績。

2.4穿梭實驗第27天，給藥2h后選取每組6只大鼠進行穿梭實驗。大鼠放入一室適應(yīng)2min，實驗測試開始后，蜂鳴聲和燈光信號持續(xù)10s，大鼠如果在10s內(nèi)穿過通道進入二室，記為主動回避反應(yīng)(activeavoidresponse，AV)1次，其所需時間稱為主動回避潛伏期(activeavoidlatency，AVLAT)；大鼠如果在10s內(nèi)不進入暗室，則受到持續(xù)10s的電擊，受到電擊進入對側(cè)則記為被動回避反應(yīng)(passiveescaperesponse，ESC)1次。以此循環(huán)20次，24h后重復(fù)測定。2.5跳臺實驗第29 天，大鼠給藥2h后選取每組6只進行跳臺檢測。將大鼠放入跳臺箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3min，然后立即通以36V2mA的交流電。此時，大鼠為逃避遭受電擊而躍上安全平臺，開始計時并觀察5min內(nèi)受電擊的次數(shù)(即錯誤次數(shù))作為學(xué)習成績。同時記錄計時開始至大鼠走下平臺遭受電擊的時間，作為下臺潛伏期，潛伏期超過300s，則以300s計算。24h后測試其記憶能力：將訓(xùn)練過的大鼠穩(wěn)當?shù)胤庞谔_上，通電并開始計時，記錄開始至大鼠走下平臺的時間(即潛伏期)，以及5min內(nèi)大鼠走下平臺遭受電擊的次數(shù)(即錯誤次數(shù))，作為記憶成績，進行統(tǒng)計學(xué)檢驗[5]。

2.6大鼠腦組織中AchE活性的測定大鼠完成給藥和行為學(xué)檢測后，腹主動脈取血、處死。然后在冰上剝離腦組織并稱定質(zhì)量，加入9倍的生理鹽水，勻漿，以3 500r·min-1離心10min，吸取上清液備用。利用南京建成生物工程研究所的AchE試劑盒和BCA試劑盒測定大鼠腦組織中的AchE活性，具體測定方法為：分別設(shè)置并標記測定管、對照管、標準管(3個)和空白管(3個)。在測定管中加入50μL的待測腦組織勻漿，標準管中加入50μL的1μmol·mL-1標準應(yīng)用液，空白管中加入50μL的雙蒸水，對照管不加。然后在所有管中加入500μL的底物緩沖液和500μL的顯色應(yīng)用液，混勻，37 ℃準確反應(yīng)6min。反應(yīng)完成后，依次在所有管中加入30μL的抑制劑、100μL的透明劑和50μL的穩(wěn)定劑，同時在樣品對照管中加入50μL的待測腦組織勻漿。混勻，室溫放置15min，在全波長酶標儀412nm處測定吸光度值。計算大鼠腦組織中的AchE活性，腦組織AchE活力=(測定A值-對照A值)/(標準A值-空白A值)×對照品濃度÷待測樣本蛋白濃度。

3　結(jié)果

3.1苦豆子對大鼠水迷宮實驗的影響Morris水迷宮實驗中的定位航行實驗主要用于測試大鼠的學(xué)習能力，空間搜索實驗用于檢測大鼠的空間記憶能力，見圖1。由圖1可知，正常組和80g·kg-1·d-1的苦豆子給藥組大鼠在水迷宮中游泳軌跡大多為趨向式，而120和160g·kg-1·d-1的苦豆子給藥組大鼠游泳軌跡則為隨機式，見表1。由表1可知，隨著檢測時間的增加，各組大鼠找到平臺的時間(即潛伏期)逐漸縮短。與正常組相比，苦豆子各給藥組大鼠的潛伏期顯著延長(P<0.05或P<0.01)，穿越平臺的次數(shù)明顯減少(P<0.05或P<0.01)。

表1苦豆子對大鼠在Morris水迷宮中尋臺潛伏期(s)及末次穿臺次數(shù)的影響

注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01。

圖1大鼠在Morris水迷宮中的游泳軌跡圖

A．正常組；B．80g·kg-1·d-1苦豆子；C．120g·kg-1·d-1苦豆子；D．160g·kg-1·d-1苦豆子

Fig.1TheswimmingtrackgraphsofratsinMorriswatermazeA．normalgroup；B．Sophora alopecuroidesL.(80g·kg-1·d-1)；C．Sophora alopecuroidesL.(120g·kg-1·d-1)；D．Sophora alopecuroidesL.(160g·kg-1·d-1)

3.2苦豆子對大鼠避暗實驗的影響避暗實驗是利用動物怕明喜暗的生理特性來檢測動物學(xué)習記憶的方法。動物在進入暗室過程中的錯誤次數(shù)和潛伏期可反映動物的學(xué)習記憶能力。與正常組比較，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子給藥組大鼠的錯誤次數(shù)比正常組明顯增多(P<0.05或P<0.01)，進入暗室的潛伏期也顯著縮短(P<0.05或P<0.01)。見表2。

3.3苦豆子對大鼠穿梭實驗的影響穿梭實驗是一種檢測聯(lián)想記憶的經(jīng)典方法，動物從被動逃避到主動逃避的學(xué)習過程(即主動逃避潛伏期)越短，表明其記憶能力越強。與正常組比較，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子給藥組大鼠主動回避反應(yīng)次數(shù)顯著減少(P<0.05或P<0.01)，且主動回避潛伏期明顯延長(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表2苦豆子對大鼠在避暗測試儀中潛伏期和錯誤次數(shù)的影響

注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01。

表3苦豆子對大鼠在穿梭測試儀中主動回避、被動回避次數(shù)及主動回避潛伏期的影響

注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01。

3.4苦豆子對大鼠跳臺實驗的影響跳臺實驗常用于評價動物被動回避的學(xué)習記憶能力，被測動物的下臺潛伏期縮短或錯誤次數(shù)增加，均可直接反映其記憶能力是否受到損傷。與正常組比較，大鼠經(jīng)苦豆子給藥30d后，其下臺潛伏期明顯縮短(P<0.05或P<0.01)，錯誤次數(shù)顯著增加(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4苦豆子對大鼠在跳臺記錄儀中潛伏期和錯誤次數(shù)的影響

注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01。

3.5苦豆子對大鼠腦組織中AchE活性的影響AchE(乙酰膽堿酯酶)是神經(jīng)遞質(zhì)Ach(乙酰膽堿)的水解酶，其活力可間接反映Ach含量及膽堿能神經(jīng)功能的情況。與正常組相比，苦豆子各給藥組大鼠腦組織AchE活性均顯著提高(P<0.05或P<0.01)。見表5。

表5苦豆子對大鼠腦AchE活性的影響

注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01。

4　討論

苦豆子在我國尤其是西北地區(qū)產(chǎn)量大，分布極廣，資源豐富，是一種重要的植物資源?？喽棺踊瘜W(xué)成分主要以生物堿為主，其地上部分含生物堿6.1%～8.03%，種子約含生物堿8.11%[6]。目前，從苦豆子中已分離鑒定的生物堿主要有苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、槐定堿和苦豆堿等20多種[7]。研究發(fā)現(xiàn)，苦豆子生物堿在抗腫瘤、抗菌、抗心律失常、抗乙肝和免疫等方面具有重要的藥理活性和應(yīng)用前景。但由于苦豆子全草有毒，人口服15粒以上種子即出現(xiàn)頭暈、嘔吐、煩躁和心悸等不適反應(yīng)，且苦豆子中的氧化槐定堿和氧化苦參堿均具有中樞抑制作用，因此苦豆子對機體神經(jīng)系統(tǒng)的影響值得關(guān)注。神經(jīng)系統(tǒng)與機體其它器官系統(tǒng)聯(lián)系廣泛，且反應(yīng)迅速，其與藥物接觸后，神經(jīng)系統(tǒng)受損的表現(xiàn)會較早出現(xiàn)，因此神經(jīng)毒性的評價對于藥物早期毒性發(fā)現(xiàn)、保障藥物安全應(yīng)用有著非常重要的意義[8]。神經(jīng)行為可以在整體、動態(tài)和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的內(nèi)涵下，關(guān)注藥物對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷評估與預(yù)測，并可以此為指征確定毒性藥物的閾劑量。

本實驗利用80，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子粉連續(xù)30d灌胃大鼠，與正常組大鼠比較，水迷宮實驗給藥組大鼠的潛伏期顯著延長，穿越平臺的次數(shù)明顯減少；避暗實驗給藥組大鼠的錯誤次數(shù)明顯增多，潛伏期顯著縮短；穿梭實驗給藥組大鼠的主動回避反應(yīng)次數(shù)顯著減少，主動回避潛伏期明顯延長；跳臺實驗給藥組大鼠的下臺潛伏期明顯縮短，錯誤次數(shù)顯著增加。此外，苦豆子給藥組大鼠腦組織中的AchE活性均顯著提高。乙酰膽堿(Ach)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)之一，與學(xué)習記憶密切相關(guān)。AchE是Ach的水解酶，其活力可間接反映Ach的含量及膽堿能神經(jīng)功能的情況。綜上所述，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子對大鼠的學(xué)習和記憶具有損傷作用，可能與提高AchE活性、加速Ach的降解有關(guān)。

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The damage effect of Sophora alopecuroides L.on learning and memory of rats

PENG Xiaoming，HUO Shixia，DOU Qin，YAN Ming，Abduriyim ROZI，GAO Li*

(InstituteofXinjiangTraditionalUyghurMedicine，PrescriptionLaboratoryofXinjiangTraditionalUyghurMedicine，Urumqi830049，China)

ObjectiveToinvestigatetheeffectofSophora alopecuroidesL.onlearningandmemoryofrats.Methods48SDratswererandomlyassignedintocontrolgroupandSophora alopecuroidesL.group.Exceptfornormalgroup，ratsweretreatedbydifferentconcentrations(80，120and160g·kg-1·d-1)ofSophora alopecuroidesL.for30days.ThelearningandmemoryofratsweredetectedbyMorriswatermaze，shuttlebox，stepthroughtestandstep-downtest，andtheactivityofAchEinbrainofratswasmeasuredbychemicalcolorimetry.ResultsComparedwithnormalgroup，120and160g·kg-1·d-1ofSophora alopecuroidesL.couldprolongthelatencyanddecreasethecrossingtimesofratsinMorriswatermaze(P<0.05orP<0.01)，anditalsodecreasedtherat’slatencyofenteringdarkcabinandthenumberofactiveavoidresponseinshuttleboxandstepthroughtest(P<0.05orP<0.01).Moreover，Sophora alopecuroidesL.couldincreaseerrortimesofratsinstep-downtest(P<0.01)andtheactivityofAchEinbrain(P<0.05orP<0.01).Conclusion120and160g·kg-1·d-1ofSophora alopecuroidesL.havesignificantlydamageeffectsonlearningandmemoryofrats.

Sophora alopecuroidesL.；learningandmemory；damage

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項目(編號：201491174);新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基金項目(編號：KY2015140)

彭曉明，男，碩士，副研究員

高莉，女，副研究員

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.011

R965

A

1004-2407(2016)05-0474-04

2015-12-10)